張 欣，侯佳琪，辛怡霖，李青云，唐 熙，潘康鎖，李引乾*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西西安 710016)

七清止瀉顆粒是在傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上，結(jié)合中醫(yī)理論、文獻(xiàn)調(diào)研和長(zhǎng)期臨床實(shí)踐等，對(duì)原散劑處方優(yōu)化改造而成。全方由黃芩、白頭翁、苦參、石榴皮、黃芪、藿香、山楂7味藥組成，具有清熱除濕、益腸止痢之功效，其中黃芩清熱解毒，對(duì)多種均有殺抑制作用，為君藥[1]；白頭翁和苦參在中獸藥性味與歸經(jīng)上和黃芩一致，具有清熱燥濕，涼血解毒，可增強(qiáng)黃芩的抗菌活性和抑菌效果，為臣藥[2-3]；石榴皮和黃芪性溫，提高雞的機(jī)體免疫能力，減少苦寒類(lèi)藥物對(duì)幼禽的刺激，為佐藥[4-5]；藿香芳香化濕、山楂清香微甜，能刺激胃液分泌幫助消化，調(diào)和藥性，促進(jìn)生長(zhǎng)，為使藥[6-7]。7味中藥相互配合，相輔相成，增加抑菌效果，兼顧清熱除濕，扶正祛邪，補(bǔ)中益氣的效果。

傳統(tǒng)中藥散劑一般成分復(fù)雜，含量均勻度差，在雞育雛過(guò)程中，因給藥方式單一，不適用現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖的需求，中藥顆粒劑具有改善適口性、用藥方便、可飲水給藥、便于儲(chǔ)藏及提高生物利用度等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(quality by design，QbD)理念[10]，本研究對(duì)原散劑進(jìn)行改造，優(yōu)化提取工藝及其顆粒劑成型工藝，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為七清止瀉顆粒的質(zhì)量控制試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 黃芩、白頭翁、苦參、石榴皮、黃芪、藿香、山楂，購(gòu)自楊陵華仁堂大藥房；黃芩苷對(duì)照品，批號(hào)201021，中檢計(jì)量生物有限公司產(chǎn)品，供含量測(cè)定用；高效硅膠G薄層板，青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；糊精，批號(hào)T14A10Z95117，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；蔗糖，批號(hào)201229，西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品；水為高純水，其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 A60多功能分體煎藥?kù)?，潮州市湖安區(qū)康雅順電器有限公司產(chǎn)品；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；UV-1200型，紫外分光光度儀，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 七清止瀉顆粒干浸膏的制備

1.2.1.1 工藝方法 將藥材按處方稱(chēng)重，黃芩15 g、白頭翁10 g、苦參10 g、石榴皮10 g、黃芪15 g、藿香10 g、山楂10 g，采用傳統(tǒng)水煎法，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究出藥物復(fù)方的最佳提取條件，其制法如下：按照處方稱(chēng)取藥品，粉碎成小塊，加適量的水進(jìn)行煎煮數(shù)次，煎煮完成后合并煎液，對(duì)煎液進(jìn)行過(guò)濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的濃縮藥液進(jìn)行減壓干燥制成干浸膏，浸膏研磨成粉，快速稱(chēng)重，備用[11]。

1.2.1.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝 利用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化探索。本試驗(yàn)根據(jù)前期文獻(xiàn)查閱[12]，選擇加水倍數(shù)(A)、提取次數(shù)(B)和提取時(shí)間(C)作為考察因素，以干浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素取3個(gè)水平，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 七清止瀉顆粒的提取正交因素水平

1.2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照藥方稱(chēng)取藥材，按上述篩選的工藝進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算干膏得率，觀察該工藝可行性。

1.2.2 七清止瀉顆粒的制粒工藝

1.2.2.1 輔料種類(lèi)的篩選 參考多種中藥顆粒劑的制粒方法，考慮經(jīng)濟(jì)性，選用加入適量的蔗糖和糊精作為輔料，以增加藥品顆粒的穩(wěn)定性和顆?？诟校靹?，選用適量乙醇作為潤(rùn)濕劑，制成顆粒，干燥，制成80 g，即得。

