安 睿，Davide Fornacca，李政強，佘 容，3，4，楊曉燕，3，4

（1.大理大學(xué)天然抗氧劑與抗氧化炎癥研究院，云南大理 671003；2.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；3.大理大學(xué)三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團隊，云南大理 671003；4.中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南大理 671003）

氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）指機體在發(fā)生各種生化反應(yīng)過程中，細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生氧自由基，以及隨后由氧自由基（ROS）引發(fā)一系列從細(xì)胞到全身的生理學(xué)和病理學(xué)反應(yīng)過程[1]。ROS 的產(chǎn)生無法避免且會引起機體早期動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓、病理性肥胖與相關(guān)并發(fā)癥[2-4]。抗氧化劑是可清除活性氧（ROS）及其前體，參與修復(fù)細(xì)胞損傷的化合物[5-6]，對預(yù)防某些慢性疾病如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或炎癥具有潛在的作用[7-8]。因此，人們對富含抗氧化劑的食物產(chǎn)生了濃厚的興趣。

核桃（Juglans regiaL）是世界上最古老的人類種植的樹生干果之一[9]，深受消費者喜愛。云南不僅核桃種植面積位居全國之首[10]，所產(chǎn)核桃也因高海拔種植的特點而具有極高的營養(yǎng)成分[11]，被譽為世界核桃家族中的上品[12]。云南核桃產(chǎn)業(yè)更是成為云南省推進(jìn)發(fā)展高原特色現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和打造世界一流“綠色食品牌”的重點項目之一[13]。目前云南核桃的經(jīng)濟價值體現(xiàn)形式相對單一，主要以直接售賣核桃堅果為主，在深加工方面也僅局限于核桃飲料和核桃油[14]，鮮見其他深加工的報道。近年來，隨著種植面積的擴大，產(chǎn)量的提高，核桃的經(jīng)濟價值急劇下滑，嚴(yán)重影響種植戶的經(jīng)濟收入，甚至已有種植戶計劃移除核桃植株，改種其他作物。在此背景下，積極開發(fā)核桃的其他經(jīng)濟價值迫在眉睫。研究表明，核桃較其他堅果具有更強的抗氧化能力[15-16]，核桃青皮最近也被證明具有較強的抗氧化活性[17]。但是核桃青皮不能直接食用[18]，其有效成分的利用需借助一定的加工手段轉(zhuǎn)化。泡酒是中國酒類傳統(tǒng)加工工藝，能有效提取浸泡材料中的養(yǎng)生、保健成分，很多中醫(yī)藥方均采用以酒治病，歷史已不下百年[19]。核桃的抗氧化能力主要源于酚類化合物[20]，酒中所含的乙醇是一種良好的酚類物質(zhì)萃取劑，能使核桃青皮里的抗氧化物質(zhì)被充分溶解[21]，因此，泡酒可以作為核桃的開發(fā)途徑。

本研究以云南省的硬核期青皮核桃為主要原材料，參照歐洲核桃酒的制作工藝[22]釀造核桃酒，并對所得核桃酒進(jìn)行ABTS 自由基清除能力、FRAP 總氧化還原能力和羥自由基清除能力的測定，評估核桃泡酒的抗氧化能力，為核桃產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟轉(zhuǎn)化探索更多有價值的可行途徑，為核桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 核桃酒的制備

參照歐洲核桃酒釀造配方，并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，具體如表1所示。

表1 核桃酒的配料表

按照配比，將取自云南的青皮核桃對半切，與其他配料一起放至提前備好的大麥酒中，密封，標(biāo)記，置陽光下保存4 周，4 周后，用無菌紗布將配料從酒中過濾出來，核桃酒放置黑暗處儲存，備用。未添加配料的純大麥酒為對照。

1.1.2 試劑及耗材

ABTS 試劑：以ABTS(7 mmol/L)+K2S2O8（4.9 mmol/L，過硫酸鉀）按1∶1 的體積比混合，避光儲存12～16 h 后，用無水乙醇稀釋，搖勻，靜置5 min，734 nm 處測吸光度為0.7（±0.02），即得ABTS工作液。

FRAP 試劑：0.3 mol/L 醋酸緩沖液（pH3.6），稱取0.364 g 無水醋酸鈉，加入3.2 mL 冰乙酸，用RO水定容至200 mL，1 mol/L HCL調(diào)節(jié)pH3.6。

10 mmol/L TPTZ 溶液：稱取0.078 g TPTZ，用40 mm 鹽酸溶液稀釋定容至25 mL。將上述3 種溶液依次以10∶1∶1的比例混合即得（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.1.3 儀器設(shè)備

