劉文娟，肖 瑩，買占海，張曉松，周 軻，姚萬玲，紀(jì) 鵬，華永麗，袁子文，魏彥明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

為維護(hù)我國動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)明確規(guī)定，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。在“飼料端禁抗、養(yǎng)殖端限抗”背景下，畜禽高效健康養(yǎng)殖的新型替抗飼料添加劑產(chǎn)品需求日益迫切。中藥作為新型替抗飼料添加劑產(chǎn)品的重要來源之一，應(yīng)用前景廣闊。

黃芪和當(dāng)歸均為甘肅省道地藥材。黃芪為豆科植物莢膜黃芪或蒙古黃芪的根，性微溫，味甘；入肺、脾經(jīng)，主要含有多糖、黃酮類、皂苷類及氨基酸、微量元素等有效成分[1]。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸的干燥根，性溫，味甘、辛；歸肝、心、脾經(jīng)[2]，主要成分為多糖、有機(jī)酸和揮發(fā)油等[3]。自古以來有“十方九歸”的說法[4]，可見其應(yīng)用廣泛。查閱古方及大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，符合“氣血同補(bǔ)”理念的黃芪當(dāng)歸配伍在臨床上應(yīng)用廣泛，常用比例包括1∶1、3∶1、1∶5、3∶2、2∶1及5∶1等[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，黃芪-當(dāng)歸(1∶1)配伍對(duì)提高小鼠免疫力效果較顯著[6]；且促進(jìn)造血作用較強(qiáng)[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)黃芪當(dāng)歸按1∶1配伍時(shí)，提取物中主要活性成分阿魏酸、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷等成分的溶出量顯著增加，在小腸中的吸收量也呈增加趨勢(shì)[10]。但截至目前關(guān)于黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物制備工藝優(yōu)化的報(bào)道甚少。因此，本研究通過測(cè)定黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物中阿魏酸(Y1)、毛蕊異黃酮(Y2)、粗多糖(Y3)及干浸膏(Y4)含量占比，以此進(jìn)行綜合評(píng)分，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)選黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提工藝，旨在為黃芪當(dāng)歸提取物作為飼料添加劑進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 中藥材黃芪(批號(hào)：HZ20210105)、當(dāng)歸(批號(hào)：HZ20210120)均購自蘭州黃河藥材市場(chǎng)，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)學(xué)教研室鑒定分別為豆科植物黃芪、傘形科植物當(dāng)歸的干燥根。

1.1.2 試劑 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：F103702 )，阿拉丁公司產(chǎn)品；毛蕊異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：yz170221)，南京源植生物技術(shù)公司產(chǎn)品；D-無水葡萄糖(批號(hào)：50-99-7)，上海凜恩科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

1.1.3 主要儀器 JA2003電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Aglient1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；FD-1A-5D型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；Spectra Max Plus384酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 水提工藝 將黃芪、當(dāng)歸飲片粉碎后過60目篩，精確稱量黃芪、當(dāng)歸藥粉各5 g混合均勻，據(jù)設(shè)定的時(shí)間、料液比、溫度及提取次數(shù)進(jìn)行提取，提取液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，收集上清液，在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、并經(jīng)冷凍干燥后備用。

1.2.2 阿魏酸與毛蕊異黃酮的含量檢測(cè)

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱 (250 mm×4.6 mm， 5 μm) ；流動(dòng)相：乙腈(A)-1 mL/L磷酸水溶液(B)；洗脫梯度：10 min～16 min 20%A；16 min～25 min 20%～32%A；25 min～34 min 32%～34%A。柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸和毛蕊異黃酮對(duì)照品適量，加入甲醇溶解并定容，制成每1 mL含阿魏酸0.1 mg、毛蕊異黃酮0.035 mg的混合對(duì)照品母液。

1.2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取“1.2.1”項(xiàng)下提取制備的提取物300 mg，加甲醇溶解，3 500 r/min離心10 min，將上清液移至10 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度線，0.45 μm微孔濾膜過濾取其續(xù)濾液。

1.2.2.4 樣品含量測(cè)定 按照“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄阿魏酸與毛蕊異黃酮的保留時(shí)間和峰面積，采用外標(biāo)法分別計(jì)算其含量。

