王凱莉，劉 成，楚肖冉，司振書，路建彪，李玉保，曹勝亮

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000)

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype-4,FAdV-4)屬于Ⅰ群禽腺病毒的C種，主要引起肝炎-心包積液綜合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)[1]。1987年巴基斯坦安卡拉地區(qū)最早報(bào)道該病，隨后在世界各地如美國、墨西哥、波蘭、匈牙利、智利、日本、印度和中國都有病例報(bào)道[2]，給全球家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對其進(jìn)行快速檢測和診斷顯得尤為重要，目前檢測FAdV-4的方法主要集中在分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測。分子生物學(xué)檢測方法中聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，血清學(xué)診斷方法中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)報(bào)道最多。本文就禽腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)及FAdV-4的檢測方法進(jìn)行綜述，以期為該病的快速檢測和科學(xué)防控提供理論和技術(shù)支持。

1 禽腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)

禽腺病毒是一種無囊膜的雙股DNA病毒，病毒粒子直徑為70 nm～90 nm，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)，基因組大小為45 kb左右[3]。成熟的病毒由衣殼和芯髓組成[1]，其衣殼由主要結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體蛋白(Ⅱ)、五鄰體蛋白(Ⅲ)、纖突蛋白(Ⅳ)和次要結(jié)構(gòu)蛋白(Ⅲa、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ)組成。其中，六鄰體蛋白是含量最多的衣殼蛋白[1]。其芯髓包括病毒基因組及其相關(guān)蛋白Ⅴ、Ⅶ、mu蛋白和末端蛋白(TP)(圖1)[1-3]。

圖1 (A)禽腺病毒DNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖；(B)腺病毒衣殼結(jié)構(gòu)模式圖

FAdV的基因組分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩個(gè)部分；根據(jù)病毒DNA復(fù)制的起始時(shí)間不同，編碼區(qū)又分為早區(qū)(E)和晚區(qū)(L)，早區(qū)分為E1-E4 4個(gè)區(qū)，晚區(qū)分為L1-L5 5個(gè)區(qū)[4]。E1和E2均分為A和B兩部分，E1是病毒基因轉(zhuǎn)錄的起始因子；E2的主要功能是參與和調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制；E3的產(chǎn)物與病毒逃避宿主的免疫機(jī)制有關(guān)，是病毒的非必需區(qū)；E4表達(dá)產(chǎn)物與病毒復(fù)制、晚期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞活動(dòng)中止等活動(dòng)有關(guān)[5]。早期基因組的表達(dá)產(chǎn)物是編碼誘導(dǎo)病毒復(fù)制的必需蛋白E1、E2和E4，以及非必需蛋白E3；晚期基因組的表達(dá)產(chǎn)物主要是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、pⅧ、pⅥ、核心蛋白、核心蛋白1、DBP、Ⅳa2、52 ku、100 ku)[4-5]。

2 禽腺病毒的蛋白結(jié)構(gòu)

2.1 六鄰體hexon

六鄰體是一種偽六邊形三聚體，位于20面體衣殼的20個(gè)面上。衣殼中有240個(gè)六鄰體，根據(jù)它們所處的位置不同，將其分為H1、H2、H3和H4 4種六鄰體[6]。其中60個(gè)H1與12個(gè)頂端的五鄰體相關(guān)，也被稱為周圍六鄰體；其余的六鄰體在20面體的20個(gè)面上被分為“9組”又稱GONs(group-of-nine)，H2在雙軸上，H3在三軸上，其余的為H4。六鄰體蛋白是FAdV-4的主要衣殼蛋白，含有群、亞群和型特異性抗原決定簇，與致病性關(guān)系密切，是禽腺病毒分型的主要依據(jù)[6]。

