陳冠銘，楊麗姿，龐定國，王正書，劉 群*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041；2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川成都 610041)

單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)成員分布廣泛，參與機體特異性免疫和非特異性免疫[1]。巨噬細(xì)胞表面具有大量受體，其中C3b受體(CR1)和Fc受體(FcR)在巨噬細(xì)胞識別、結(jié)合、吞噬抗原的過程中發(fā)揮重要作用。C3b受體能與C3補體裂解片段(C3b)特異性結(jié)合并介導(dǎo)細(xì)胞識別、攝取C3b包被的顆粒和免疫復(fù)合物[2-3]。Fc受體能與IgG、IgE、IgA、IgM等抗體的Fc片段特異性結(jié)合[4-5]。中藥對巨噬細(xì)胞表面的C3b受體和Fc受體活性具有調(diào)節(jié)作用，如五味消毒飲作為一種清熱解毒方劑，用于多種疾病的治療，針對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞可以提升C3b 受體活性[6]；軍用固體運動飲料富含黃芪、人參和紅景天等中藥提取物，可明顯增加C3b受體活性[7]。雙黃連可溶性粉(金銀花∶連翹∶黃芩=1∶2∶1)具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效，廣泛應(yīng)用于外感風(fēng)熱所致的感冒(癥見發(fā)熱、咳嗽、咽痛)，獸醫(yī)臨床上用于臟腑氣分實熱證、濕熱證和熱毒證的治療，由于病原體的清除與免疫系統(tǒng)關(guān)系密切，推測雙黃連可溶性粉可能參與了免疫調(diào)節(jié)過程[9-10]。本研究以S180載瘤小鼠為研究對象，腹腔巨噬細(xì)胞C3b、Fc受體活性為檢測指標(biāo)，采用EA、YC-花環(huán)試驗，結(jié)合巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞，探討雙黃連可溶性粉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞C3b、Fc受體活性的影響，旨在為 雙黃連可溶性粉的使用探索更廣泛的用途，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 雙黃連可溶性粉，由江西仲襄本草生物有限公司提供(批號：1900301)。

1.1.2 實驗動物 SPF昆明小鼠，雌性,6周齡～8周齡,24 g～26 g，成都達碩實驗動物有限公司提供(scxk(川)2015-030)。

1.1.3 瘤細(xì)胞 S180腹水瘤細(xì)胞，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供。

1.1.4 主要試劑 黃芪多糖、酵母菌干粉，西南民族大學(xué)臨床實驗室提供；環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；20 mL/L戊二醛、丙酮、甲醇，成都市科隆化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；瑞特氏染色液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；HE染色液，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品； DMEM完全培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司產(chǎn)品；PBS、Hanks液，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；100 mL/L新鮮羊紅細(xì)胞懸液、雞紅細(xì)胞懸液，南京森貝伽生物科技有限公司產(chǎn)品；兔抗羊紅細(xì)胞抗體，北京博爾西科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要儀器 壓力蒸汽滅菌器(HVE-50)，德國HIRAYMA公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HWS24)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(BD-115)，德國BINDER公司產(chǎn)品；微量移液槍，德國Heidolph公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雙黃連可溶性粉口服液制備 按照生藥濃度，用蒸餾水將雙黃連可溶性粉配制成200%、100%、50%的口服液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 S180荷瘤小鼠分組及處理 S180腹水瘤細(xì)胞懸液，瘤細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，經(jīng)預(yù)試驗確定最佳接種濃度1×107cells/mL，0.2 mL/只(肉瘤生長良好并能保證整個試驗過程中(14 d)瘤體不破裂導(dǎo)致死亡)，接種5 d～7 d后，挑選腋下米粒大小瘤體的小鼠，隨機分為荷瘤小鼠組、雙黃連高劑量組、雙黃連中劑量組、雙黃連低劑量組、黃芪多糖組、環(huán)磷酰胺組，另設(shè)空白對照組(非荷瘤小鼠)，每組24只。各組處理如下：