1.2.3 粗多糖的測(cè)定

1.2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取D-無水葡萄糖粉末適量,溶解并定容至100 mL容量瓶中，制成每1 mL含0.25 mg的D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為對(duì)照品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取“1.2.1”項(xiàng)下提取制備的粉末適量，溶解并定容后制成每1 mL含2 mg樣品的供試品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 樣品含量測(cè)定 在“1.2.3.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液中，分別加入1 mL 50 mg/mL的苯酚溶液，迅速在試管中加入5 mL濃硫酸，置漩渦混勻器搖勻后于40 ℃水浴保溫加熱15 min，取出后冷水冷卻10 min，然后精密吸取200 μL反應(yīng)液于96孔板中，用酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定OD值并記錄。

1.2.4 干浸膏得率的測(cè)定 干浸膏得率(Y4)=干浸膏質(zhì)量(m)/原藥材質(zhì)量(M)×100%。

1.2.5 綜合加權(quán)評(píng)分計(jì)算 采用綜合加權(quán)評(píng)分法評(píng)估黃芪-當(dāng)歸(1∶1)提取工藝，根據(jù)其藥理作用及結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐方面的利用價(jià)值[1,5,11-14]，將阿魏酸占比(Y1)、毛蕊異黃酮占比(Y2)、多糖占比(Y3)及干浸膏得率(Y4)的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.2、0.2、0.3、0.3。綜合評(píng)分=(Y1/Y1max)×100×0.2+(Y2/Y2max)×100×0.2+(Y3/Y3max)×100×0.3+(Y4/Y4max)×100×0.3。式中Y1max、Y2max、Y3max、Y4max分別指代提取物阿魏酸最大占比、毛蕊異黃酮最大占比、粗多糖最大占比、干浸膏最大得率。

1.2.6 單因素試驗(yàn) 精密稱取黃芪當(dāng)歸藥粉各5 g，水浴加熱提取1次，分別考察提取溫度為60、70、80、90、100 ℃，提取時(shí)間為30、40、50、60、70 min，料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25對(duì)提取工藝的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。各提取物分別按“1.2.2.4”、“1.2.3.3”“1.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算阿魏酸、毛蕊異黃酮、多糖含量占比和干浸膏得率，并按照“1.2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行綜合評(píng)分計(jì)算。

1.2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)初步篩選結(jié)果為基礎(chǔ)，分別以提取溫度、提取時(shí)間、料液比為因素，再加入提取次數(shù)因素(1次、2次、3次)，進(jìn)行4因素3水平的L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)選黃芪當(dāng)歸水提物制備工藝(表1)。

表1 正交試驗(yàn)水平

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸與毛蕊異黃酮的含量檢測(cè)

2.1.1 線性關(guān)系考察 將混合對(duì)照品母液記為1號(hào)瓶，再取4個(gè)10 mL容量瓶依次標(biāo)號(hào)為2、3、4、5，從1號(hào)瓶中取5 mL混合對(duì)照品移至2號(hào)瓶中，加甲醇定容至10 mL，搖勻，依次稀釋到3、4、5號(hào)瓶中，稀釋倍數(shù)分別為2、4、8、16。混和對(duì)照品及黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物供試品的高效液相色譜圖見圖1。分別從1～5號(hào)瓶取20 μL混合對(duì)照品溶液，按照“1.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，濃度(x，mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：阿魏酸y=79 587x-202.18(R2=0.999 1)，毛蕊異黃酮y=79 922x-33.220 8 (R2=0.999 8)。結(jié)果顯示,阿魏酸、毛蕊異黃酮檢測(cè)范圍分別在0.006 25 mg/mL～0.1 mg/mL，0.002 187 5 mg/mL～0.035 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并計(jì)算得到阿魏酸和毛蕊異黃酮峰面積的RSD值分別為1.01%、1.77%，表明儀器精密度良好。

A.混合對(duì)照品；B.黃芪-當(dāng)歸藥對(duì)供試品；C.缺少黃芪的陰性對(duì)照；D.缺少當(dāng)歸的陰性對(duì)照;1號(hào)和2號(hào)峰分別阿魏酸、毛蕊異黃酮