2.2 五鄰體penton和纖突fiber

五鄰體蛋白在20面體的12個(gè)頂角，每個(gè)五鄰體蛋白上有一條(Ⅱ 群、Ⅲ 群禽腺病毒)或兩條(Ⅰ 群禽腺病毒)纖維突起，纖突頂端形成頭節(jié)區(qū)(knob)[4]。在Ⅰ 群禽腺病毒中，除血清1型腺病毒長纖突的長度是短纖突的4倍外，其余11個(gè)血清型兩條纖突的長度是相似的[4]。纖突蛋白由頭節(jié)區(qū)、桿區(qū)和尾區(qū)三部分構(gòu)成。頭節(jié)區(qū)是纖突蛋白的功能區(qū)，也是腺病毒與細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合的區(qū)域；桿區(qū)部分由多個(gè)重復(fù)序列構(gòu)成，具有型特異性；尾區(qū)是氨基酸保守區(qū)[7]。Fiber蛋白上有禽腺病毒的重要抗原，其中Fiber2蛋白具有主要的型特異性和亞屬特異性，能夠識(shí)別細(xì)胞受體并與之結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒感染，同時(shí)又能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)方面有重要作用[6]。五鄰體蛋白和纖突蛋白的功能彼此關(guān)聯(lián)，五鄰體與細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白作用，有助于腺病毒的侵入和內(nèi)化，纖突蛋白既能識(shí)別細(xì)胞膜上特異性受體引起感染，還可以阻斷大分子的合成，抑制病毒增殖，具有抗原性[3-4]。

2.3 五鄰體基質(zhì)penton base

五鄰體基質(zhì)在20面體衣殼頂端占據(jù)重要位置，并通過與相鄰的衣殼粒子、周圍六鄰體和Ⅲa相互作用，在穩(wěn)定衣殼方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。但其是衣殼中最薄弱的部位，對熱、胰蛋白酶、pH和離子強(qiáng)度變化敏感[9]。Penton base蛋白折疊成2個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為單個(gè)卷狀，一個(gè)為暴露在外部向上的插入域。向上的插入域含有高變環(huán)，高變環(huán)攜帶RGD序列，該序列在病毒粒子內(nèi)化過程中發(fā)揮重要作用[10]。

2.4 其他蛋白結(jié)構(gòu)

蛋白Ⅲa是腺病毒保守的基因之一，但是腺病毒在不同的物種之間有種、屬差異，存在于20面體的每個(gè)非對稱單元(asymmetric unit，AU)，總拷貝數(shù)為60[8,11]。其參與病毒的組裝和成熟，也可能在進(jìn)入細(xì)胞中起作用，因?yàn)樗遣《玖Ｗ幼钤玑尫诺某煞?，也是最不耐熱的衣殼成分之一[8]。多肽Ⅵ是一種多功能的蛋白質(zhì)，在腺病毒感染過程中發(fā)揮多種作用，在病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程中，其N端兩親性螺旋的改變使病毒易于進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[8]。RUX J J等認(rèn)為多肽Ⅵ在衣殼內(nèi)表面錨定5個(gè)六鄰體并將衣殼連接到核心[12]。多肽Ⅷ位于內(nèi)衣殼表面，與六鄰體相關(guān)并且以每個(gè)病毒粒子120個(gè)拷貝的形式存在[8]。多肽Ⅸ是位于AdV外衣殼的唯一次要外殼蛋白，在每個(gè)病毒粒子中存在240個(gè)拷貝，作為黏合劑使每個(gè)20面體中心的九個(gè)六鄰體聚合在一起[8-9]。Saban S D等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)Ⅸ的保守N端結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-39)是穩(wěn)定腺病毒衣殼所必需的。San M C等[13]通過研究發(fā)現(xiàn)IX可能在調(diào)節(jié)病毒趨向性和/或干擾免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。Gallardo J等[11]認(rèn)為蛋白質(zhì)Ⅵ是腺病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵因素。

3 血清4型禽腺病毒的血清學(xué)檢測方法

FAdV-4的血清學(xué)檢測方法包括病毒中和試驗(yàn)(virus neutralization test，VNT)、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(agar gel immunodiffusion test，AGIDT)、ELISA和免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence assay，IFA)。