艾柯實驗室超純水機（AKDL-II-24），成都艾柯水處理設(shè)備有限公司；超聲波清洗機（SB25-12DTD），寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS-26），上海-恒科學(xué)儀器有限公司；可見光分光光度計（722N），上海菁華科技儀器有限公司；比色皿（751/722 型），天錫新竹光學(xué)儀器有限公司；電子天平（PX224ZH），奧豪斯儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 ABTS自由基清除能力測定

ABTS 自由基清除率的測定參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行，用無水乙醇（水提取物用水）將樣品提取物配置成不同濃度，備用。

量取Vit C 母液，用無水乙醇梯度稀釋成與樣品相同的濃度備用。將不同濃度的樣品和Vit C 分別與ABTS 工作液各2 mL 混勻，每組六個平行，一個對照。避光反應(yīng)6 min，立刻吸取混勻的液體至比色皿中，用溶劑調(diào)零，于734 nm 處測定各管吸光度值并記錄。計算ABTS自由基清除率：

ABTS自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：Ai為樣品溶液反應(yīng)吸光度；Aj為樣品溶液加入無水乙醇（水提取物用水）的吸光度；A0為甲醇代替樣品反應(yīng)吸光度。

1.2.2 FRAP總還原能力測定

FRAP 總還原能力的測定參照文獻(xiàn)[24]進(jìn)行，用無水乙醇（水提取物用水）將樣品提取物配制成不同濃度，備用。取不同濃度的樣品與FRAP 工作液各2 mL，混勻，37 ℃水浴10 min，于593 nm 處測定吸光度值。每組設(shè)六個平行，一個空白對照。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用去離子水配制FeSO4溶液（濃度梯度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1.6 mmol/L），按照上述方法測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣本總氧化還原能力計算：以1.0 mmol/L Fe-SO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品氧化還原能力以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示，計算公式如下：

式中：A1為樣品管的吸光度；A2為空白對照管的吸光度；A0為1 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。

1.2.3 羥自由基清除能力測定

樣品管：取2 mL 不同濃度的樣品，分別加入6 mmol/L FeSO4與6 mmol/L H2O2工作液各2 mL，混勻，靜置10 min，再加入2 mL 的6 mmol/L 水楊酸，混勻放置30 min，并于510 nm 處測定吸光度值。每組設(shè)六個平行。

對照管：取2 mL 不同濃度的樣品，分別加入6 mmol/L FeSO4與6 mmol/L H2O2工作液各2 mL，混勻，靜置10 min，再加入2 mL 的去離子水（RO水），混勻放置30 min，并于510 nm 處測定吸光度值并記錄。

計算羥自由基清除率：

式中：Ai為樣品溶液反應(yīng)吸光度；Aj為樣品對照溶液的吸光度；A0為去離子水代替樣品反應(yīng)吸光度。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

半抑制量（IC50）：根據(jù)提取物羥自由基/ABTS自由基清除率與濃度曲線所得回歸方程，計算得到5 種核桃酒將自由基原始質(zhì)量濃度減少至50 %時的使用濃度（IC50）。

比活性：即提取物與Vit C IC50的比值。比活性越大，代表其自由基清除能力越強。

同時，采用Origin pro 2021 軟件繪制提取物濃度與抗氧化活性關(guān)系圖；SPSS 20.0 軟件計算不同提取物的IC50值；使用Omic Share 云分析工具（https://www.omicshare.com）對不同種類核桃酒的IC50值進(jìn)行多組檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABTS自由基清除能力

2.1.1 樣品ABTS自由基清除能力

大麥酒對ABTS 自由基的清除能力最高僅為15.27%。

5 種核桃酒對ABTS 自由基清除率除核桃酒2、核桃酒4 外，其余均隨著樣品稀釋倍數(shù)的升高而降低，且形成較良好的線性關(guān)系。因曲線擬合較為復(fù)雜，難以判斷5 種核桃酒對ABTS 自由基清除能力的強弱（圖1）。

圖1 核桃酒對ABTS自由基的清除活性

2.1.2 核桃酒ABTS 自由基清除率IC50多組檢驗分析

根據(jù)不同樣本IC50值可發(fā)現(xiàn)，5 種核桃酒的總氧化還原能力的強弱依次為：核桃酒2＞核桃酒4＞核桃酒1＞核桃酒5＞核桃酒3。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，核桃酒1、核桃酒2、核桃酒4、核桃酒5 的ABTS 自由基清除能力無顯著差異，但核桃酒2 與核桃酒3具有顯著差異（P＜0.01）（圖2）。

圖2 ABTS自由基清除率IC50多組檢驗分析

2.2 總氧化還原能力

2.2.1 FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，F(xiàn)eSO4的濃度范圍在0.1～1.6 mmol/L 時，吸光度隨著FeSO4濃度的增加而增加，呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系(y=0.6012x+0.0429，R2=0.9937)，見圖3。

