文│南祥祝 徐晨 王輝 丁美娟 何召慶［兆豐華生物科技（南京）有限公司］

豬傳染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的一種豬的致死性呼吸道傳染病。該病在我國發(fā)病率常年居高不下，以出血性、壞死性胸膜肺炎為主要特征，任何年齡的豬均可發(fā)生，可引起豬的急性死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。該病的慢性和無癥狀感染是暴發(fā)流行的潛在因素，因此，早期診斷是防治該病成敗的關(guān)鍵。

一、疾病概況

2022年4月，浙江某豬場50～70千克的兩頭育肥豬不明原因突然死亡，一周后陸續(xù)有病豬出現(xiàn)，相繼經(jīng)產(chǎn)母豬、仔豬、保育豬均有病例發(fā)生，死亡病例也逐漸增多。病豬臨床表現(xiàn)為高熱，體溫高達(dá)41～42℃，精神沉郁，呼吸困難，食欲降低，耳、鼻、胸腹、陰部和四肢等部位皮膚發(fā)紺，口腔和鼻腔內(nèi)流出或存在帶血泡沫樣分泌物。豬場獸醫(yī)根據(jù)臨床癥狀分析，初步診斷為豬傳染性胸膜肺炎，經(jīng)氟苯尼考等抗生素藥物治療，未見好轉(zhuǎn)。

二、病理變化

剖檢病死豬可見敗血癥，肺腫脹，間質(zhì)增寬，有明顯血色膠樣液體；肺表面呈暗紅色，布滿凝血塊，切面易碎，病變明顯，伴有纖維素性滲出，肺與胸壁有明顯的黏連；喉頭、氣管、支氣管黏膜出血，充滿大量血樣泡沫；心包有淡黃色積液，與胸膜有粘連；胸腔內(nèi)有血樣液體；全身淋巴結(jié)腫大、充血。

三、實(shí)驗(yàn)室診斷

1.病料來源。胸膜肺炎放線桿菌感染豬只后，在病死豬扁桃體和肺中檢出率較高，支氣管分泌物、胸水中也能分離到病原。本次試驗(yàn)材料來源于現(xiàn)場解剖過程中按照無菌操作程序采集的扁桃體和肺樣本。

2.病原分離與形態(tài)觀察。NAD依賴性：將病料樣品接種于血瓊脂培養(yǎng)基表面，并用金黃色葡萄球菌在血瓊脂培養(yǎng)基表面交叉于病料接種區(qū)劃線，結(jié)束后將培養(yǎng)皿做好標(biāo)記，置于37℃含有5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)。在血瓊脂培養(yǎng)基上，病料樣本培養(yǎng)物靠近金黃色葡萄球菌處生長旺盛，遠(yuǎn)離后則變小甚至看不到菌落生長，說明該菌株生長對(duì)NAD有需要。

β型溶血：在血瓊脂培養(yǎng)基表面，樣本接種生長菌呈乳白色露珠狀，中間稍微隆起，具有β型溶血帶。

菌落形態(tài)觀察及鏡檢：將病料樣本接種于改良的TSA（含NAD因子）平板培養(yǎng)基上，結(jié)束后做標(biāo)記，同上述條件培養(yǎng)，24小時(shí)后觀察菌落生長狀態(tài)，然后挑取生長優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，相同條件培養(yǎng)24小時(shí)后觀察菌落特點(diǎn)并染色鏡檢。在改良的TSA（含NAD因子）平板培養(yǎng)基上，純化分離菌表現(xiàn)為半透明的露珠樣小菌落，菌落呈圓形突起、針尖大小、邊緣整齊、表面光滑濕潤。挑取純化后的分離菌落進(jìn)行革蘭氏染色，再置于顯微鏡下鏡檢，該菌為兩極著色的陰性、球狀小桿菌，少數(shù)呈絲狀。

3.PCR鑒定。

（1）APP鑒定。挑取純化培養(yǎng)后的菌株接種于改良的TSB（含有NAD因子）液體培養(yǎng)基，37℃搖菌8小時(shí)，然后利用試劑盒提取基因組作為DNA模板進(jìn)行PCR鑒定。

按參考文獻(xiàn)報(bào)道序列合成APP通用引物，設(shè)置反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增片段大小為422bp。結(jié)果顯示，在250～500bp之間出現(xiàn)一條明顯的擴(kuò)增條帶（如圖1），與目的條帶大小相符，表明該分離菌株為APP。

◎圖1 胸膜肺炎放線桿菌鑒定

（2）血清型鑒定。首先，合成各APP1～18血清型和nadV（NAD依賴性測定）引物，再利用上述提取的基因組作為模板，設(shè)置反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后在凝膠中觀察結(jié)果。結(jié)果如圖所示（圖2），3型和15型APP引物處擴(kuò)增出了明顯的條帶，3型引物擴(kuò)增出現(xiàn)的條帶與預(yù)期大?。?00bp）不相符，為非特異性條帶；在15型APP引物處擴(kuò)增到了明顯的特異性條帶，大小為1500bp左右，與預(yù)期條帶1595bp相符；在nadV處未擴(kuò)增出明顯條帶，為陰性結(jié)果，說明該菌株對(duì)NAD具有依賴性。鑒定結(jié)果表明，分離到的菌株屬于生物學(xué)Ⅰ型血清學(xué)15型APP。