3.1 病毒中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn)是根據(jù)病毒抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，失去感染能力建立的?？捎糜跈z測中和抗體的效價(jià)、鑒定病毒種型和病毒抗原分析。鄒開宇等[14]分別制備了4型、8a、8b和11型禽腺病毒的單因子血清進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，結(jié)果表明FAdV-4的血清除能中和其自身血清外還可中和FAdV-11。

3.2 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂凝膠內(nèi)擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體比例適當(dāng)時(shí)會(huì)出現(xiàn)一條白色的沉淀線，可通過肉眼觀察沉淀線的有無來確定試驗(yàn)結(jié)果。國紀(jì)壘等[15]制備了12個(gè)血清型的抗血清進(jìn)行雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，成功對其分離的4株病毒進(jìn)行了分型。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行染色，從而用酶標(biāo)儀或肉眼觀察直接判定結(jié)果，該法敏感性強(qiáng)、特異性高，是目前發(fā)展最快也是試劑盒應(yīng)用最廣的一項(xiàng)技術(shù)。粟元文等[16]將鴨源FAdV-4 hexon蛋白1 011 bp的基因表達(dá)的蛋白作為抗原進(jìn)行包被，建立了檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法，并對滅活疫苗免疫的鴨場和感染FAdV-4的鴨場進(jìn)行檢測，測得免疫合格率和感染陽性率分別為96.46%和99.46%，而未免疫和未感染FAdV-4的鴨場陽性感染率為0。馬洪超[17]將FAdV-4的hexon基因表達(dá)的蛋白作為包被抗原建立檢測 FAdV-4抗體的間接ELISA方法，對FAdV-4流行地區(qū)的100份血清進(jìn)行檢測的陽性率為25%，而瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的檢出率為21%。Rajasekhar R等[18]將FAdV-4六鄰體免疫顯性部分的737 bp克隆到pRSET載體，獲得重組蛋白，建立單血清稀釋ELISA和Dot-ELISA檢測方法，ELISA對臨床樣品檢測的滴度范圍為(3.76±0.04)log10～(4.431±0.12)log10，Dot-ELISA的檢測滴度范圍為(1.445±0.02)log10～(1.968±0.08)log10靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性均高于瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGIDT)。萬文妍[19]用FAdV-4 hexon(469-775aa)蛋白制備單克隆抗體，將其作為捕獲抗體建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法，最低可檢測0.1 μg的病毒；并且還用FAdV-4 fiber2蛋白C端頭節(jié)區(qū)作為診斷抗原建立了間接ELISA方法，對臨床50份樣品進(jìn)行檢測的結(jié)果與hexon特異性引物檢測的PCR結(jié)果一致。

田開月等[20]將中國流行株FAdV-4的fiber2編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到的fiber2蛋白作為包被抗原，建立了檢測FAdV-4抗體的間接ELISA方法，對臨床60份樣品的檢測結(jié)果與fiber2特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果一致。王萍[21]用FAdV-4毒株免疫小鼠，用間接ELISA方法鑒定出4株抗FAdV-4 Fiber2單克隆抗體，選用兩種建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法，對樣品的最低檢出率為12.5 ng/mL。Shao H X等[22-23]分別制備FAdV-4 fiber1和fiber2的兩種單克隆抗體，將其分別作為捕獲抗體和檢測抗體建立夾心ELISA和檢測FAdV-4的夾心ELISA，基于fiber1建立的夾心ELISA可有效檢測FAdV-4/10，而檢測FAdV-4的夾心ELISA的檢測限度與王萍[21]建立的夾心ELISA相同。值得注意的是，邵紅霞建立的基于fiber2 的夾心ELISA也與FAdV-10發(fā)生反應(yīng)，因?yàn)镕AdV-10和FAdV-4均屬于FAdV-C種，且具有相似的fiber2蛋白，這與Feichtner F等[24]使用基于fiber2的ELISA特異性檢測FAdV-4抗體時(shí)報(bào)告的結(jié)果一致。梅楠等[25]將FAdV-4 AQ強(qiáng)毒株的fiber-2基因截短體(112 bp-1 440 bp)表達(dá)的蛋白作為包被抗原，建立了檢測FAdV-4的ELISA檢測方法，對臨床13份樣品的檢測結(jié)果與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)完全吻合。