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一條件制備的黃芪當(dāng)歸(1∶1)提取物粉末6份，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算得到阿魏酸和毛蕊異黃酮峰面積的RSD值分別為1.06%、2.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一黃芪當(dāng)歸提取物粉末適量，按照“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫保存，分別于 0、2、4、6、8、10、24 h 精密吸取20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到阿魏酸酸和毛蕊異黃酮峰面積的RSD值分別為2.53%、2.18%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率 取已知含量提取物粉末6份，分別精密加入混合對(duì)照品溶液適量，按“1.2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定計(jì)算得到阿魏酸和毛蕊異黃酮平均加樣回收率分別為103.9%、100.19%，RSD分別為1.61%、2.93%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 粗多糖的測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系考察 用移液管分別移取“1.2.3.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于不同的試管之中，加蒸餾水至2.0 mL。后續(xù)操作同“1.2.3.3”項(xiàng)下方法。以濃度(x，mg/mL)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在0～0.031 25 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，求得出回歸方程為：y=29.178x-0.015 4，R2=0.999 0。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 精確吸取D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液0.6 mL置試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線操作步驟重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)定并計(jì)算得到RSD值為0.597%，說明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一條件制備的黃芪-當(dāng)歸(1∶1)提取物粉末6份，按“1.2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算得到RSD值為2.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取完全反應(yīng)后的供試品，每隔20 min測(cè)1次OD值，測(cè)定并計(jì)算OD值的RSD為1.42%，說明在100 min內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知多糖含量的供試液6份各50 μL至離心管中，按低、中、高濃度分別加已知濃度的對(duì)照品溶液用“1.2.3.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定并計(jì)算OD值，結(jié)果顯示樣品平均回收率為 98.78%，RSD為0.88%，說明試驗(yàn)準(zhǔn)確度良好。

2.3 單因素試驗(yàn)

結(jié)果顯示，提取溫度在80 ℃時(shí)，藥物提取的綜合評(píng)分最高。時(shí)間在40 min時(shí)，藥物提取的綜合評(píng)分最高。料液比在1∶15時(shí)，藥物提取的綜合評(píng)分最高。因此，確定80 ℃為最佳提取溫度，40 min為最佳提取時(shí)間，1∶15為最佳料液比(圖2)。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)各指標(biāo)權(quán)重計(jì)算綜合評(píng)分，用正交設(shè)計(jì)助手軟件進(jìn)行直觀分析(表2)。

根據(jù)單因素初篩選試驗(yàn)結(jié)果及正交設(shè)計(jì)助手分析結(jié)果，分別確定提取溫度、時(shí)間、料液比、提取次數(shù)4個(gè)因素，進(jìn)行方差分析(表3)。

由表2、3可以看出，提取黃芪當(dāng)歸對(duì)最優(yōu)工藝為A2B2C2D3，即提取溫度為80 ℃、提取時(shí)間為40 min，料液比為1∶15、提取次數(shù)為3次。提取次數(shù)對(duì)其綜合評(píng)分影響最大，提取溫度對(duì)綜合評(píng)分影響最小。

2.5 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證

依據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析所得出的提取工藝，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)(表4)。綜合評(píng)分分別為98.721、97.888、98.634，RSD值為0.465%。其結(jié)果高于前面試驗(yàn)的綜合評(píng)分，表明此優(yōu)化工藝可行。

