速雪麗，秦毅斌，陸 穎，杜 琛，趙 武，何 穎，陳 櫻，韋祖樟，黃偉堅，歐陽康*

(1.廣西大學動物科學技術學院/廣西高校動物疫病預防與控制重點實驗室,廣西南寧 530005；2．廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530005；3．廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心，廣西南寧 530005；4．廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室，廣西南寧 530005)

豬德爾塔冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一種新興的豬腸道病毒，其感染哺乳仔豬后的臨床癥狀與其他腹瀉類病毒相似，主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水和死亡[1-2]。PDCoV是冠狀病毒科(Coronaviridae)、δ冠狀病毒屬(Deltacoronavirus)的成員，基因組大小約25.4 kb[3]。除了3′端的poly(A)尾外，主要編碼4種結構蛋白，即纖突(spike，S)蛋白、小膜(envelope，E)蛋白、膜(membrane，M)蛋白和核衣殼(nucleocapsid，N)蛋白，以及3種非結構蛋白NS6、NS7和NS7a[2]。其中，S蛋白含有1 159個或1 160個氨基酸殘基，主要參與宿主細胞吸附和融合[4]，同時誘導機體產生中和抗體，具有高度的免疫原性[5]。PDCoV最早于2012年被香港大學的Woo P C等[6]在臨床樣品中發(fā)現(xiàn)，但直到2014年在美國暴發(fā)后才開始受到關注[7]。隨后，PDCoV不僅在韓國、加拿大、日本、越南和泰國等地相繼暴發(fā)，中國內陸也多次報道了PDCoV疫情[8-9]。PDCoV可以有效感染不同來源的動物細胞[10]，但只在豬腎小管上皮細胞(LLC-PK細胞)和豬睪丸細胞(ST細胞)上具有良好的病毒感染和連續(xù)傳代效果，當培養(yǎng)基補充適宜濃度的外源胰蛋白酶時，PDCoV增殖能力顯著增強[9,11-21]。此外，PDCoV還可以感染牛犢、雛雞、雛鳥等動物并使其發(fā)生腹瀉，PDCoV表現(xiàn)出了跨物種傳播的能力[13]。近年來，廣西地區(qū)不斷出現(xiàn)PDCoV疫情，新生仔豬的感染率較高，但對PDCoV的相關研究較少。本研究對廣西地區(qū)20份PDCoV陽性樣品進行細胞傳代培養(yǎng)，通過細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)、RT-PCR/RT-qPCR鑒定、間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescent assay，IFA)、TCID50測定及S基因進行克隆測序分析等方法將分離病毒鑒定為PDCoV，為進一步開展PDCoV生物學特性研究、致病性研究和疫苗研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、病毒及抗體 LLC-PK細胞和PDCoV毒株CHN/GX/1468B/2017，由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所提供并保存于廣西大學動物傳染病與分子免疫學實驗室。PDCoV-N蛋白多克隆抗體按常規(guī)方法制備，并由廣西大學動物傳染病與分子免疫學實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清，康寧生命科學(吳江)有限公司產品；磷酸鹽緩沖液(DPBS)，博士德公司產品；AxyPrepTM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Mix，AxyPrep公司產品；2.5 mg/mL胰酶，Sigma公司產品；雙抗(青霉素-鏈霉素混合液)，BI公司產品；DNA標準DL 2 000、pMD18-T載體、dNTP mix，寶日醫(yī)生物(北京)有限公司產品；2×TaqMaster Mix，諾唯贊生物科技股份有限公司產品；膠回收試劑盒和質粒小量抽提試劑盒，Omega公司產品；大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞，廣西南寧康維生物科技有限公司產品；ProteinFind Goat anti-Rabbit IgG(H+L)，上海百賽生物技術股份有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀，ProFlex公司產品；LightCycler 96實時熒光定量PCR儀，Roche公司產品；微量移液槍，Eppendorf公司產品；生物安全柜，海爾公司產品；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2公司產品；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher Scientific公司產品；超凈工作臺，AIR TECH公司產品等。