3.4 其他血清學(xué)檢測方法

Feichtner F等[10]基于重組FAdV纖突蛋白建立了6種不同血清型FAdV-1、-2、-4、-8a、-8b和-11的復(fù)合熒光微球免疫分析(fluorescent microsphere immunoassay，F(xiàn)MIA)是一種多重血清學(xué)診斷工具，可用于在單一反應(yīng)中同時(shí)檢測和區(qū)分相應(yīng)抗體。何子榮等[26]將FAdV-4 JSJ13毒株的整個(gè)fiber2基因表達(dá)的蛋白作為抗原建立I-ELISA檢測方法，該方法的靈敏性和特異性均為100%，可用于檢測雞體內(nèi)的FAdV-4抗體。萬文妍[19]根據(jù)hexon基因設(shè)計(jì)特異性RPA引物，建立了RPA-LFD(重組酶聚合酶擴(kuò)增-膠體金側(cè)向流試紙條)檢測方法，最低檢測限度為100拷貝，敏感性是常規(guī)PCR的100倍，可用肉眼觀察試驗(yàn)結(jié)果，適用于FAdV-4的現(xiàn)場診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

3.5 間接免疫熒光法

間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay，IFA)是將熒光染料與抗體連接，制成熒光抗體，當(dāng)抗原與抗體結(jié)合時(shí)，用熒光顯微鏡觀察即可對待檢抗原進(jìn)行定性和定位。國紀(jì)壘[15]制備了不同血清型的兔抗Ⅰ群FAV IgG，建立了Ⅰ群FAV的IFA，并對人工感染雞的各組織器官進(jìn)行檢測，研究了病毒在雞體內(nèi)的分布和組織嗜性。

4 血清4型禽腺病毒的分子生物學(xué)檢測方法

腺病毒分子生物學(xué)檢測方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和核酸探針技術(shù)[27]。

4.1 聚合酶鏈反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

PCR是檢測FAdV的主要方法，有高靈敏度、簡單性、選擇性和快速性，腺病毒的六鄰體基因由保守的基底區(qū)和高變環(huán)區(qū)組成，是檢測腺病毒的主要引物設(shè)計(jì)區(qū)[20]。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以通過熒光強(qiáng)度的變化對病毒進(jìn)行定量分析。Mase M等[28]建立了一種基于凝膠的常規(guī)PCR檢測方法，可用于同時(shí)檢測和區(qū)分FAdV1、2、4、8a和8b。Sharif N等[29]從六鄰體的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)了3對引物，可同時(shí)檢測FAdV1、FAdV-4和FAdV-11。劉琳等[30]根據(jù)FAdV-4hexon基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法，最低檢測量為50拷貝/μL。張?jiān)频さ萚31]在FAdV-4 hexon的保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成一對引物和TaqMan探針，建立FAdV-4 FQ-PCR檢測方法，最低檢出濃度為2.03拷貝/μL。羅洋洋等[32]根據(jù)FAdV-4的hexon基因設(shè)計(jì)了一對引物和TaqMan探針，對臨床50份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其建立的TaqMan熒光定量方法和普通PCR方法完全符合，并且熒光定量方法檢出的陽性樣本比普通PCR方法多5份。

4.2 限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)