A.溫度;B.時(shí)間;C.料液比

表2 正交直觀分析

表3 方差分析結(jié)果

表4 工藝優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

黃芪是重要補(bǔ)氣藥物之一，當(dāng)歸是重要補(bǔ)血藥物之一，二者配伍作為補(bǔ)氣生血的重要藥對(duì)，臨床應(yīng)用潛力較大，其主要通過增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫、增強(qiáng)骨髓造血等功能來發(fā)揮藥理作用[7]。二者配伍后的化合物主要包括黃酮類的毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花素、刺芒柄花素苷，有機(jī)酸類的阿魏酸、香草酸，以及多糖類等[15]。毛蕊異黃酮是黃芪主要活性成分之一，具有抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、保護(hù)臟器、抗黑色素再生成等作用[16]?！吨袊幍洹?020 年版中黃芪雖以毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為指示成分[17]，但在水提過程中，毛蕊異黃酮葡萄糖苷會(huì)因持續(xù)加熱較長(zhǎng)時(shí)間而易脫去葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槊锂慄S酮。毛蕊異黃酮由于相對(duì)分子質(zhì)量小且具有疏水性，相比與它對(duì)應(yīng)的糖苷，更易被吸收而發(fā)揮藥效[6]，且大多數(shù)學(xué)者都將其作為黃芪質(zhì)量控制的標(biāo)志物之一。阿魏酸是《中國藥典》2020年版中當(dāng)歸質(zhì)量控制的唯一指標(biāo)性成分，具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗輻射及提高機(jī)體免疫力等作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[18]。多糖作為黃芪、當(dāng)歸的重要天然活性成分，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、保肝等生理功能，在畜禽生產(chǎn)中作為飼料添加物被廣泛使用[19-21]。另外，文獻(xiàn)報(bào)道干浸膏率是影響提取工藝產(chǎn)量?jī)?yōu)化的重要因素[22]。所以，本研究選取阿魏酸、毛蕊異黃酮、多糖3種代表活性成分結(jié)合干浸膏得率為檢驗(yàn)指標(biāo)。并根據(jù)其化學(xué)和藥理特性及在優(yōu)化工藝過程中的重要性，設(shè)置不同的權(quán)重系數(shù)，即阿魏酸、毛蕊異黃酮、多糖分別為 0.2、0.2、0.3，干浸膏得率為0.3。

中藥提取工藝的優(yōu)化是保障中藥功效的重要手段。水提工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)過程中，發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比等因素對(duì)提取物的活性及得率有較大影響。本研究在單因素試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其他條件固定時(shí)，隨著時(shí)間的增加，提取物中阿魏酸占比呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，干浸膏得率、毛蕊異黃酮及多糖占比先升高后降低；隨著溫度的增高，干浸膏得率、提取物中阿魏酸及多糖占比先升高后降低，毛蕊異黃酮占比持續(xù)降低；隨著料液比的增加，干浸膏得率先增加后基本保持不變，提取物中阿魏酸、毛蕊異黃酮及多糖占比先升高后降低。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示所選各指標(biāo)間變化趨勢(shì)未達(dá)成一致，說明若選用單一活性成分作為考察指標(biāo)無法客觀反映藥對(duì)制備工藝的優(yōu)劣性。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合多指標(biāo)綜合評(píng)分法開展正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。多指標(biāo)綜合評(píng)分法可兼顧中藥復(fù)方多靶點(diǎn)多途徑的作用特點(diǎn)，有效避免單一指標(biāo)評(píng)價(jià)制備工藝時(shí)的片面性，更符合中(獸)醫(yī)用藥的整體觀思維[23]。正交設(shè)計(jì)是目前應(yīng)用最為廣泛且發(fā)展成熟的多因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法之一[24]，其具有高效方便、試驗(yàn)次數(shù)少、結(jié)果直觀易分析等特點(diǎn)[25]，被廣泛運(yùn)用于生物醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域來解決多因素多水平問題[26-27]，從而達(dá)到提高生產(chǎn)效率和優(yōu)化生產(chǎn)工藝等目的。本研究將以上兩種試驗(yàn)方法結(jié)合，在較少的試驗(yàn)次數(shù)中快速確定黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物最佳制備工藝為：溫度80 ℃、提取時(shí)間40 min、料液比1∶15、提取3次。

綜上所述，本研究就黃芪-當(dāng)歸(1∶1)水提物制備工藝的影響因素，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法展開工藝性探討，通過對(duì)黃芪-當(dāng)歸常用且穩(wěn)定的3種活性成分進(jìn)行檢測(cè)及干浸膏得率的計(jì)算，結(jié)合多指標(biāo)綜合評(píng)分法分析在現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)下黃芪當(dāng)歸的發(fā)展。結(jié)果表明，本法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，提取工藝穩(wěn)定可行，能有效提高藥物藥效，避免浪費(fèi)藥材，為其作為畜禽保健型飼料添加劑提供理論依據(jù)。但本研究也存在一定的不足之處，僅選取主要指標(biāo)成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，無法全面準(zhǔn)確地反映復(fù)方中藥的物質(zhì)作用基礎(chǔ)。