1.2.2.2 輔料用量的篩選 按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2020版二部附錄0106顆粒劑的要求，以及參考其他收錄顆粒劑的制法[3]，由1.2.1方法得干浸膏粉，加入含不同配比糊精和蔗糖的輔料，混勻，對(duì)混合藥粉進(jìn)行制成顆粒，干燥，制成80 g，觀察其形狀，對(duì)產(chǎn)物顆粒的成型性、休止角、溶化性和吸濕性進(jìn)行評(píng)分，4個(gè)指標(biāo)各占比25%，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.2.2.3 潤(rùn)濕劑濃度的篩選 將1.2.1方法得干浸膏粉，按照上述篩選的最佳輔料比例混勻，分別加入濃度為500、750、950 mL/L的乙醇作為潤(rùn)濕劑進(jìn)行制粒，以成型率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選最佳乙醇濃度。

1.2.3 七清止瀉顆粒試制的質(zhì)量控制 按照1.2.1和1.2.2的最佳提取和制粒工藝試制，制備210405、210406、210407、210408共4個(gè)批次進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.3.1 質(zhì)量檢查 按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2020版二部附錄0106顆粒劑要求分別對(duì)4個(gè)批次七清止瀉顆粒進(jìn)行性狀、粒度、水分和溶化性等考察[3]。

1.2.3.2 黃芩的薄層色譜鑒別 對(duì)七清止瀉顆粒君藥黃芩主要有效成分黃芩苷進(jìn)行薄層色譜鑒別，取本品210405、210406、210407、210408共4個(gè)批次各15 g，分別各加甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?，分別各加甲醇2 mL使溶解，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》2020版二部附錄0502薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)[3]。吸取上述5種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，黃芩苷對(duì)照品溶液點(diǎn)2次，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶3∶1∶2)為展開(kāi)劑，置展開(kāi)缸內(nèi)預(yù)飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10 mg/mL的氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.2.3.3 黃芩苷的含量測(cè)定

(1)對(duì)照品溶液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，于適量甲醇中溶解，經(jīng)超聲處理30 min，使黃芩苷完全溶解，再加入甲醇至刻度，搖勻，定容于50 mL棕色容量瓶中，即得對(duì)照品溶液(濃度200 μg/mL)。

(2)供試品溶液的制備:準(zhǔn)確稱(chēng)取本品0.5 g，適量甲醇中溶解，經(jīng)超聲處理30 min，使其完全溶解置50 mL量瓶中定容，再精密量取1 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度搖勻，即得供試品溶液(濃度200 μg/mL)。

(3)測(cè)定波長(zhǎng)的選擇:黃芩苷最大吸收波長(zhǎng)的選擇用可見(jiàn)紫外分光光度法分度計(jì)對(duì)黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行全波段掃描，以其最大吸收波長(zhǎng)作為黃芩苷的吸收波長(zhǎng)。取0.5 mL黃芩苷對(duì)照品溶液，再加入甲醇于10 mL容量瓶定容，得到10 μg/mL黃芩苷溶液，在230 nm～350 nm范圍內(nèi)將對(duì)照品與供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

(4)黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和精密度試驗(yàn):分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL黃芩苷對(duì)照品溶液，分別加入甲醇于10 mL容量瓶定容，得到2、4、6、8、10 μg/mL的黃芩苷溶液，以甲醇為空白試劑，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在其最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值OD，重復(fù)3次，取平均值，以黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品的濃度C為橫坐標(biāo)，測(cè)出的吸光度值OD為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(5)重復(fù)性試驗(yàn):按照供試品溶液的制備方法，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取批號(hào)為210405顆粒6份，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，依次進(jìn)樣分析，計(jì)算吸光度的RSD。

(6)加樣回收試驗(yàn):分別準(zhǔn)確稱(chēng)取批號(hào)為210405顆粒0.25 g，6份，分別精確加入10 mg黃芩苷對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，依次進(jìn)樣分析，計(jì)算吸光度回收率和RSD。

(7)樣品中黃芩苷含量測(cè)定:按供試品溶液的制備方法，分別準(zhǔn)確稱(chēng)取本品批號(hào)為210405、210406、210407、210408各0.5 g，制得供試品溶液，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，由回歸方程式計(jì)算出對(duì)應(yīng)濃度，計(jì)算樣品中黃芩苷含量。

