李 香，李青云，張 欣，唐 熙，侯佳琪，辛怡霖，李引乾*

(1.陜西省動物疫病預(yù)防控制中心，陜西西安 710016；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

近年來,我國奶牛養(yǎng)殖模式不斷轉(zhuǎn)型升級， 養(yǎng)殖技術(shù)水平不斷提高,全國奶牛養(yǎng)殖規(guī)?；室堰_(dá)50%,現(xiàn)代化發(fā)展成果顯著[1]。然而高產(chǎn)奶牛的繁殖性能卻呈現(xiàn)不斷下降的趨勢,具體表現(xiàn)為發(fā)情時間延后或發(fā)情表現(xiàn)弱、空懷天數(shù)增加、人工授精情期受胎率降低和產(chǎn)犢間隔延長等[2]。D-氯前列醇鈉(D-cloprostenol sodium)為人工合成的前列腺素(PGF2α)的類似物，能夠有效溶解功能性黃體和病理性黃體[3-4]，增強(qiáng)子宮平滑肌的收縮舒張節(jié)律的作用，可用于治療持久黃體、黃體囊腫而引起的不發(fā)情，同期發(fā)情、發(fā)情調(diào)控，引產(chǎn)、流產(chǎn)等分娩控制，母畜產(chǎn)后護(hù)理、產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎防治及促進(jìn)卵巢、子宮修復(fù)等疾病[5-7]。為全面了解D-氯前列醇鈉在奶牛體內(nèi)的藥動學(xué)特征，參照《獸藥試驗技術(shù)規(guī)范匯編·獸藥藥物動力學(xué)試驗技術(shù)規(guī)范》[8]，以肌肉注射給藥的方式，應(yīng)用高效液相法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定血清中D-氯前列醇鈉濃度[9]，用3P97軟件擬合藥時曲線，計算藥物動力學(xué)參數(shù)，以期為獸醫(yī)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 中國荷斯坦成年奶牛6頭，7歲～8歲，由楊陵區(qū)孟家寨奶牛養(yǎng)殖小區(qū)提供。試驗期間常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品與試劑 D-氯前列醇鈉注射液，寧波第二激素廠產(chǎn)品；乙腈，AR級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇、磷酸二氫鈉，AR級，天津市天力化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無水乙醇，AR級，四川西隴科學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 高效液相色譜儀，日本日立有限公司產(chǎn)品； Welchrom-C18色譜柱，美國Welch公司產(chǎn)品；1-15K低溫高速離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；80-2離心機(jī)，上海手術(shù)器械廠產(chǎn)品；漩渦振蕩器(QL-901)，其林貝爾儀器制造公司產(chǎn)品；DRAGON可調(diào)微量移液器，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 流動相為乙腈-2.4 mg/mL磷酸二氫鈉(35∶65，V/V)；流速1.5 mL/min；固定相為Welchrom-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫20 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；紫外檢測波長220 nm。

1.2.2 給藥方法及采血時間 每頭奶牛單劑量肌肉注射D-氯前列醇鈉0.15 mg。奶牛給藥前禁食12 h，自由飲水。每頭奶牛于給藥前采集空白對照血液5 mL。給藥后0.083 3、0.166 7、0.25、0.333 3、0.5、0.75、1、1.333 3、1.666 7、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、16、24 h各采血1次，每次采血5 mL。

1.2.3 血清制備 將采集的血液置于試管中，放置成斜面，放入37 ℃溫箱中作用30 min，再置4 ℃冰箱作用30 min，在轉(zhuǎn)速4 000 r/min下離心5 min，取上層血漿，置于-20 ℃冰箱保存，1周內(nèi)測定完畢。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取D-氯前列醇鈉標(biāo)準(zhǔn)品，分別以待測6只奶牛的空白血清作為稀釋液，稀釋配制成6組濃度分別為160、80、40、20、10、5.0、2.5、0 ng/mL的D-氯前列醇鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行HPLC測定。以D-氯前列醇鈉濃度(x)為橫坐標(biāo)，以D-氯前列醇鈉峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制奶?？瞻籽獫{中D-氯前列醇鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

1.2.5 精密度測定 取空白血漿3份，加入D-氯前列醇鈉標(biāo)準(zhǔn)品配制80、20、2.5 ng/mL高、中、低濃度的D-氯前列醇鈉血漿樣品，進(jìn)行HPLC檢測分析。分別于同日內(nèi)對每個濃度樣品測定3次，即得日內(nèi)精密度；1周內(nèi)隔天測定，共測定3次，即得日間精密度。

1.2.6 回收率測定 取空白血漿3份，加入D-氯前列醇鈉標(biāo)準(zhǔn)品配制2.5、20、80 ng/mL低、中、高濃度的D-氯前列醇鈉血漿樣品，進(jìn)行HPLC檢測分析。測定其保留時間，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血藥濃度，計算其回收率。

1.2.7 血清D-氯前列醇鈉質(zhì)量濃度測定 以1.2.4建立的血樣測定方法測定血藥濃度。

1.2.8 藥物動力學(xué)參數(shù)計算 用3P97軟件逐只奶牛擬合藥時曲線，計算藥時曲線及藥動學(xué)參數(shù)[10]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.2.4的測定結(jié)果，制作的1～6號奶牛的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如下：

1號奶牛：標(biāo)準(zhǔn)物的濃度x與OD值y進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=26 050x+3 215 336(R2=0.997)。由此可見，D-氯前列醇鈉在0～160 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(圖1)。

2號奶牛：標(biāo)準(zhǔn)物的濃度x與OD值y進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=26 121x+3 154 706 (R2=0.996)。由此可見，D-氯前列醇鈉在0～160 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

