安 睿,Davide Fornacca,李政強(qiáng),佘 容,3,4,楊曉燕,3,4
(1.大理大學(xué)天然抗氧劑與抗氧化炎癥研究院,云南大理 671003;2.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院,云南大理 671003;3.大理大學(xué)三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊,云南大理 671003;4.中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心,云南大理 671003)
氧化應(yīng)激(Oxidative Stress,OS)指機(jī)體在發(fā)生各種生化反應(yīng)過程中,細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生氧自由基,以及隨后由氧自由基(ROS)引發(fā)一系列從細(xì)胞到全身的生理學(xué)和病理學(xué)反應(yīng)過程[1]。ROS 的產(chǎn)生無法避免且會引起機(jī)體早期動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓、病理性肥胖與相關(guān)并發(fā)癥[2-4]。抗氧化劑是可清除活性氧(ROS)及其前體,參與修復(fù)細(xì)胞損傷的化合物[5-6],對預(yù)防某些慢性疾病如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或炎癥具有潛在的作用[7-8]。因此,人們對富含抗氧化劑的食物產(chǎn)生了濃厚的興趣。
核桃(Juglans regiaL)是世界上最古老的人類種植的樹生干果之一[9],深受消費(fèi)者喜愛。云南不僅核桃種植面積位居全國之首[10],所產(chǎn)核桃也因高海拔種植的特點(diǎn)而具有極高的營養(yǎng)成分[11],被譽(yù)為世界核桃家族中的上品[12]。云南核桃產(chǎn)業(yè)更是成為云南省推進(jìn)發(fā)展高原特色現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和打造世界一流“綠色食品牌”的重點(diǎn)項目之一[13]。目前云南核桃的經(jīng)濟(jì)價值體現(xiàn)形式相對單一,主要以直接售賣核桃堅果為主,在深加工方面也僅局限于核桃飲料和核桃油[14],鮮見其他深加工的報道。近年來,隨著種植面積的擴(kuò)大,產(chǎn)量的提高,核桃的經(jīng)濟(jì)價值急劇下滑,嚴(yán)重影響種植戶的經(jīng)濟(jì)收入,甚至已有種植戶計劃移除核桃植株,改種其他作物。在此背景下,積極開發(fā)核桃的其他經(jīng)濟(jì)價值迫在眉睫。研究表明,核桃較其他堅果具有更強(qiáng)的抗氧化能力[15-16],核桃青皮最近也被證明具有較強(qiáng)的抗氧化活性[17]。但是核桃青皮不能直接食用[18],其有效成分的利用需借助一定的加工手段轉(zhuǎn)化。泡酒是中國酒類傳統(tǒng)加工工藝,能有效提取浸泡材料中的養(yǎng)生、保健成分,很多中醫(yī)藥方均采用以酒治病,歷史已不下百年[19]。核桃的抗氧化能力主要源于酚類化合物[20],酒中所含的乙醇是一種良好的酚類物質(zhì)萃取劑,能使核桃青皮里的抗氧化物質(zhì)被充分溶解[21],因此,泡酒可以作為核桃的開發(fā)途徑。
本研究以云南省的硬核期青皮核桃為主要原材料,參照歐洲核桃酒的制作工藝[22]釀造核桃酒,并對所得核桃酒進(jìn)行ABTS 自由基清除能力、FRAP 總氧化還原能力和羥自由基清除能力的測定,評估核桃泡酒的抗氧化能力,為核桃產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)化探索更多有價值的可行途徑,為核桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供參考。
1.1.1 核桃酒的制備
參照歐洲核桃酒釀造配方,并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,具體如表1所示。
表1 核桃酒的配料表
按照配比,將取自云南的青皮核桃對半切,與其他配料一起放至提前備好的大麥酒中,密封,標(biāo)記,置陽光下保存4 周,4 周后,用無菌紗布將配料從酒中過濾出來,核桃酒放置黑暗處儲存,備用。未添加配料的純大麥酒為對照。
1.1.2 試劑及耗材
ABTS 試劑:以ABTS(7 mmol/L)+K2S2O8(4.9 mmol/L,過硫酸鉀)按1∶1 的體積比混合,避光儲存12~16 h 后,用無水乙醇稀釋,搖勻,靜置5 min,734 nm 處測吸光度為0.7(±0.02),即得ABTS工作液。
FRAP 試劑:0.3 mol/L 醋酸緩沖液(pH3.6),稱取0.364 g 無水醋酸鈉,加入3.2 mL 冰乙酸,用RO水定容至200 mL,1 mol/L HCL調(diào)節(jié)pH3.6。