2 結(jié)果

2.1 七清止瀉顆粒干浸膏的制備結(jié)果

2.1.1 提取正交試驗(yàn)結(jié)果 選用L9(34)正交表對(duì)七清止瀉顆粒的制粒工藝進(jìn)行考察，以干膏得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，七清止瀉顆粒的提取正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 七清止瀉顆粒的提取正交試驗(yàn)結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，以干膏得率為考察指標(biāo)，由表中極差大小顯示，各影響因素影響次序依次為C(提取次數(shù))>B(提取時(shí)間)>A(加水量)。分析極差最佳的提取工藝為A2B3C2，但提取次數(shù)過(guò)多會(huì)損失藥效，另從節(jié)約能源的角度，確定最終提取工藝為加10倍量水、提取2次、每次1.5 h。

2.1.2 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 稱(chēng)取處方藥品，按照1.2.1篩選的最佳工藝重復(fù)提取試驗(yàn)2次，稱(chēng)量產(chǎn)物干膏質(zhì)量，計(jì)算干膏率。

按照正交試驗(yàn)最佳提取工藝重復(fù)5次，RSD為2.74%(表3)，表明該提取工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性良好，為下一步制粒配方提供了依據(jù)。

2.2 七清止瀉顆粒的制粒工藝結(jié)果

2.2.1 輔料用量的篩選結(jié)果 將提取的干膏粉和含不同配比糊精和蔗糖的輔料混合制粒，綜合評(píng)價(jià)產(chǎn)物(表4)。直觀分析表明，當(dāng)加入糊精和蔗糖質(zhì)量比為7∶3的輔料，混合制成的顆粒容易制粒，穩(wěn)定性良好，不易吸濕，易于溶化，且流動(dòng)性好，有助于制成顆粒后分裝和貯存。

2.2.2 潤(rùn)濕劑濃度的篩選 對(duì)不同濃度的乙醇作為潤(rùn)濕劑制粒的成型率進(jìn)行試驗(yàn)，由試驗(yàn)可得，顆粒劑的成型率隨乙醇濃度的增加而增加；當(dāng)乙醇濃度為950 mL/L時(shí)，成型率最高，故確定950 mL/L的乙醇作為潤(rùn)濕劑。

2.3 七清止瀉顆粒試制的質(zhì)量控制結(jié)果

2.3.1 試制顆粒的質(zhì)量檢查 試驗(yàn)可得，4個(gè)批次均為棕色至棕褐色、干燥、大小形態(tài)均勻、色澤一致的顆粒劑，無(wú)吸潮、軟化、結(jié)塊等現(xiàn)象，粒度、水分、溶化性均符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》相關(guān)規(guī)定。

表3 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表4 七清止瀉顆粒輔料用量試驗(yàn)表

2.3.2 黃芩苷的薄層色譜鑒別 由結(jié)果可以看出，4個(gè)批次顆粒色譜中，在與黃芩苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜顯示相同顏色的斑點(diǎn)(圖1)。

L表示4個(gè)批次顆粒，依次為210405、210406、210407、210408 4個(gè)批次，S表示黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品

2.3.3 黃芩苷的含量測(cè)定

(1)測(cè)定波長(zhǎng)的選擇:經(jīng)試驗(yàn)，黃芩苷在278 nm 處有最大吸收，故選擇278 nm波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和精密度試驗(yàn):按1.2.3.3試驗(yàn)測(cè)定吸光度，各濃度吸光度(OD)的RSD≤0.72%，表明儀器精密度良好。進(jìn)行回歸分析得回歸方y(tǒng)=0.073x-0.025 5,R2=0.997，表明黃芩苷在2 μg/mL～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖2)。

圖2 黃芩苷吸收度線性關(guān)系圖

(3)重復(fù)性試驗(yàn):重復(fù)6次試驗(yàn)，以吸光度(OD)代入回歸方程，計(jì)算可得批號(hào)為210405的七清止瀉顆粒中黃芩苷平均含量為4.00%，RSD值為1.25%，表明本方法的重復(fù)性良好。

(4)加樣回收試驗(yàn):按照1.2.3.3試驗(yàn)方法下操作，精密稱(chēng)取批號(hào)為210405的七清止瀉顆粒0.25 g，共6份，精確加入黃芩苷對(duì)照品，按照樣品測(cè)定項(xiàng)下方法操作，結(jié)果見(jiàn)表5。試驗(yàn)結(jié)果可得，樣品中的平均加樣回收率為98.18%，RSD值為1.66%，表明本方法的加樣回收率良好。