3號奶牛：標(biāo)準(zhǔn)物的濃度x與OD值y進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=25 708x+3 076 359 (R2=0.993)。由此可見，D-氯前列醇鈉在0～160 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

4號奶牛：標(biāo)準(zhǔn)物的濃度x與OD值y進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=25 694x+5 080 718 (R2=0.991)。由此可見，D-氯前列醇鈉在0～160 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

5號奶牛：標(biāo)準(zhǔn)物的濃度x與OD值y進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=26 579x+3 264 146 (R2=0.997)。由此可見，D-氯前列醇鈉在0～160 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

6號奶牛：標(biāo)準(zhǔn)物的濃度x與OD值y進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=26 214x+3 301 527 (R2=0.998)。由此可見，D-氯前列醇鈉在0～160 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖1 1號奶牛D-氯前列醇鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度的測定結(jié)果

測定結(jié)果(表1)表明，血漿中D-氯前列醇鈉高(80 ng/mL)、 中(20 ng/mL)低(2.5 ng/mL)3種濃度的日內(nèi)精密度和日間平均精密度均小于5%，符合要求，表明該方法穩(wěn)定，適合測定D-氯前列醇鈉血藥濃度。

表1 血漿中D-氯前列醇鈉的精密度測定結(jié)果

2.3 回收率的測定結(jié)果

測定結(jié)果(表2)表明，血漿中D-氯前列醇鈉高(80 ng/mL)、 中(20 ng/mL)低(2.5 ng/mL)3種濃度的回收率均大于96%，說明該方法準(zhǔn)確性較高，符合藥物動力學(xué)實驗試求。

表2 血漿中D-氯前列醇鈉的回收率測定結(jié)果

2.4 奶牛血清中D-氯前列醇鈉的實測值及血漿藥品檢測的色譜圖

奶?？瞻籽獫{樣品、D-氯前列醇鈉標(biāo)準(zhǔn)品以及待測血清樣品進(jìn)行HPLC測定，測定色譜圖分別見圖2A、圖2B和圖2C。測定結(jié)果顯示，D-氯前列醇鈉保留時間為3 min左右，D-氯前列醇鈉與血清基質(zhì)分離良好，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)對D-氯前列醇含量的測定無干擾，可以滿足測定需要。

A.奶?？瞻籽獫{；B.D-氯前列醇鈉標(biāo)準(zhǔn)品；C.實測血漿樣品

2.5 牛體內(nèi)血藥質(zhì)量濃度測定值

6頭奶牛血清中D-氯前列醇鈉濃度測定結(jié)果見表3。

2.6 藥-時曲線與藥物動力學(xué)參數(shù)

用3P97軟件擬合藥時曲線，計算藥物動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，單劑量快速肌肉注射D-氯前列醇鈉后，D-氯前列醇鈉的藥時數(shù)據(jù)均符合有吸收因素一室模型。根據(jù)藥-時曲線，計算D-氯前列醇鈉在奶牛體內(nèi)的藥物動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果見表4。由表4可知，D-氯前列醇鈉在奶牛體內(nèi)的藥物動力學(xué)參數(shù)消除相半衰期t1/2kel、藥-時曲線下面積AUC、消除速率常數(shù)Kel、峰濃度Cmax和達(dá)峰時間Tmax分別為(4.528±0.803)h、(581.400±216.838)ng·mL-1·h、(0.158±0.029)h-1、(71.172±32.440)ng·mL-1、(1.600±0.164)h。

表3 奶牛注射D-氯前列醇鈉的血藥質(zhì)量濃度

表4 D-氯前列醇鈉在奶牛體內(nèi)的藥物動力學(xué)參數(shù)

3 討論

采用高效液相色譜法，以乙腈-2.4 mg/mL磷酸二氫鈉(35∶65，V/V)為流動相，固定相為Welchrom-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長為220 nm，進(jìn)樣量為20 μL，測定D-氯前列醇鈉標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系良好，日內(nèi)精密度和日間精密度均小于5%，平均回收率為(97.830±0.925)%，由此可見該方法簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高?？捎糜谘簶悠稤-氯前列醇鈉含量的測定，為研究其在奶牛體內(nèi)藥物動力學(xué)研究提供可靠保證。

藥動學(xué)參數(shù)是反映藥物在體內(nèi)動態(tài)變化規(guī)律性的一些常數(shù)，是評價獸藥質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[11]。試驗結(jié)果顯示，奶牛肌肉注射后，D-氯前列醇鈉在奶牛體內(nèi)的藥代動力學(xué)配置符合有吸收因素一室模型特征[12]。消除相半衰期t1/2ke為(4.528±0.803)h，消除相半衰期t1/2kel是指血藥濃度下降一半所需時間，提示奶牛肌肉注射D-氯前列醇鈉后，藥物在體內(nèi)的消除比較快。消除速率常數(shù)Kel為(0.158±0.029 3)h-1，藥-時曲線下面積AUC為(581.400±216.838)ng·mL-1·h，藥時曲線下面積AUC是血藥濃度曲線對時間軸所包圍的面積，是評價藥物吸收程度的重要指標(biāo)，提示D-氯前列醇鈉在奶牛體內(nèi)吸收良好。峰濃度Cmax為7(1.172±32.440)ng·mL-1，達(dá)峰時間Tmax為(1.600±0.164)h，達(dá)峰時間Tmax反映藥物進(jìn)入體內(nèi)的速度提示肌肉注射藥物后，其吸收速度較快。

本研究利用高效液相色譜法考察了D-氯前列醇鈉在奶牛體內(nèi)的藥物動力學(xué)特征，奶牛肌注D-氯前列醇鈉注射液后，其吸收迅速，消除較快。研究結(jié)果為D-氯前列醇鈉的臨床使用提供了試驗依據(jù)。