1.1.4 引物 PDCoV的檢測引物參考Zhou X等[14]，即PDCoV-MF(5′-GGCAAATTATTGTTTTCATTGCGATCATATGGGCGC-3′)和PDCoV-MR(5′-CTTATACAGGCGAGCGTCACCGGCCTTTGAAG-3′)；S基因的擴增引物均參考Sun W等[8]，S全基因分為S1和S2進行擴增；即PDCoV-S1F(5′-ATGCAGAGAGCTCTATTGATTATGAC-3′)和PDCoV-S1R(5′-AACTTGCAAGTACTCCGTCTGAACG-3′)，PDCoV-S2F(5′-ATTTTCTCTTTCCGTTCAGACGGAG-3′)和PDCoV-S2R(5′-CTACCATTCCTTAAACTTAAAGGACG-3′)。PEDV、TGEV、PRoV檢測引物參考先前研究[15]。參考PDCoV毒株CH/GX/1468B/2017(MN025260)N基因設計熒光定量PCR檢測引物，即qPCR-NF(5′-AACCTCATGTTGCCAAACGC-3′)和qPCR-NR(5′-GCGTTGAAGGGGTCAACTCT-3′)，目的片段大小為112 bp。引物均由杰李生物(上海)技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣品 從廣西多個集約化養(yǎng)豬場收集了腹瀉仔豬的腸道內容物20份，經(jīng)RT-PCR檢測，腸內容物均為PDCoV陽性。用含200 mL/L甘油和1 000 U/mL青鏈霉素的已滅菌PBS對腸內容物進行5倍稀釋，振蕩混勻，然后在4 ℃、3 000 r/min下離心5 min，并用0.22 μm無菌過濾器過濾上清液并儲存于-80 ℃。

1.2.2 病毒分離與傳代 鋪滿90% LLC-PK細胞單層的6孔培養(yǎng)板接種500 μL過濾后的接種物，在37 ℃下吸附2 h后，棄液，然后補充含5 μg/mL胰蛋白酶的維持培養(yǎng)基。細胞在37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)，直到觀察到CPE。當CPE大于80%時，在-80 ℃反復凍融后收集病毒上清液并儲存以備后續(xù)傳代。按照上述方法將病毒連續(xù)盲傳20代。

1.2.3 RT-PCR/RT-qPCR檢測 分別提取第1、5、10、15、20代病毒的總RNA并反轉錄為cDNA。用PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的檢測引物對第10代病毒進行PCR檢測，PCR反應體系為12.5 μL，參考文獻[14,16]的方法，對分離病毒進行初步鑒定。用PDCoV熒光定量PCR檢測引物分別測定第1、5、10、15、20代病毒的病毒載量，熒光定量PCR反應體系為12.5 μL，反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，65 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s熔解；37 ℃ 30 s冷卻。

1.2.4 IFA試驗 將第10代病毒以MOI=0.1接種LLC-PK細胞，當開始出現(xiàn)明顯CPE時先用預冷的甲醇在-20 ℃固定15 min，然后用10 mg/mL BSA在37 ℃下封閉1 h，再與稀釋50倍的PDCoV N蛋白多克隆抗體在4 ℃作用12 h，最后與稀釋500倍的山羊抗兔IgG在37 ℃避光作用1 h，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.5 病毒滴度測定 根據(jù)Zhao Y等[9]描述的方法，分別對第1、5、10、15、20代病毒進行TCID50測定。當96孔培養(yǎng)板的單層LLC-PK細胞鋪滿至100%后，用含5 μg/mL胰蛋白酶的培養(yǎng)基將病毒稀釋為10-1～10-10共11個稀釋梯度，每個稀釋梯度接種8個孔，每孔接種100 μL，并設置陰性對照。然后在37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)并每日觀察CPE。當觀察到第4天時，按照Reed&Muench[9]的方法計算病毒TCID50。

1.2.6 S基因的擴增及序列分析 對第10代病毒的S1基因、S2基因進行基因克隆，方法參照文獻[8]，將成功構建的pMD18-T-S1、pMD18-T-S2重組質粒送至深圳華大基因生物公司進行序列測定。將獲得的S基因全序列分別與GenBank 110株國內外參考毒株進行序列比較和遺傳進化分析，其中88株參考毒株參考先前研究[15]，剩余參考毒株為近5年國內外流行毒株(表1)。使用DNA Star Lasergene Version 7中的MegAlign軟件的“W”算法對序列進行同源性分析，用MEGA6.0軟件中的“M”算法對序列進行序列比對，再使用“Neighbor-joining”方法以Bootstrap值為1 000個重復的方法構建遺傳進化樹，最后使用進化樹美化軟件iTOL(https://itol.embl.de/)制圖。