◎圖2 豬胸膜肺炎放線桿菌血清型鑒定

四、藥物敏感性試驗(yàn)

紙片瓊脂擴(kuò)散法：挑取APP純化培養(yǎng)菌落涂抹接種于改良的TSA（含NAD因子）瓊脂平板培養(yǎng)基上，用無菌鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，稍用力壓實(shí)，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18小時(shí)后觀察結(jié)果（圖3）。

◎圖3 分離株APP藥物敏感試驗(yàn)

根據(jù)抑菌圈大小對(duì)照參考標(biāo)準(zhǔn)判定APP分離菌的耐藥性，此次分離菌對(duì)頭孢吡肟、阿莫西林、復(fù)方新諾明、頭孢噻肟4種抗生素表現(xiàn)出高度敏感，對(duì)多西環(huán)素和青霉素敏感度偏低，對(duì)慶大霉素、鏈霉素、氟苯尼考和環(huán)丙沙星4種抗生素耐藥。

五、結(jié)果

組織樣品經(jīng)血瓊脂平板和改良的TSA瓊脂（添加NAD因子）平板培養(yǎng)及革蘭氏染色鏡檢后分離到可疑菌落，經(jīng)形態(tài)觀察和染色鏡檢，其形態(tài)特征與APP表現(xiàn)一致，符合胸膜肺炎放線桿菌培養(yǎng)的典型特征，且對(duì)NAD因子具有依賴性，符合豬胸膜肺炎放線桿菌生物學(xué)Ⅰ型的特點(diǎn)。

將樣品進(jìn)行PCR鑒定，確定分離菌株為血清15型APP。

綜合上述結(jié)果，判定病料樣品中存在胸膜肺炎放線桿菌，且屬于生物學(xué)Ⅰ型血清學(xué)15型菌株，確診此次疫情為豬傳染性胸膜肺炎。

六、防治

疫情的單一防控措施會(huì)使效果下降，豬傳染性胸膜肺炎的防控需以綜合方法為主，這樣可以縮短治療時(shí)間，提高治療效果。

在不同地區(qū)、不同豬場、同一養(yǎng)豬場的不同時(shí)間和用藥習(xí)慣情況下，APP對(duì)藥物的耐受性存在一定的差異，因此，對(duì)分離的APP選擇適合的治療藥物時(shí)需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。經(jīng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，此次感染菌株對(duì)頭孢吡肟、阿莫西林、復(fù)方新諾明、頭孢噻肟等表現(xiàn)出了高度的敏感性，結(jié)合豬場實(shí)際雙方獸醫(yī)制定出了綜合治療方案。

清理圈舍，用消毒液對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒，每天2次。

對(duì)受威脅豬群進(jìn)行阿莫西林全群投藥控制疫情發(fā)展，同上調(diào)整營養(yǎng)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)抗病能力，并密切觀察豬群狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)疑似癥狀病例立即進(jìn)行藥物注射。

發(fā)病豬只的早期治療是降低損失的有效方法，建議發(fā)病豬盡早肌內(nèi)注射頭孢吡肟和阿莫西林，早晚各一次。

全場采取以上措施3天后無新發(fā)病例出現(xiàn)，疫情得到控制。發(fā)病豬只一般在2～3天治療后可基本痊愈，鞏固治療1～2次，1次/天，均未再發(fā)。

七、討論

豬胸膜肺炎放線桿菌主要定植于豬呼吸道，通過空氣傳播感染，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原。該病原也可通過豬只直接接觸或短距離飛沫傳播，運(yùn)輸車輛、飼養(yǎng)工具等被污染，飼養(yǎng)人員大面積流動(dòng)、鼠和鳥類的傳播使PCP在某些地域呈現(xiàn)流行性，此外，患有基礎(chǔ)性疾病的豬群對(duì)APP的易感性增強(qiáng)。

用PCR的方法檢測APP，不僅具有敏感度高、特異性強(qiáng)、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，還可同時(shí)檢測多個(gè)樣品，是目前實(shí)驗(yàn)室中常用的APP檢測方法。本次針對(duì)患病豬群的診斷，首先是結(jié)合臨床癥狀和病理變化進(jìn)行綜合分析，充分掌握豬群發(fā)病的關(guān)鍵信息，確定診斷方向，然后利用實(shí)驗(yàn)室PCR技術(shù)得出確診結(jié)果，不但準(zhǔn)確性高，還極大縮短了診治時(shí)間，對(duì)早期確診和治療具有十分重要的意義。

胸膜肺炎放線桿菌血清型眾多，已有報(bào)導(dǎo)就有18個(gè)，不同國家和地區(qū)的流行存在較大差異。在本次實(shí)驗(yàn)室診斷過程中，對(duì)感染病原進(jìn)行了血清型鑒定，結(jié)果表明，在病料中分離出的APP屬于生物學(xué)Ⅰ型血清學(xué)15型菌株，該型菌株并非主流流行的血清型，因APP各血清型之間的交互免疫力比較差，本次診斷對(duì)APP各血清型流行的動(dòng)態(tài)監(jiān)測和相關(guān)疫苗研發(fā)具有重要意義。