(5)含量測(cè)定結(jié)果:按照1.2.3.3試驗(yàn)方法下操作，對(duì)4個(gè)批次七清止瀉顆粒進(jìn)行含量測(cè)定，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中黃芩苷含量，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，4個(gè)批次樣品中，其樣品中黃芩苷的最低含量為4.003%。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 4個(gè)批次七清止瀉顆粒含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

在提取工藝中，采用傳統(tǒng)水煎中藥提取方法，用正交試驗(yàn)探究最佳提取工藝，3個(gè)因素增加都會(huì)提高干浸膏得率，但相對(duì)增加幅度較小，且提取次數(shù)過(guò)多會(huì)損失藥效，考慮時(shí)間和低碳理念，最終確定提取工藝為加10倍量水、煎煮2次、每次1.5 h，合并煎液，對(duì)煎液進(jìn)行過(guò)濾，經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和減壓真空干燥制成干浸膏，研磨成粉，備用。

在制粒工藝中，中藥浸膏通常具有較強(qiáng)的吸濕性，實(shí)驗(yàn)室直接制粒有一定難度且穩(wěn)定性差，為降低其吸濕性，增加溶化率和流動(dòng)性，便于制粒和儲(chǔ)存，需要探索合適的輔料[13]。前期試驗(yàn)表明，七清止瀉顆粒中藥浸膏軟材黏度較大，無(wú)法直接制粒，直接加入輔料混合困難，制粒損耗也比較多，質(zhì)地較硬，顆粒不均勻，不符合顆粒劑的有關(guān)要求，后采用將浸膏干燥成藥粉和輔料混合，用適量的乙醇作為潤(rùn)濕劑，噴淋混合藥粉，均勻攪拌，再制粒。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，當(dāng)加入糊精和蔗糖質(zhì)量比為7∶3的輔料，混合制成80 g顆粒劑，制備顆粒效果最佳，工藝穩(wěn)定可靠，均符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》對(duì)中藥顆粒劑的要求。

由于實(shí)驗(yàn)室條件的局限性，傳統(tǒng)濕法手工制粒耗能過(guò)大，以及相對(duì)生產(chǎn)周期和暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，增加染菌的機(jī)會(huì)，下一步中試試驗(yàn)要明確進(jìn)行商業(yè)規(guī)?；纳a(chǎn)條件驗(yàn)證，進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝和工藝參數(shù)。

在質(zhì)量控制中,黃芩為處方中君藥，黃芩苷為黃芩主要活性成分之一，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗真菌及抗支原體作用[14]。中藥有效含量復(fù)雜，加上本藥由七味藥組成，已知化學(xué)物質(zhì)幾十種，因此選用藥物原料的時(shí)候應(yīng)嚴(yán)格控制質(zhì)量，再根據(jù)中藥的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)特性，結(jié)合中藥質(zhì)量標(biāo)志物的概念[15]，為了更有效控制七清止瀉顆粒的質(zhì)量，選擇君藥的有效成分黃芩苷進(jìn)行定性和定量監(jiān)控[16]。結(jié)果表明，4個(gè)批次樣品中，其樣品中黃芩苷的最低含量比為4.00%，根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》2020版二部規(guī)定，黃芩干燥品含黃芩苷不少于8%，結(jié)合處方，以每克樣品中各成分含量的85%作為七清止瀉顆粒含量測(cè)定的限度，因此將本品黃芩苷不少于3.40%作為后續(xù)中試試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

本研究對(duì)原散劑進(jìn)行處方和劑型優(yōu)化改造，制備成七清止瀉顆粒劑，研究考察了七清止瀉顆粒的最佳提取工藝，加入輔料種類(lèi)的比例用量以及潤(rùn)濕劑等進(jìn)行了優(yōu)化篩選，得到相應(yīng)的最佳制備工藝，并對(duì)該工藝進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證，建立了有關(guān)定性和定量的測(cè)定方法。該方法制得的七清止瀉顆粒成型性良好，穩(wěn)定不易吸濕，流動(dòng)性好，溶解性佳，制備工藝穩(wěn)定可靠，建立的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，能夠作為七清止瀉顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)藥理學(xué)研究和中試試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。