10 mmol/L TPTZ 溶液:稱取0.078 g TPTZ,用40 mm 鹽酸溶液稀釋定容至25 mL。將上述3 種溶液依次以10∶1∶1的比例混合即得(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
1.1.3 儀器設(shè)備
艾柯實驗室超純水機(jī)(AKDL-II-24),成都艾柯水處理設(shè)備有限公司;超聲波清洗機(jī)(SB25-12DTD),寧波新芝生物科技股份有限公司;電熱恒溫水浴鍋(HWS-26),上海-恒科學(xué)儀器有限公司;可見光分光光度計(722N),上海菁華科技儀器有限公司;比色皿(751/722 型),天錫新竹光學(xué)儀器有限公司;電子天平(PX224ZH),奧豪斯儀器有限公司。
1.2.1 ABTS自由基清除能力測定
ABTS 自由基清除率的測定參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行,用無水乙醇(水提取物用水)將樣品提取物配置成不同濃度,備用。
量取Vit C 母液,用無水乙醇梯度稀釋成與樣品相同的濃度備用。將不同濃度的樣品和Vit C 分別與ABTS 工作液各2 mL 混勻,每組六個平行,一個對照。避光反應(yīng)6 min,立刻吸取混勻的液體至比色皿中,用溶劑調(diào)零,于734 nm 處測定各管吸光度值并記錄。計算ABTS自由基清除率:
ABTS自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%
式中:Ai為樣品溶液反應(yīng)吸光度;Aj為樣品溶液加入無水乙醇(水提取物用水)的吸光度;A0為甲醇代替樣品反應(yīng)吸光度。
1.2.2 FRAP總還原能力測定
FRAP 總還原能力的測定參照文獻(xiàn)[24]進(jìn)行,用無水乙醇(水提取物用水)將樣品提取物配制成不同濃度,備用。取不同濃度的樣品與FRAP 工作液各2 mL,混勻,37 ℃水浴10 min,于593 nm 處測定吸光度值。每組設(shè)六個平行,一個空白對照。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:用去離子水配制FeSO4溶液(濃度梯度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.6 mmol/L),按照上述方法測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣本總氧化還原能力計算:以1.0 mmol/L Fe-SO4為標(biāo)準(zhǔn),樣品氧化還原能力以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示,計算公式如下:
式中:A1為樣品管的吸光度;A2為空白對照管的吸光度;A0為1 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。
1.2.3 羥自由基清除能力測定
樣品管:取2 mL 不同濃度的樣品,分別加入6 mmol/L FeSO4與6 mmol/L H2O2工作液各2 mL,混勻,靜置10 min,再加入2 mL 的6 mmol/L 水楊酸,混勻放置30 min,并于510 nm 處測定吸光度值。每組設(shè)六個平行。
對照管:取2 mL 不同濃度的樣品,分別加入6 mmol/L FeSO4與6 mmol/L H2O2工作液各2 mL,混勻,靜置10 min,再加入2 mL 的去離子水(RO水),混勻放置30 min,并于510 nm 處測定吸光度值并記錄。
計算羥自由基清除率:
式中:Ai為樣品溶液反應(yīng)吸光度;Aj為樣品對照溶液的吸光度;A0為去離子水代替樣品反應(yīng)吸光度。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理
半抑制量(IC50):根據(jù)提取物羥自由基/ABTS自由基清除率與濃度曲線所得回歸方程,計算得到5 種核桃酒將自由基原始質(zhì)量濃度減少至50 %時的使用濃度(IC50)。
比活性:即提取物與Vit C IC50的比值。比活性越大,代表其自由基清除能力越強(qiáng)。
同時,采用Origin pro 2021 軟件繪制提取物濃度與抗氧化活性關(guān)系圖;SPSS 20.0 軟件計算不同提取物的IC50值;使用Omic Share 云分析工具(https://www.omicshare.com)對不同種類核桃酒的IC50值進(jìn)行多組檢驗分析。
2.1.1 樣品ABTS自由基清除能力
大麥酒對ABTS 自由基的清除能力最高僅為15.27%。
5 種核桃酒對ABTS 自由基清除率除核桃酒2、核桃酒4 外,其余均隨著樣品稀釋倍數(shù)的升高而降低,且形成較良好的線性關(guān)系。因曲線擬合較為復(fù)雜,難以判斷5 種核桃酒對ABTS 自由基清除能力的強(qiáng)弱(圖1)。
圖1 核桃酒對ABTS自由基的清除活性
2.1.2 核桃酒ABTS 自由基清除率IC50多組檢驗分析