圖3 FRAP實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 樣品總氧化還原能力

大麥酒的總氧化還原能力最高為11.76，僅為核桃酒總氧化還原能力的一半。

5 種核桃酒在總氧化還原能力上無顯著差異，且呈良好的線性關(guān)系。5 種核桃酒均在稀釋150 倍后，還原能力趨于穩(wěn)定。僅基于擬合曲線難以判斷5種核桃酒總氧化還原能力的強弱，見圖4。

圖4 核桃酒FRAP總氧化還原能力

2.2.3 核桃酒總氧化還原能力的多組檢驗分析

根據(jù)不同樣本IC50值可發(fā)現(xiàn)，5 種核桃酒的總氧化還原能力的強弱依次為：核桃酒1＞核桃酒4＞核桃酒5＞核桃酒2＞核桃酒3。統(tǒng)計分析顯示，核桃酒2、核桃酒3、核桃酒4、核桃酒5 的總氧化還原能力無顯著差異，但核桃酒1 顯著高于核桃酒2、核桃酒3（P＜0.05），見圖5。

圖5 總氧化還原能力的多組檢驗分析

2.3 樣本羥自由基清除能力

2.3.1 樣品羥自由基清除能力

大麥酒對羥自由基的清除能力最高為41.13%。

5 種核桃酒因曲線擬合較為聚集，難以判斷對羥自由基清除能力的強弱。但部分種類的核桃酒稀釋400 倍以上時，其清除自由基的能力明顯下降，見圖6。

圖6 核桃酒對羥自由基的清除活性

2.3.2 核桃酒羥自由基清除率測定的多組檢驗分析

對5 種核桃酒羥自由基清除率的IC50值進(jìn)行比較可發(fā)現(xiàn)，5 種核桃酒對ABTS 自由基清除能力的強弱為：核桃酒1＞核桃酒4＞核桃酒2＞核桃酒5＞核桃酒3。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，核桃酒1、核桃酒2、核桃酒4、核桃酒5 的總氧化還原能力無顯著差異，但核桃酒3 與核桃酒1、核桃酒4 具有顯著差異（P＜0.05），見圖7。

圖7 羥自由基清除率測定的多組檢驗分析

3 討論

本實驗使用3 種不同方法對5 種核桃酒的體外抗氧化活性進(jìn)行了評價，實驗結(jié)果顯示：添加了青皮核桃等配料的核桃酒，不僅相較于原料純大麥酒來說，具有更強的抗氧化能力，而且較核桃而言，也發(fā)揮出了更大的抗氧化活性[26]。5 種核桃酒之間存在抗氧化能力的強弱差異，其中核桃酒1 的FRAP還原能力與羥自由基清除能力最強，核桃酒2 的ABTS 自由基清除能力最強，核桃酒4 的所有指標(biāo)均處第二位，核桃酒3 的所有指標(biāo)整體評估較弱。核桃酒1、核桃酒2 與核桃酒3 配方相同，主要的差異是核桃酒1 和2 的青皮核桃含量比核桃酒3 高出50%，說明青皮核桃對總體抗氧化能力的評估起主要影響。

研究表明傳統(tǒng)香料也具有抗氧化活性[27]。在本研究中，核桃酒2與核桃酒1的青皮核桃含量一致，但核桃酒2 的香草、肉豆蔻的含量是核桃酒1 的50%，肉桂含量為70%，原則上來說，核桃酒2的抗氧化活性應(yīng)低于1，但2 對ABTS 的自由基清除能力高于1，說明香料添加過度也許會抑制ABTS 自由基清除能力。

在本研究中，添加的糖類存在差異，這也會影響核桃酒的抗氧化能力。核桃酒4 的三個抗氧化指標(biāo)，在5 組樣本中均排名第二，分析其配料發(fā)現(xiàn)，其青皮核桃含量低于2，輔料中，除糖類為冰糖，不同于2的白糖外，其他成分與核桃酒2接近，但是核桃酒4 的FRAP 還原能力與羥自由基清除能力高于2，這說明在提高核桃酒抗氧化活性方面，冰糖優(yōu)于白糖。通過核桃酒4 與核桃酒5 的比較發(fā)現(xiàn)，核桃酒4 中青皮核桃的含量顯著低于核桃酒5，但核桃酒4 在各項指標(biāo)評定中均優(yōu)于核桃酒5，說明添加冰糖更有利于提升核桃泡酒的抗氧化能力，具體原因有待分析。

綜上所述，以青皮核桃為主料制作的核桃酒具有抗氧化能力，可以作為核桃產(chǎn)業(yè)的附加產(chǎn)品進(jìn)一步開發(fā)利用。但是因添加青皮核桃的量以及輔料種類與含量的不同，其抗氧化活性存在顯著差異，未來應(yīng)進(jìn)一步在保證核桃酒風(fēng)味的前提下，調(diào)整優(yōu)化主輔料配方，發(fā)揮出核桃最大的利用價值。