陳秀峰，張碧文，李 佳，沈中衛(wèi)

(無錫市第二中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214121)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以胃黏膜上皮和腺體萎縮、黏膜變薄、黏膜肌層增厚并伴有腸上皮化生、不典型增生為特征的慢性炎癥性疾病[1]，國內(nèi)報道其發(fā)病率為18.89～36.39%[2-4]。CAG與胃癌、特別是腸型胃癌的發(fā)生關(guān)系密切，其病理過程經(jīng)歷了正常胃黏膜-炎癥-萎縮-腸上皮化生-異型增生-癌等幾個階段[5]。我國CAG的癌變率為1.2%～7.1 %[6]。因此，有效的治療和控制CAG被認為是胃癌早期預防的重點。全國著名中醫(yī)學家，南京中醫(yī)藥大學王燦暉教授從事中醫(yī)臨床、科研、教學工作60余載，學術(shù)造詣精深，臨證經(jīng)驗豐富，在辨治CAG方面具有豐富經(jīng)驗。陳瑩瑩等[7]對王燦暉教授診治的114例CAG病例分析發(fā)現(xiàn)脾胃虛弱證為常見證型之一，又將王燦暉教授診治的124例CAG病例分析發(fā)現(xiàn)健脾益胃湯為最常用方之一[8]。本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法對健脾益胃湯治療脾胃虛弱型慢性萎縮性胃炎的作用進行分析，預測其潛在作用機制，為今后新藥研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 健脾益胃湯主要成分的篩選及作用靶點預測 將健脾益胃湯藥物名稱(太子參、白術(shù)、茯苓、石斛、山藥、枳殼、厚樸、黃芩、仙鶴草、白花蛇舌草、莪術(shù))輸入計算系統(tǒng)生物學實驗室(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，使用口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)大于等于30%和藥物相似性(Drug-likeness，DL)大于等于0.2的限制條件篩選以獲得健脾益胃湯所有藥物的主要化學成分。將主要化學成分的“PubChen CId”輸入到PubChen數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，得到化學成分的“Canonical SMILES”信息，然后將其成分的“Canonical SMILES”信息輸入到SwissTarget Prediction平臺(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，物種選擇“人類(Homo Sapiens)”，預測健脾益胃湯化學成分的靶點。若主要化學成分無“PubChen CId”，則將TCMSP數(shù)據(jù)庫中的“Related targets”中的靶蛋白導入UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)，得到其靶點，最后綜合兩者，去除重復，即可得到健脾益胃湯的潛在作用靶點信息。

1.2 檢索慢性萎縮性胃炎的疾病靶點 使用人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM：http：//www.omim.org/)、Gene cards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)2個疾病靶點數(shù)據(jù)庫，以檢索詞“chronic atrophic gastritis”進行檢索，收集獲得與慢性萎縮性胃炎相關(guān)的疾病靶點，將慢性萎縮性胃炎的靶點與1.1中健脾益胃湯主要成分的靶點進行比對，利用venny軟件取兩者交集，并得到健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用靶點信息。

1.3 制作“藥物-化學成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡圖 利用1.1和1.2的結(jié)果，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-化學成分-潛在作用靶點”關(guān)系網(wǎng)絡圖。明確單味藥物有哪些成分、這些成分治療慢性萎縮性胃炎的靶點是什么，初步探討健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機制。

1.4 潛在作用靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡分析 將得到健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的作用靶點導入String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/Version 11.0)。限定研究物種為人類，獲得蛋白互作關(guān)系圖，并將其保存為TSV格式。將該TSV格式文件導入Cytoscape軟件，利用Cytoscape軟件中的“MCODE”功能進行網(wǎng)絡分析，得到健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎蛋白互作最密切的基因集群。

1.5 蛋白互作最密切的基因集群的富集分析 將蛋白互作最密切的基因集群導入Metascape平臺(http：//metascape.org/)的“Step1”，點擊Submit，在“Step2”選項“Input as species”和“Analysis as species”中均選擇“人類(Homo Sapiens)”，在“Step3”中點擊“Express Analysis”進行富集分析，包括KEGG Pathway(KEGG通路)、WikiPathways(Wiki通路)、GO Biological Processes(生物過程富集分析)、Reactome Gene Sets(反應組基因集)等。最后顯示前20個集群的分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 健脾益胃湯化學成分及潛在作用靶點預測 健脾益胃湯化學成分按照OB≥30%，DL≥0.2的條件進行篩選，一共獲得個97個化學成分。其中太子參8個，白術(shù)7個，茯苓15個，石斛15個，山藥15個，枳殼5個，厚樸2個，黃芩15個，仙鶴草5個，白花蛇舌草7個，莪術(shù)3個。去除重復及暫無作用靶點的成分，得到63個潛在化學成分，結(jié)果見(表1)。