表1 參考毒株信息

2 結果

2.1 病毒分離結果

第2代病毒接種LLC-PK細胞60 h后開始出現(xiàn)CPE，第4代病毒接種LLC-PK細胞36 h內可觀察到細胞變圓、聚集并最終脫落的典型CPE(圖1B)；正常LLC-PK細胞狀態(tài)良好(圖1A)。結果表明，本研究從疑似PDCoV樣品中成功分離得到1株病毒，并將其命名為CHN/20GXNN-1/2020。

2.2 分離毒株RT-PCR鑒定結果

對10代病毒分別用PDCoV、PEDV、TGEV、PoRV的引物進行RT-PCR鑒定。結果顯示，在檢測的腸道病毒中只有PDCoV為陽性，其PCR產物條帶大小與陽性對照基本一致，符合預期結果，而PEDV、TGEV、PoRV這3種常見的腸道病毒均為陰性(圖2)。該結果初步表明，本研究分離的病毒為PDCoV。

A.陰性對照；B.CHN/20GXNN-1/2020接種LLC-PK細胞36 h的細胞病變

M.DNA 標準DL 2 000;1.陽性對照;2.第10代毒株;3.PEDV;4.TGEV;5.PoRV;6.陰性對照

2.3 分離毒株間接免疫熒光鑒定

第10代病毒樣品接種LLC-PK細胞24 h后可以觀察到明顯CPE，IFA試驗結果顯示，在產生CPE的部位可明顯觀察到針對PDCoV N蛋白的特異性熒光(圖3A)，而陰性對照無特異性熒光(圖3C)，結果表明分離病毒為PDCoV。

2.4 病毒滴度測定

為進一步研究PDCoV在LLC-PK細胞中的生長特點，每5代進行一次TCID50和RT-qPCR測定，持續(xù)到第20代(表2)。結果顯示，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020可以在LLC-PK細胞上產生穩(wěn)定病變，第5代與第1代相比，病毒滴度增加了約8 000倍，病毒載量增加了約20倍。在后續(xù)的傳代培養(yǎng)中病毒滴度略有增加，病毒載量呈2倍～5倍的增加并保持相對穩(wěn)定。結果表明，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020在LLC-PK細胞中可以增殖，該細胞系適用于PDCoV分離和增殖。

A、B.PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020接種LLC-PK細胞；C、D.陰性對照

表2 CHN/20GXNN-1/2020毒株低代次到高代次的復制情況

2.5 分離毒株S基因擴增

取第10代病毒進行S1和S2基因的擴增。結果顯示， S1基因(圖4A)和S2基因(圖4B)PCR產物條帶大小均與預期的條帶大小相符。最終獲得S基因全長序列3 480 bp(登錄號：OL441343)，進一步將分離毒株鑒定為PDCoV。

將PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020的S基因與最早報道的香港PDCoV毒株CHN/HKU15-44/2009毒株進行序列對比分析發(fā)現(xiàn)，S基因存在3 bp的缺失(153 bp-155 bp)，這與多數(shù)中國參考毒株相似。此外，S基因氨基酸存在23處突變，其中H46Y、D228G、I432V、T550I和T1 036P這5處氨基酸突變是PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020獨有的突變位點。同源性分析結果顯示，S基因核苷酸和氨基酸同源性分別為96.4%～98.6%和95.7%～99.0%，同源性最高的是CHN/SC/2015毒株。結果表明，與國內外PDCoV流行毒株相比，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與中國多數(shù)PDCoV流行毒株的同源性更高。

A.S1基因；B.S2基因；M.DNA 標準DL 2 000;第10代樣品

表3 PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與參考毒株的同源性

2.6 分離毒株S基因遺傳進化樹分析

基于PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020 S基因的全長序列構建遺傳進化樹(圖5)。S基因遺傳進化樹顯示，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與四川PDCoV毒株、PDCoV毒株CHN/HN-17/2017和PDCoV毒株CHN/HG/2017等在同一分支，這些毒株的S基因在153 bp～155 bp都存在3 bp的缺失。結果表明，與東南亞、美國、日本和韓國的PDCoV流行毒株相比，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與中國絕大多數(shù)PDCoV流行毒株有更密切的親緣關系。

