隋業(yè)璇 徐偉良 李春冬 郭梁

(錫林郭勒職業(yè)學(xué)院生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000)

花臉香蘑(Lepista sordida)屬于擔(dān)子菌亞門、傘菌綱、傘菌目、口蘑科、香蘑屬，又因其菌肉呈淡紫羅蘭色，又名紫晶香蘑、丁香蘑、花臉蘑等[1]?；樝隳V泛分布于內(nèi)蒙古、東北、甘肅、河南、四川等地，多產(chǎn)于夏秋季節(jié)，群生或簇生于草原、山坡、林中草地，是一種開發(fā)潛力巨大的優(yōu)質(zhì)藥食同源菌種[2,3]。紫花臉香蘑所含多糖成分可間接調(diào)節(jié)益生菌和有害菌二者的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系、促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)、降低血糖等[4]。花臉香蘑含各種氨基酸，胡先運(yùn)等通過用土豆、酵母膏、蔗糖和生長(zhǎng)因子制成的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后測(cè)得，花臉香蘑菌絲體富含8種人體必需氨基酸，且總氨基酸含量達(dá)51.49%，高于一些常見的真菌，如靈芝等[5]。花臉香蘑中鈣、鐵、胡蘿卜素和煙酸含量豐富，還含有較多的微量元素，具有養(yǎng)血、益神和補(bǔ)五臟的功效，常食有利于治療貧血、久病體虛、神疲和健忘等癥，并具有抑制癌細(xì)胞的功效和廣泛的抗菌活性[6,7]。宋曉琳等通過建立小鼠急性化學(xué)性肝損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，花臉香蘑多糖具有一定的抗氧化作用，對(duì)氯仿(CCl4)誘發(fā)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用[8]。陳湘蓮等用二苯基苦味?；诫?DPPH)法對(duì)從花臉香蘑分離提取的發(fā)酵次生代謝物質(zhì)研究表明，菌絲提取物具有較強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤活性[9]。

目前，對(duì)于花臉香蘑的研究主要集中在生物學(xué)特性、液體發(fā)酵培養(yǎng)及生物活性成分，對(duì)栽培馴化的研究報(bào)道較少。羅倩等以菌絲生物量為主要指標(biāo)，對(duì)1株分離的花臉香蘑HL-07菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)基優(yōu)化，篩選出了適宜其菌絲生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基[10]。許瀛引采用液體發(fā)酵技術(shù)獲取足量的花臉香蘑菌絲體[11]。張俊波等利用谷殼、干牛糞、菜籽餅、麥麩、碳酸鈣和石灰石膏制成合適出菇的栽培種[12]。孟玲等通過對(duì)碳源、氮源、碳氮比、無機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)因子進(jìn)行分析研究，優(yōu)化了花臉香蘑菌絲體固體培養(yǎng)所需等生長(zhǎng)因素配比[13]。賀永國(guó)等利用用浸泡后的麥粒、發(fā)酵好的白參菌菌糠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室栽培種出菇[14]。綜上所述，花臉香蘑的菌種培養(yǎng)基的篩選、培育與人工馴化栽培還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，未見大規(guī)模商業(yè)化栽培。

花臉香蘑在內(nèi)蒙古草原地區(qū)均勻分布，其中在錫林郭勒和呼倫貝爾草原野生菌群資源豐富，產(chǎn)量較多。但由于花臉香蘑缺乏科學(xué)研究及保護(hù)，人工馴化栽培技術(shù)尚未獲得實(shí)質(zhì)性的突破。隨著生態(tài)環(huán)境的不斷變化，其生境破壞嚴(yán)重，并由于每年生長(zhǎng)時(shí)間短，自然采集量低，有價(jià)無貨，導(dǎo)致野生花臉香蘑菌群分布逐漸減少，亟需對(duì)野生花臉香蘑種質(zhì)資源開展研究和保護(hù)。本研究對(duì)采集于錫林郭勒草原的野生花臉香蘑子實(shí)體進(jìn)行分離培養(yǎng)，選取常用的固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基及栽培種培養(yǎng)基進(jìn)行人工馴化培養(yǎng)研究，篩選出適合花臉香蘑菌絲生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基以及栽培種培養(yǎng)基為后續(xù)花臉香蘑的人工馴化和仿野生栽培種提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生花臉香蘑子實(shí)體采集于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟草原，分離鑒定菌絲體由錫林郭勒職業(yè)學(xué)院生物工程研究院提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 固體培養(yǎng)基配方