表1 健脾益胃湯的63個化學成分信息

這63個化學成分中有50個成分從PubChen數(shù)據(jù)庫中獲取到了“Canonical SMILES”信息，然后將50個成分的“Canonical SMILES”信息輸入到SwissTarget Prediction平臺，物種選擇“人類(Homo Sapiens)”，得到潛在作用靶點6316個。剩余的13個主要成分無“Canonical SMILES”信息的，則提取TCMSP數(shù)據(jù)庫的靶蛋白，共82個，將82個靶蛋白導入UniProt數(shù)據(jù)庫，獲得相應的靶基因。最后綜合兩者，去重后共獲得800個靶點信息。

2.2 慢性萎縮性胃炎的疾病靶點 檢索OMIM、Gene cards數(shù)據(jù)庫，得到CAG的422個靶點。利用venny軟件取兩者交集，得到健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的潛在作用靶點109個，詳見圖1。109個靶點類型數(shù)據(jù)利用 SPSS23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到109個作用靶點類型的頻數(shù)分析結(jié)果，詳見圖2。

圖1 藥物與疾病靶點交集

圖2 靶點類型頻率分析

從圖2可以看出健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎的靶點類型有25種，包含各種酶(酶、激酶、蛋白酶、氧化還原酶、水解酶、連接酶、轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶、裂解酶)、受體(G蛋白偶聯(lián)受體家族、核受體、膜受體、初級活性轉(zhuǎn)運體、家族bg蛋白偶聯(lián)受體、cg蛋白偶聯(lián)受體家族)、蛋白(分泌蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白家族、未分類蛋白)、離子通道(電壓門控離子通道、配體門控電子通道)、轉(zhuǎn)錄因子、電化學轉(zhuǎn)運體、跨膜單電子轉(zhuǎn)移載體、細胞色素P450等。其中Kinase(激酶)、Protease(蛋白酶)、Enzyme(酶)、Unclassified protein(未分類蛋白質(zhì))、Secreted protein(分泌蛋白)、Family A G protein-coupled receptor(G蛋白偶聯(lián)受體家族)、Transcription factor(轉(zhuǎn)錄因子)最多見。

2.3 制作“藥物-化學成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡圖 利用2.1和2.2得到的結(jié)果，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-潛在作用靶點”關(guān)系網(wǎng)絡圖，結(jié)果詳見下圖3。

圖3 “藥物一化學成分一潛在作用靶點”網(wǎng)絡圖

圖3中共涉及197個節(jié)點(nodes)、1214條邊(edges)。圖3中外圓英文代表潛在作用靶點，內(nèi)圓英文代表化學成分，中間中文代表中藥。其中197個節(jié)點(nodes)代表健脾益胃湯的單味藥物種類、化學成分、潛在作用靶點，1214條邊(edges)代表藥物與化學成分、化學成分與潛在作用靶點之間有聯(lián)系，展現(xiàn)健脾益胃湯的單味藥物有哪些化學成分，單一化學成分有哪些潛在作用靶點。圖3結(jié)果顯示β谷甾醇、刺槐素、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、16α-羥基松苓新酸，木犀草素，豆甾醇等7個化學成分均能與30個及以上靶點連接，可被認為是健脾益胃湯的主要化學成分。圖3結(jié)果顯示109個潛在作用靶點中AR、NOS2、ALOX5、MMP2、MMP3、SRC、CYP17A1、、MDM2、PPARg，PTGS2、CYP51A1、TERT、VDR、EGFR、G6PD、MET、MMP9、MMP12、PTPN11、ALK、MAPK1等靶點均與20種及以上成分相連，表明這些靶點在整個網(wǎng)絡中占據(jù)重要的地位，說明這些靶點對健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎具有重要的意義。健脾益胃湯的同一化學成分可作用于不同的靶點，不同的化學成分也可以作用于相同的靶點，體現(xiàn)了其多成分、多靶點的作用特點。

2.4 109個潛在作用靶點蛋白互作網(wǎng)絡分析 將健脾益胃湯治療CAG的109個作用靶點導入String數(shù)據(jù)庫。限定研究物種為人類，獲得蛋白互作關(guān)系圖(詳見下圖4)，并將其保存為TSV文件，將該TSV格式文件導入Cytoscape軟件，進行網(wǎng)絡分析，結(jié)果得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系最密切的基因集群，包含45個節(jié)點(nodes)和816條邊(edges)。這45個節(jié)點(nodes)代表45個靶點，若兩個靶點之間存在相互作用，則用邊(edges)作為連線將兩者連接起來，邊(edges)越多，代表蛋白質(zhì)相互作用越密切。這45個靶點可能對健脾益胃湯治療CAG其關(guān)鍵作用。