●代表本研究分離毒株

3 討論

冠狀病毒(Coronaviruses，CoVs)可以分為4個屬(α、β、γ和δ)，宿主范圍比較廣泛，包括人、禽和哺乳動物，可導致宿主發(fā)生急性或慢性呼吸道、腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等相關疾病，致病率和死亡率較高[17]。PDCoV作為δ冠狀病毒屬主要成員，可感染禽類和哺乳動物，其感染哺乳仔豬后的主要臨床特征表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和脫水等，與其他豬腸道冠狀病毒的臨床癥狀極為相似，無法在臨床上進行區(qū)分，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[18-19]。此外，PDCoV常與其他腹瀉類病原發(fā)生混合感染，導致仔豬的致病率和死亡率增加。目前，對該病尚無疫苗產品，需要對其進行進一步研究。

目前，實驗室利用LLC-PK細胞、PK-15細胞及ST細胞成功分離出了PDCoV[16,20-23]，但病毒分離成功率非常低。病毒分離一般會被細胞種類、樣品的類型、樣品中的其他物質及培養(yǎng)基額外添加物等因素所影響[24]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，樣品質量是PDCoV成功分離的關鍵因素，如可能包含未知病毒其他病原體、病毒含量極少或樣品保存不當?shù)龋@些都是限制分離毒株重要因素[12,25]。外源性胰蛋白酶可以增強S蛋白的蛋白水解裂解作用以促進病毒進入宿主細胞，因此，添加胰蛋白酶可以促進冠狀病毒感染細胞[26]，在病毒分離過程中添加適宜濃度的胰蛋白酶可以有效提高PDCoV分離的成功率[27]。在本研究中，通過添加5 μg/mL胰蛋白酶中對疑似PDCoV的臨床腹瀉樣品進行病毒分離，最終成功分離鑒定出1株新的PDCoV，該毒株病毒滴度及病毒載量在傳代培養(yǎng)中可逐漸的增高。

冠狀病毒S蛋白的突變影響冠狀病毒致病機制和宿主嗜性[28]。本研究所獲得的PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020 S基因序列分析顯示存在3 bp(153 bp-155 bp)缺失，而我們前期獲得的廣西分離PDCoV毒株CHN/GX/1468B/2017 S基因卻不存在這種缺失[15]，這表明在廣西地區(qū)至少流行兩種類型的PDCoV毒株。目前，這種S基因缺失現(xiàn)象一般在中國分離毒株中較為多見，但在美國、日本、韓國或東南亞的分離毒株中卻很少出現(xiàn)，這可能與PDCoV毒株的流行區(qū)域特點密切相關，但這需要更多的分子流行病學數(shù)據(jù)進行論證。S基因的差異可能導致PDCoV毒株毒力的差異，但這種特定的缺失是否有利于病毒的復制和增強病毒毒力還難以定論。PDCoV的中和抗體區(qū)域主要位于S蛋白上，S蛋白中主要中和抗體的區(qū)域為CTD區(qū)域(aa 278-616)，目前已經(jīng)鑒定過的中和抗體區(qū)域為COE區(qū)域(aa499-638)[17,26]。PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020 S基因氨基酸有4處突變位于CTD區(qū)域，這些突變可能影響該區(qū)域中和抗體的功能，但還有待進一步研究。S基因的遺傳進化樹顯示，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020主要與四川PDCoV流行毒株、PDCoV毒株CHN/HN-17/2017和PDCoV毒株CHN/HG/2017等中國毒株處于同一進化分支，與東南亞、美國、日韓毒株處于不同的進化枝，表明病毒的流行在地域上存在差異性。這種差異與PDCoV結構基因在進化和傳播過程發(fā)生的突變密切相關，從而導致這些毒株的親緣關系發(fā)生變化。此外，PDCoV毒株CHN/20GXNN-1/2020與廣西地區(qū)多數(shù)流行毒株親緣關系較遠，說明廣西地區(qū)的流行毒株有不同的來源，這與廣西所處的地理位置有關。本研究確認了廣西豬群存在PDCoV感染并成功分離出1株新的PDCoV，為進一步開展PDCoV生物學特性研究、致病性研究和疫苗研制奠定了良好基礎。