根據(jù)不同樣本IC50值可發(fā)現(xiàn),5 種核桃酒的總氧化還原能力的強(qiáng)弱依次為:核桃酒2>核桃酒4>核桃酒1>核桃酒5>核桃酒3。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,核桃酒1、核桃酒2、核桃酒4、核桃酒5 的ABTS 自由基清除能力無顯著差異,但核桃酒2 與核桃酒3具有顯著差異(P<0.01)(圖2)。
圖2 ABTS自由基清除率IC50多組檢驗分析
2.2.1 FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示,F(xiàn)eSO4的濃度范圍在0.1~1.6 mmol/L 時,吸光度隨著FeSO4濃度的增加而增加,呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(y=0.6012x+0.0429,R2=0.9937),見圖3。
圖3 FRAP實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.2.2 樣品總氧化還原能力
大麥酒的總氧化還原能力最高為11.76,僅為核桃酒總氧化還原能力的一半。
5 種核桃酒在總氧化還原能力上無顯著差異,且呈良好的線性關(guān)系。5 種核桃酒均在稀釋150 倍后,還原能力趨于穩(wěn)定。僅基于擬合曲線難以判斷5種核桃酒總氧化還原能力的強(qiáng)弱,見圖4。
圖4 核桃酒FRAP總氧化還原能力
2.2.3 核桃酒總氧化還原能力的多組檢驗分析
根據(jù)不同樣本IC50值可發(fā)現(xiàn),5 種核桃酒的總氧化還原能力的強(qiáng)弱依次為:核桃酒1>核桃酒4>核桃酒5>核桃酒2>核桃酒3。統(tǒng)計分析顯示,核桃酒2、核桃酒3、核桃酒4、核桃酒5 的總氧化還原能力無顯著差異,但核桃酒1 顯著高于核桃酒2、核桃酒3(P<0.05),見圖5。
圖5 總氧化還原能力的多組檢驗分析
2.3.1 樣品羥自由基清除能力
大麥酒對羥自由基的清除能力最高為41.13%。
5 種核桃酒因曲線擬合較為聚集,難以判斷對羥自由基清除能力的強(qiáng)弱。但部分種類的核桃酒稀釋400 倍以上時,其清除自由基的能力明顯下降,見圖6。
圖6 核桃酒對羥自由基的清除活性
2.3.2 核桃酒羥自由基清除率測定的多組檢驗分析
對5 種核桃酒羥自由基清除率的IC50值進(jìn)行比較可發(fā)現(xiàn),5 種核桃酒對ABTS 自由基清除能力的強(qiáng)弱為:核桃酒1>核桃酒4>核桃酒2>核桃酒5>核桃酒3。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,核桃酒1、核桃酒2、核桃酒4、核桃酒5 的總氧化還原能力無顯著差異,但核桃酒3 與核桃酒1、核桃酒4 具有顯著差異(P<0.05),見圖7。
圖7 羥自由基清除率測定的多組檢驗分析
本實驗使用3 種不同方法對5 種核桃酒的體外抗氧化活性進(jìn)行了評價,實驗結(jié)果顯示:添加了青皮核桃等配料的核桃酒,不僅相較于原料純大麥酒來說,具有更強(qiáng)的抗氧化能力,而且較核桃而言,也發(fā)揮出了更大的抗氧化活性[26]。5 種核桃酒之間存在抗氧化能力的強(qiáng)弱差異,其中核桃酒1 的FRAP還原能力與羥自由基清除能力最強(qiáng),核桃酒2 的ABTS 自由基清除能力最強(qiáng),核桃酒4 的所有指標(biāo)均處第二位,核桃酒3 的所有指標(biāo)整體評估較弱。核桃酒1、核桃酒2 與核桃酒3 配方相同,主要的差異是核桃酒1 和2 的青皮核桃含量比核桃酒3 高出50%,說明青皮核桃對總體抗氧化能力的評估起主要影響。
研究表明傳統(tǒng)香料也具有抗氧化活性[27]。在本研究中,核桃酒2與核桃酒1的青皮核桃含量一致,但核桃酒2 的香草、肉豆蔻的含量是核桃酒1 的50%,肉桂含量為70%,原則上來說,核桃酒2的抗氧化活性應(yīng)低于1,但2 對ABTS 的自由基清除能力高于1,說明香料添加過度也許會抑制ABTS 自由基清除能力。
在本研究中,添加的糖類存在差異,這也會影響核桃酒的抗氧化能力。核桃酒4 的三個抗氧化指標(biāo),在5 組樣本中均排名第二,分析其配料發(fā)現(xiàn),其青皮核桃含量低于2,輔料中,除糖類為冰糖,不同于2的白糖外,其他成分與核桃酒2接近,但是核桃酒4 的FRAP 還原能力與羥自由基清除能力高于2,這說明在提高核桃酒抗氧化活性方面,冰糖優(yōu)于白糖。通過核桃酒4 與核桃酒5 的比較發(fā)現(xiàn),核桃酒4 中青皮核桃的含量顯著低于核桃酒5,但核桃酒4 在各項指標(biāo)評定中均優(yōu)于核桃酒5,說明添加冰糖更有利于提升核桃泡酒的抗氧化能力,具體原因有待分析。
綜上所述,以青皮核桃為主料制作的核桃酒具有抗氧化能力,可以作為核桃產(chǎn)業(yè)的附加產(chǎn)品進(jìn)一步開發(fā)利用。但是因添加青皮核桃的量以及輔料種類與含量的不同,其抗氧化活性存在顯著差異,未來應(yīng)進(jìn)一步在保證核桃酒風(fēng)味的前提下,調(diào)整優(yōu)化主輔料配方,發(fā)揮出核桃最大的利用價值。