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯(去皮)切片200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，pH自然[15]；PDA加富培養(yǎng)基，g·L-1：馬鈴薯(去皮)切片200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸膏2g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂20g，pH自然[16]；改良PDA培養(yǎng)基，g·L-1：馬鈴薯(去皮)切片200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，維生素B10.01g，瓊脂20g，pH自然[17]。

1.2.2 液體培養(yǎng)基配方

液體培養(yǎng)基1，g·L-1：馬鈴薯切片200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸膏2g，KH2PO43g，MgSO41.5g，pH自然[18]；液體培養(yǎng)基2，g·L-1：玉米粉30g，蔗糖10g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，pH自然[19]；液體培養(yǎng)基3，g·L-1：蔗糖30g，酵母膏6g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O 1g，pH自然[20]。

1.2.3 栽培種培養(yǎng)基配方[21]

高粱1.0kg，麩皮50g，石膏50g，木屑200g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，蒸餾水根據(jù)濕度添加。

1.3 設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)，上海昕?jī)x儀器儀表有限公司；HWS-250BX恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；202-3A電熱恒溫干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；電子萬用爐，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；MLS-3751L-PC高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；THZ-35高速恒溫培養(yǎng)搖床，蘇州貝茵科技股份有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 固體培養(yǎng)基篩選

選取朵形端正、健壯、色澤好、肉質(zhì)飽滿的花臉香蘑子實(shí)體，通過無菌操作將子實(shí)體縱剖，在花臉香蘑子實(shí)體上劃3mm×3mm×3mm大的不同的4個(gè)位置的塊狀組織，用接種鉤勾取置培養(yǎng)基中央，用封口膜封住平皿，以防失水，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行初步的避光培養(yǎng)。用打孔器在初步培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上取生長(zhǎng)速度、顏色和大小相同的菌絲塊接種至3種不同的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每日觀察并記錄，直至菌絲長(zhǎng)至培養(yǎng)皿邊緣。用電子萬用爐將3種固體培養(yǎng)基內(nèi)瓊脂煮沸溶解，使菌絲體與瓊脂分離，用無菌紗布進(jìn)行過濾。將菌絲放在預(yù)先干燥稱量恒重后的稱量皿中，放置于80℃狀態(tài)下烘干，取出后冷卻稱量至恒重。根據(jù)花臉香蘑菌種在3種固體培養(yǎng)基上的菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌絲干質(zhì)量篩選出最優(yōu)固體培養(yǎng)基配方。

1.4.2 液體培養(yǎng)基篩選

在篩選出的最優(yōu)固體培養(yǎng)基上，選取菌絲長(zhǎng)勢(shì)、顏色相似位置，用打孔器取16個(gè)大小均一的菌塊，4個(gè)菌塊為1組，分別接種于100mL 3種不同液體培養(yǎng)基中，并放入搖床中，于150r·min-1，25℃條件下培養(yǎng)5d。將培養(yǎng)好的液體培養(yǎng)基中的菌絲球放在紗布上過濾，用無菌水清洗后，于80℃下烘干4h，冷卻至室溫稱重，利用公式計(jì)算菌絲體生物量[19]。根據(jù)菌絲體生物量篩選出最優(yōu)液體培養(yǎng)基配方。公式：