限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用特異性內(nèi)切酶切割后，直接用凝膠電泳觀察結(jié)果。Raue A等[33]在六鄰體蛋白保守區(qū)構(gòu)建了兩對引物H1/H2和H3/H4， 高變區(qū)構(gòu)建了一對引物H5/H6，H1/H2和H3/H4擴(kuò)增的片段經(jīng)HaeⅡ酶切后，可以區(qū)分12種FAV參考毒株，并能區(qū)分FAV和EDS病毒。Mase M等[34]基于FAdV-4和FAdV-10的fiber1基因設(shè)計(jì)引物，用AluⅠ酶通過PCR-RFLP分析將心包積水綜合征FAdV-4 分離株與其他FAdV-4毒株區(qū)分開來。

4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是在目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，在恒溫條件下即可進(jìn)行反應(yīng)，可以通過肉眼觀察(焦磷酸鎂白色沉淀)判定結(jié)果。Xie Z X等[35]首次建立了LAMP方法用于檢測和鑒定 Ⅰ 群禽腺病毒株。Yuan X Y等[36]建立了一種對FAdV具有強(qiáng)特異性的LAMP實(shí)時(shí)濁度法，對FAdV-4具有特異性，檢測下限為75拷貝/μL。

4.4 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是用已知的DNA片段作為探針與未知核酸進(jìn)行雜交試驗(yàn)，根據(jù)雜交結(jié)果分析其同源性[15]。董婷婷[37]制備了地高辛標(biāo)記的禽腺病毒4型核酸探針，特異性良好，且不與1、2、8和12型的病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，最低檢出量為1 pg，可用于臨床診斷。

4.5 其他分子生物學(xué)檢測方法

現(xiàn)在發(fā)表最多的檢測腺病毒的方法是PCR，此外還有PCR與其他方法結(jié)合建立的檢測方法。Steer P R等[38]對六鄰體基因的3個(gè)區(qū)域進(jìn)行分析后，建立PCR 和高分辨率熔融(HRM)曲線分析的方法，其中Hexon L1 PCR產(chǎn)物的HRM曲線分析可區(qū)分所有FAdV血清型。Ganesh K等[39]通過PCR結(jié)合Southern雜交成功地從印度的噬血細(xì)胞綜合征(hemophagocytic syndrome,HPS)病例中檢測到FAdV-4。王利麗等[40]根據(jù)FAdV-4的penton基因設(shè)計(jì)引物，建立了檢測4型腺病毒的納米PCR方法(Nano PCR)，對FAdV-4的最低核酸檢出限度為54拷貝/μL，特異性較強(qiáng)，可用于臨床感染的檢測。

5 小結(jié)

HHS自發(fā)現(xiàn)以來給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，為了加強(qiáng)對該病的防控，使用快速有效的流行病學(xué)調(diào)查及檢測方法尤為重要。檢測FAdV-4的方法主要有血清學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法。PCR檢測是目前用的最多，也是國內(nèi)外學(xué)者研究最多的方法，大多數(shù)PCR檢測方法的引物設(shè)計(jì)是在hexon基因，也有在penton基因設(shè)計(jì)引物成功檢測4型禽腺病毒的報(bào)道[33]。由于real-time PCR可對病毒進(jìn)行定量，近年來也有real-time PCR對FAdV-4進(jìn)行定量的報(bào)道，其他與PCR相結(jié)合的檢測方法如PCR-RFLP，可將PCR產(chǎn)物用酶切之后直接進(jìn)行凝膠電泳觀察，根據(jù)產(chǎn)生的基因片段的大小進(jìn)行分型。LAMP靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、設(shè)備要求簡單，也受到了眾多學(xué)者的關(guān)注。ELISA具有操作簡單、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，常被用作血清流行病學(xué)調(diào)查的主要方法。近年來國內(nèi)外學(xué)者建立的ELISA檢測方法，大多都是基于禽腺病毒的衣殼蛋白，尤其是fiber蛋白，這與fiber蛋白能識(shí)別細(xì)胞受體并刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體介導(dǎo)免疫反應(yīng)的特性有關(guān)。同時(shí)，由于ELISA方法簡便、快速等優(yōu)勢，已成為臨床檢測禽腺病毒感染的一種重要檢測方法。