荷瘤小鼠組，每日灌胃生理鹽水0.2 mL/只；雙黃連高劑量組，每日灌胃200%雙黃連口服液0.2 mL/只；雙黃連中劑量組，每日灌胃100%雙黃連口服液0.2 mL/只；雙黃連低劑量組，每日灌胃50%雙黃連口服液0.2 mL/只；黃芪多糖組，每日灌胃濃度200 mg/kg的黃芪多糖0.2 mL/只；環(huán)磷酰胺組，每日灌胃濃度20 mg/kg的環(huán)磷酰胺0.2 mL/只；空白對照組，每日灌胃生理鹽水0.2 mL/只。

連續(xù)灌胃14 d。在第4(4 d)、7(7 d)、14(14 d)次灌胃后24 h，每組隨機抽取8只小鼠，腹腔注射5 mL無血清DMEM培養(yǎng)液并輕揉腹部2 min，剖腹收集腹腔巨噬細(xì)胞進行C3b、Fc受體活性檢測和吞噬試驗。

1.2.3 Fc受體檢測 采用EA花環(huán)試驗檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Fc受體活性。單層巨噬細(xì)胞載玻片(腹腔巨噬細(xì)胞懸液0.5 mL)+EA懸液0.4 mL(100 mL/L新鮮羊紅細(xì)胞懸液+等量兔抗羊紅細(xì)胞抗體(1∶1 000稀釋))，37 ℃溫育1 h，沖洗以除去非黏附的巨噬細(xì)胞和雜質(zhì)，瑞特氏染色，鏡檢，計數(shù)200個巨噬細(xì)胞，計算EA花環(huán)形成率。

1.2.4 C3b受體檢測 采用YC花環(huán)試驗檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞C3b受體活性。單層巨噬細(xì)胞載玻片(腹腔巨噬細(xì)胞懸液0.5 mL)+YC懸液0.4 mL(小鼠血清(1∶20比例稀釋)+酵母菌5 mg/mL)，37 ℃溫育1 h，沖洗以除去非黏附的巨噬細(xì)胞和酵母菌顆粒，H-E染色，鏡檢，計數(shù)200個巨噬細(xì)胞，計算YC花環(huán)形成率。

1.2.5 吞噬活性檢測 采用巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性。單層巨噬細(xì)胞載玻片(腹腔巨噬細(xì)胞懸液0.5 mL)+雞紅細(xì)胞懸液0.4 mL(1.25×107/mL)，37 ℃溫育30 min，沖洗以除去非黏附的巨噬細(xì)胞和紅細(xì)胞，瑞特氏染色，鏡檢，計數(shù)200個巨噬細(xì)胞，計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢結(jié)果

巨噬細(xì)胞EA花環(huán)、YC花環(huán)見圖1和圖2。

紫色：巨噬細(xì)胞；粉紅色：致敏綿羊紅細(xì)胞

不規(guī)則：巨噬細(xì)胞;長桿狀：致敏性酵母菌

2.2 Fc受體活性

各組小鼠在不同檢測時間點的EA花環(huán)率見表1和表2。

表1顯示，各檢測時間點(4、7、14 d)荷瘤小鼠組的EA花環(huán)率與空白組比較差異不顯著(P>0.05)；黃芪多糖組的EA花環(huán)率極顯著高于空白組和荷瘤小鼠組(P<0.01)；環(huán)磷酰胺組的EA花環(huán)率與空白組和荷瘤小鼠組相當(dāng)(P>0.05)；3個受試劑量藥物組的EA花環(huán)率均極顯著高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01)，并與黃芪多糖組相當(dāng)(P>0.05)，3個受試劑量藥物組間雖然差異不顯著，但隨著劑量濃度的增加，EA花環(huán)率的絕對平均值呈上升趨勢。

表2顯示，隨著給藥次數(shù)的增加(4 d～14 d)，3個受試劑量藥物組和黃芪多糖組的EA花環(huán)率呈上升趨勢，其中低劑量組在給藥14 d之后，花環(huán)率顯著高于4 d給藥時(P<0.05)。結(jié)果表明，接種S180瘤細(xì)胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Fc受體活性不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Fc受體活性無影響；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Fc受體活性增強，作用與黃芪多糖相當(dāng)。