菌絲體生物量(g·L-1)=菌絲體干重/培養(yǎng)液體積

1.4.3 花臉香蘑菌種栽培馴化

先將高粱沖洗提前用水浸泡16h，加水煮沸至高粱粒軟而不爛，瀝干水分，以高粱的干重為基準(zhǔn)，依次加入石膏、麥麩和木屑，同時(shí)按配方比例加入KH2PO4和MgSO42種營(yíng)養(yǎng)素混合水溶液，用生石灰調(diào)pH至7左右，翻攪均勻，用組培瓶裝料至瓶2/3處，瓶口覆封口膜，壓緊瓶蓋，121℃滅菌2h后取出，在超凈工作臺(tái)內(nèi)冷卻后，無菌操作下，將滅菌后組培瓶中的栽培基料上下翻攪均勻，將篩選出的最優(yōu)液體培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基重量的3%接種，并置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。觀察并記錄其生長(zhǎng)狀態(tài)、菌瓶減少的重量和菌絲吃料深度，從而評(píng)價(jià)花臉香蘑在栽培種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花臉香蘑菌種固體培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

以PDA、PDA加富及改良PDA 3種固體培養(yǎng)基對(duì)分離的花臉香蘑菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)觀測(cè)記錄菌絲在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況，見圖1、表1，并通過菌絲干質(zhì)量和菌絲長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)分析篩選出最適合花臉香蘑菌種生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基配方，結(jié)果見圖2、圖3。通過觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)和測(cè)量菌絲長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)，菌絲在3種固體培養(yǎng)基上均能很快萌發(fā)，菌絲茂密整齊。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在培養(yǎng)至第18天時(shí)，PDA培養(yǎng)基上的菌絲率先長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，而PDA加富培養(yǎng)基與改良PDA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)略慢，在培養(yǎng)至第20天時(shí)，也已全部長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，因此在3種培養(yǎng)基上整體長(zhǎng)勢(shì)無顯著差異。

注：A表示PDA培養(yǎng)基；B表示PDA加富培養(yǎng)基；C表示改良PDA培養(yǎng)基。

表1 花臉香蘑菌種在3種固體培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)狀況

圖2 花臉香蘑菌種在3種固體培養(yǎng)基上的菌絲長(zhǎng)度

通過對(duì)3種固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌絲干質(zhì)量比較，見圖3，PDA加富培養(yǎng)基上的菌絲干質(zhì)量最大，為0.17±0.02g，其次是改良PDA培養(yǎng)基的菌絲干質(zhì)量，為0.12±0.01g，而在PDA培養(yǎng)基上的菌絲干質(zhì)量最小，為0.11±0.03g，由此說明，雖然在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度較快，且菌絲較濃密，但在PDA加富培養(yǎng)基上的的菌絲干質(zhì)量積累較多。綜合以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，確定PDA加富培養(yǎng)基為花臉香蘑菌種的最優(yōu)固體培養(yǎng)基配方。其他研究學(xué)者，如陸歡等研究報(bào)道，花臉香蘑在PDA和含麥粒的瓊脂培養(yǎng)基均上長(zhǎng)勢(shì)旺盛，菌絲粗壯、致密，爬壁能力較強(qiáng)，菌絲呈紫色或淺紫色，絨毛狀[22]。