圖4 109個靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

2.5 蛋白互作最密切的45個靶點基因的富集分析 將45個靶基因?qū)隡etascape進行富集分析，最后結(jié)果顯示前20個集群，詳見下表2。其中KEGG通路分析包含：癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖通路、腫瘤壞死因子信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑抵抗等通路；Wiki通路有：AGE-RAGE信號通路、光動力療法誘導NF-kB存活信號轉(zhuǎn)導13個靶點、光動力療法誘導AP-1存活信號、NFKB(配體)受體激活劑信號通路；生物過程富集分析有：氧化應激反應、凋亡信號通路、白細胞分化、炎癥反應的調(diào)節(jié)、對氧氣水平的反應、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、對機械刺激的反應、活性氧代謝過程；反應組基因集有：白介素信號等。

表2 45個靶基因的前20個富集分析結(jié)果

3 討論

健脾益胃湯是王燦暉教授治療脾胃虛弱型慢性萎縮性胃炎的經(jīng)驗方。臨床療效顯著，然其療效作用與其組方的中藥傳統(tǒng)功效理論及辨病用藥的藥理作用相關(guān)，但其對慢性萎縮性胃炎的現(xiàn)代藥理學機制沒有得到系統(tǒng)的闡釋。

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選得到健脾益胃湯的63個化學成分，部分成分的有效性也以證實。β谷甾醇具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用[9]，能抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡[10]。刺槐素通過激活Fas通路抑制胃癌AGS細胞增殖并誘導凋亡[11]。豆甾醇有抗炎、抗氧化作用[12]，還可以上調(diào)促凋亡基因BAX蛋白的表達、下調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達、抑制癌細胞的增殖，還能抑制胃癌細胞遷移，誘導細胞周期阻滯在G2 / M期，抑制JAK / STAT信號通路[13]。去氫茯苓酸、去氫土莫酸是茯苓三萜類化合物的主要藥效組分[14]，三砧類化合物通過抑制一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶等的表達，抑制TNF-a，IL-1，PGE2，NO，IL-6等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用[15]。木犀草素是一種天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[16]，可在多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)抗腫瘤。其機制包括預防腫瘤形成，抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤血管生成以及增敏抗癌藥物活性等[17]。健脾益胃湯的這些化學成分通過抗炎、調(diào)節(jié)免疫、防癌、抗癌等作用治療慢性萎縮性胃炎。

從檢索的109個靶點類型看，109個作用靶點類型包含各種酶、受體、蛋白、離子通道、轉(zhuǎn)錄因子、電化學轉(zhuǎn)運體、跨膜單電子轉(zhuǎn)移載體、細胞色素P450等，表明健脾益胃湯的潛在靶點參與了生物代謝的各個部分。通過構(gòu)建藥物-化學成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡和潛在靶點的蛋白互作網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)這些靶點不僅可以單獨發(fā)揮作用，也可以通過相互調(diào)節(jié)、相互促進共同發(fā)揮作用，表明健脾益胃湯治療慢性萎縮性胃炎具有多成分、多靶點、相互協(xié)調(diào)的作用特點，這也體現(xiàn)了方劑配伍的真諦。

從45個靶點的富集分析結(jié)果看。AGE-RAGE信號通路激活NF-kB核轉(zhuǎn)錄因子，可引起大量促炎細胞因子(如白細胞介素-6、白細胞介素-8、腫瘤壞死因子-a)等的表達和釋放，最終引起慢性細胞活化和組織損傷，同時激活的NF-kB也會進一步增強RAGE的表達從而重復該過程，加重病情[18-19]。AP-1是調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與胃癌的發(fā)生相關(guān)[20]。AP-1可促進多種炎癥因子(如IL 2，IL-8，TNF-a，TGF-β，IFN-y等)的表達，進而影響細胞的生理功能、參與疾病的發(fā)生。AP-1家族成員c-Jun，c-Fos屬于編碼核蛋白的原癌基因，原癌基因的過度激活可導致細胞癌變。富集分析顯示健脾益胃湯參與氧化應激反應、凋亡信號通路、白細胞分化、炎癥反應的調(diào)節(jié)、氧氣水平的反應、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、對機械刺激的反應、活性氧代謝過程、白介素信號等生物過程，通過改善胃黏膜細胞功能及抗氧化能力，減輕炎癥和氧化應激反應，達到治愈CAG的目的?；贙EGG代謝通路的分析結(jié)果顯示，健脾益胃湯治療CAG還與相關(guān)癌癥通路有關(guān)，通過相關(guān)癌癥通路參與胃癌細胞凋亡從而起到預防胃癌的發(fā)生。