2.3 C3b受體活性

各組小鼠在不同檢測時間點的YC花環(huán)率見表3和表4。表3顯示，各檢測時間點(4、7、14 d)荷瘤小鼠組的YC花環(huán)率與空白組比較無顯著差異(P>0.05)；黃芪多糖組的YC花環(huán)率顯著高于空白組和荷瘤小鼠組(P<0.01)；環(huán)磷酰胺組的YC花環(huán)率明顯低于空白組和荷瘤小鼠組(P<0.05)；3個受試劑量藥物組的YC花環(huán)率均極顯著高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01)并與黃芪多糖組相當(dāng)(P>0.05)，但組間差異不顯著。

表4顯示，隨著給藥次數(shù)的增加(4 d～14 d)，3個受試劑量藥物組和黃芪多糖組的YC花環(huán)率變化不大，差異不顯著。結(jié)果表明，接種S180瘤細(xì)胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞C3b受體活性不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺具有降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞C3b受體活性的作用；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞C3b受體活性增強，作用與黃芪多糖相當(dāng)。

表1 EA-花環(huán)率組間比較

表2 EA-花環(huán)率組內(nèi)比較

表3 YC-花環(huán)率組間比較

表4 YC-花環(huán)率組內(nèi)比較

綜合EA、YC花環(huán)試驗結(jié)果，接種S180瘤細(xì)胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Fc、C3b受體活性不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺具有降低C3b受體活性的作用(對Fc受體活性沒有影響)；黃芪多糖對Fc、C3b受體活性具有增強作用；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Fc、C3b受體活性增強。

2.4 吞噬活性

各組小鼠在不同時間點巨噬細(xì)胞吞噬活性(吞噬百分率、吞噬指數(shù))見表5和表6。

表5顯示，各檢測時間點(4、7、14 d)荷瘤小鼠組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬百分率與空白組比較無顯著差異(P>0.05)；黃芪多糖組的吞噬百分率高于空白組和荷瘤小鼠組(4 d、P<0.01，7 d、P<0.05，14 d、P>0.05)；環(huán)磷酰胺組的吞噬百分率與空白組和荷瘤小鼠組相當(dāng)(P>0.05)；3個受試劑量藥物組中，低劑量組的吞噬百分率高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(4 d、P<0.01，7 d、P<0.05，14 d、P>0.05)，中劑量組的吞噬百分率高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(4 d、P<0.01，7 d、P<0.01，14 d、P<0.01)，高劑量組的吞噬百分率高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(4 d、P<0.01，7 d、P<0.01，14 d、P>0.05)，中、高劑量組在連續(xù)給藥7 d～14 d的吞噬百分率高于黃芪多糖組(P<0.05)。

各檢測時間點(4、7、14 d)荷瘤小鼠組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)與空白組比較無顯著差異(P>0.05)；黃芪多糖組的吞噬指數(shù)極顯著高于空白組和荷瘤小鼠組(P<0.01)；環(huán)磷酰胺組的吞噬指數(shù)與空白組和荷瘤小鼠組相當(dāng)(P>0.05)；3個受試劑量藥物組中，低劑量藥物組的吞噬指數(shù)，在4、7 d兩個時間點高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01、P<0.05)，中劑量組吞噬指數(shù)在4、7、14 d這3個時間點高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01、P<0.01、P<0.01)，高劑量組吞噬指數(shù)在4、7、14 d這3個時間點高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01、P<0.01、P<0.05)，中、高劑量組的吞噬指數(shù)在連續(xù)給藥7 d～14 d高于黃芪多糖組(P<0.01、P<0.05)。

表6顯示，隨著給藥次數(shù)的增加(4 d～14 d)，3個受試劑量藥物組吞噬百分率的呈上升下降趨勢，7 d高于4 d和14 d，其余各組變化不大，差異不顯著。結(jié)果表明，接種S180瘤細(xì)胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性無顯著影響；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性增強，作用優(yōu)于或與黃芪多糖相當(dāng)。

隨著給藥次數(shù)的增加(4 d～14 d)，荷瘤小鼠組、黃芪多糖組的吞噬指數(shù)呈下降趨勢，環(huán)磷酰胺組的吞噬指數(shù)變化不大，3個受試劑量藥物組吞噬指數(shù)呈上升下降趨勢，7 d高于4 d和14 d。結(jié)果表明，接種S180瘤細(xì)胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力無顯著影響；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力增強，作用與黃芪多糖相當(dāng)。