2.2 花臉香蘑菌種液體培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

選用3種常見不同配料的液體培養(yǎng)基，并以菌絲體生物量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)花臉香蘑最佳液體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖4。由圖4可知，花臉香蘑菌種在液體培養(yǎng)基1、液體培養(yǎng)基2、液體培養(yǎng)基3 3種液體培養(yǎng)基上的菌絲生物量分別為1.68±0.13g·L-1、1.58±0.10g·L-1、1.06±0.11g·L-1，其中在液體培養(yǎng)基1上菌絲生物量最高，液體培養(yǎng)基3上的菌絲生物量最小。通過菌絲體生物量的比較分析，最終確定液體培養(yǎng)基1為花臉香蘑菌種的最佳培養(yǎng)基配方。目前，花臉香蘑液體發(fā)酵技術(shù)相對(duì)成熟，主要對(duì)搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究較多，對(duì)花臉香蘑液體發(fā)酵培養(yǎng)的影響因素通過正交實(shí)驗(yàn)法探索得到最優(yōu)組合。崔曉等以菌絲生物量為主要指標(biāo)，通過對(duì)馬鈴薯、玉米粉、麩皮、葡萄糖、酵母膏含量進(jìn)行配比，從這5種不同液體培養(yǎng)基中篩選出了適宜菌絲生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基，其菌絲生物量達(dá)到2.209g·L-1[23]。這與本研究篩選的液體培養(yǎng)基1的生物量相近。

圖3 花臉香蘑菌種在3種固體培養(yǎng)基上的菌絲干質(zhì)量

圖4 花臉香蘑菌種在3種液體培養(yǎng)基上的菌絲干質(zhì)量

2.3 基于高粱培養(yǎng)基的花臉香蘑栽培種研制

本研究通過觀察并記錄花臉香蘑在栽培種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)、菌瓶?jī)?nèi)有機(jī)物變化量和菌絲吃料深度，從而評(píng)價(jià)花臉香蘑菌種的栽培馴化，結(jié)果如圖5、圖6所示。由圖5、圖6可知，花臉香蘑菌絲長(zhǎng)勢(shì)在栽培種培養(yǎng)基上呈現(xiàn)先快后慢的現(xiàn)象，菌絲在經(jīng)過2d的避光培養(yǎng)，瓶?jī)?nèi)已出現(xiàn)清晰可見萌發(fā)的菌絲團(tuán)，在第8天時(shí)菌絲體已生長(zhǎng)至培養(yǎng)基質(zhì)的1/2，隨后生長(zhǎng)逐漸減緩，至第24天時(shí)接近長(zhǎng)滿，此時(shí)菌絲吃料深度達(dá)8.12±1.7cm，可觀察到少部分紫色色素和大部分白色菌絲體。通過菌瓶重量變化曲線可知，菌瓶隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)重量變化量逐漸增大，這是由于菌絲體腐生生長(zhǎng)需大量消耗有機(jī)物質(zhì)，當(dāng)至24d時(shí)，菌瓶重量已減少了7.81±1.83g。綜上試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，花臉香蘑菌絲在高粱培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)基能供應(yīng)其基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖5 花臉香蘑菌種在高粱二級(jí)種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)

圖6 花臉香蘑在高粱二級(jí)種培養(yǎng)基減少的重量

3 結(jié)論與討論

本文通過對(duì)花臉香蘑固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基選的篩選研究表明，確定PDA加富培養(yǎng)基為花臉香蘑菌種的最佳固體培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)至20d后菌絲干質(zhì)量達(dá)0.17±0.02g；通過菌絲體生物量的比較分析，確定液體培養(yǎng)基1為花臉香蘑菌種的最佳培養(yǎng)基配方，其菌絲生物量為1.68±0.13g·L-1。通過觀察并記錄花臉香蘑在栽培種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)、菌瓶?jī)?nèi)有機(jī)物變化量和菌絲吃料深度，確定花臉香蘑菌絲在高粱培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)基能供應(yīng)其基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本研究所選用的培養(yǎng)基配方均以常見食用菌培養(yǎng)配方為基礎(chǔ)，并進(jìn)行了初步改良，因此，所篩選花臉香蘑固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基及栽培種培養(yǎng)基最佳配方，只作為初步篩選階段，后續(xù)還需對(duì)培養(yǎng)基中的具體營(yíng)養(yǎng)成分比例及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步完善論證實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，以期為野生花臉香蘑優(yōu)良菌種篩選和后續(xù)育種提供有力數(shù)據(jù)。