表5 吞噬百分率和吞噬指數(shù)組間比較

表6 吞噬百分率和吞噬指數(shù)組內(nèi)比較

綜合吞噬百分率和吞噬指數(shù)，接種S180瘤細(xì)胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性和吞噬能力不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對巨噬細(xì)胞吞噬活性和吞噬能力無顯著影響；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性和吞噬能力增強，作用優(yōu)于或相當(dāng)于黃芪多糖。

3 討論

巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要成員，在組織中起著重要免疫作用，不僅具有抗感染、抗炎癥和抗腫瘤等免疫功能，還能在組織穩(wěn)態(tài)中調(diào)節(jié)淋巴管、血管的生成[11]。巨噬細(xì)胞C3b、Fc受體參與巨噬細(xì)胞發(fā)揮功能，其活性高低代表巨噬細(xì)胞功能狀態(tài)(吞噬、分泌等功能)，C3b、Fc受體對巨噬細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用，輔助巨噬細(xì)胞吞噬，促進對與免疫球蛋白和補體蛋白相結(jié)合的顆粒的攝取，在溶酶體中被消化和破壞[12-13]。C3b受體能與補體免疫復(fù)合物(IC)結(jié)合，在清除循環(huán)IC中發(fā)揮重要作用。這種受體對于防止IC的積累是至關(guān)重要的，IC的積累會導(dǎo)致炎癥病理。在一定條件下也能促進C3b調(diào)理過的顆粒被巨噬細(xì)胞吞噬[14]。Fc受體的主要功能是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬活動中的特異性吞噬，當(dāng)Fc受體與抗體的Fc片段結(jié)合后，能激活抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用；當(dāng)巨噬細(xì)胞Fc受體失衡時會導(dǎo)致多種自身免疫性疾病，如免疫性血小板減少癥 (ITP)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[15-18]等。C3b、Fc受體的結(jié)構(gòu)不同，C3b受體與配體結(jié)合需要二價陽離子的參與，其生物學(xué)活性會受到胰蛋白酶的破壞，需要巨噬細(xì)胞活化后才可以介導(dǎo)細(xì)胞吞噬，而Fc受體則不會被影響，不需要二價陽離子的參與就能與配體結(jié)合并能介導(dǎo)其吞噬作用[2]。關(guān)于巨噬細(xì)胞C3b、Fc受體活性檢測方法，目前主要采用EA-花環(huán)、YC-花環(huán)試驗，所謂EA-花環(huán)試驗是將巨噬細(xì)胞Fc受體與相應(yīng)抗體致敏的紅細(xì)胞(EA)混合，當(dāng)5個及以上的EA吸附在巨噬細(xì)胞上時會形成以巨噬細(xì)胞為中心，周圍為紅細(xì)胞的類似花環(huán)的形狀，花環(huán)率的高低代表Fc受體的活性；所謂YC-花環(huán)試驗是將巨噬細(xì)胞C3b受體與補體致敏的酵母菌(YC)混合，酵母菌被吸附在巨噬細(xì)胞上形成以巨噬細(xì)胞為中心，周圍為酵母菌的類似花環(huán)的形狀，花環(huán)率的大小代表C3b受體的活性[5]。

本研究以S180載瘤小鼠為模式動物，腹腔巨噬細(xì)胞為研究對象，C3b、Fc受體活性為檢測指標(biāo)，EA花環(huán)、YC花環(huán)試驗為研究手段，結(jié)合巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞，探討雙黃連可溶性粉對巨噬細(xì)胞免疫功能的影響，結(jié)果表明，小鼠接種S180瘤細(xì)胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Fc、C3b受體活性不受影響，免疫抑制劑環(huán)磷酰胺具有降低C3b受體活性的作用(對Fc受體活性沒有影響)，連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連可溶性粉，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Fc、C3b受體活性增強，吞噬能力增強，作用優(yōu)于或相當(dāng)于黃芪多糖，研究結(jié)果為雙黃連可溶性粉臨床使用的研究提供科學(xué)依據(jù)。