白莉圓，趙 帥，曹 丹，張永利，閆宗科，賈智勇

(陜西西鳳酒股份有限公司，陜西鳳翔 721406)

鳳香型白酒具有以乙酸乙酯為主，己酸乙酯為輔的復(fù)合香氣，口感醇厚，諸味諧調(diào)[1-3]。每年為一個(gè)生產(chǎn)周期，經(jīng)過(guò)立窖、破窖、頂窖、圓窖、插窖、挑窖六個(gè)階段[4-5]。不同生產(chǎn)階段酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)不同，發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量亦不同，影響白酒的風(fēng)味[6]。

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)得到廣泛應(yīng)用[7-8]，其優(yōu)點(diǎn)是全面，能檢測(cè)到含量很低的微生物，較好地揭示體系中微生物群落結(jié)構(gòu)組成。JIN 等[9]研究了14 份醬香大曲樣品的微生物群落多樣性與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性；胡曉龍等[10]基于高通量測(cè)序技術(shù)分析了濃香型酒醅微生物群落演替規(guī)律；馬冰濤等[11]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)老白干香型白酒釀造過(guò)程中的微生物進(jìn)行測(cè)序，得到310 個(gè)細(xì)菌屬和59 個(gè)真菌屬；ZHANG、YANG 等[12-13]研究表明酒醅中占主導(dǎo)的細(xì)菌是Lactobacillus。與其他香型白酒相比，鳳香型白酒酒醅多數(shù)是對(duì)發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)的研究[3，14]，對(duì)出池酒醅微生物多樣性的研究較少。掌握出池酒醅微生物多樣性的規(guī)律可以更好地分析微生物群體與鳳香型白酒品質(zhì)的關(guān)系。

本研究以鳳香型白酒各生產(chǎn)階段的出池酒醅為對(duì)象，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合熒光定量PCR法，解析鳳香型白酒不同生產(chǎn)階段的酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)，分離鑒定酒醅中優(yōu)勢(shì)菌株，以豐富西鳳酒微生物菌種資源庫(kù)，為揭示鳳香型白酒發(fā)酵機(jī)理及提高產(chǎn)品質(zhì)量提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

取樣地點(diǎn)：陜西西鳳酒股份有限公司903 制酒車間重點(diǎn)窖。

取樣時(shí)間：一個(gè)生產(chǎn)周期，即“立窖、破窖、頂窖、圓窖、插窖、挑窖”六個(gè)階段的出池酒醅，共計(jì)9個(gè)酒醅樣本。(立窖階段只投糧，不蒸餾，不出酒。)

取樣方法：使用取樣器取樣，取樣時(shí)選擇上、中、下層分別取樣，注意避開(kāi)窖池靠窖池壁處，選擇中部略靠窖池壁處將三層的樣品混合均勻后存于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑

MRS 培養(yǎng)基、WL 培養(yǎng)基、兩性霉素、氯霉素、氯化鈉、丙三醇等。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LYZ 恒溫?fù)u床，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；SPX-250-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D 潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熒光定量PCR分析

將酒醅樣本送測(cè)序公司，利用絕對(duì)定量PCR(absolute quantification PCR，AQ-PCR)技術(shù)得出樣本中細(xì)菌、真菌的生物量。通過(guò)測(cè)定樣本的Ct 值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣本的拷貝數(shù)。

拷貝數(shù)(X0)計(jì)算方法：

注：K 表示標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，b 表示標(biāo)準(zhǔn)曲線截距

每g 樣品拷貝數(shù)=X0×50 μL(洗脫體積)/稱重

1.2.2 微生物多樣性檢測(cè)

將酒醅樣本送測(cè)序公司，利用Illumina 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。提取樣本微生物總基因組后，對(duì)基因組的16S V3-V4(a)區(qū)和ITS1(a)區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序分析。

1.2.3 微生物分離鑒定

將酒醅中優(yōu)勢(shì)菌株選用MRS 培養(yǎng)基或WL 培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化后，存于甘油管中送測(cè)序公司進(jìn)行種屬鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅定量分析

2.1.1 酒醅細(xì)菌定量分析

細(xì)菌生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=-3.32x+36.36，R2=0.9983，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。擴(kuò)增效率為100%，說(shuō)明熒光定量PCR達(dá)到了良好的擴(kuò)增效果，可以用于熒光定量分析。

圖1 細(xì)菌定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各酒醅樣本的細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酒醅中細(xì)菌的熒光定量PCR結(jié)果

在整個(gè)生產(chǎn)周期內(nèi)，出池酒醅細(xì)菌的生物量在107～109copies/g 酒醅之間，呈先上升后下降趨勢(shì)。破窖出池酒醅細(xì)菌的生物量達(dá)到4.50×107copies/g 酒醅，較其他酒醅低，可能是因?yàn)槠平殉龀鼐契贿M(jìn)行了一輪生產(chǎn)，積累的微生物較少。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各階段酒醅細(xì)菌的生物量逐漸增加，在圓窖5 排時(shí)達(dá)到最大值(1.21×109copies/g 酒醅)，隨后有所減少。

2.1.2 酒醅真菌定量分析

圖3 真菌定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

真菌生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=-3.54x+37.99，R2=0.9965，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。擴(kuò)增效率為92 %，說(shuō)明熒光定量PCR達(dá)到了良好的擴(kuò)增效果，可以用于熒光定量分析。

依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各酒醅樣本的真菌ITS基因拷貝數(shù)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酒醅中真菌的熒光定量PCR結(jié)果

在整個(gè)生產(chǎn)周期內(nèi)，出池酒醅真菌的生物量在106～108copies/g 酒醅之間。破窖出池酒醅真菌的生物量最少，僅達(dá)到4.28×106copies/g 酒醅，其余酒醅真菌的生物量均在107copies/g酒醅以上。

結(jié)合圖2 和圖4 可知，不同生產(chǎn)階段出池酒醅細(xì)菌的生物量高于真菌，可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，窖池內(nèi)逐漸形成厭氧、高濃度的有機(jī)酸和乙醇等特殊環(huán)境，更利于細(xì)菌微生物的生存，例如乳酸菌屬于兼性厭氧菌，能夠耐受較低的pH 值，這些特性可能導(dǎo)致其逐漸成為發(fā)酵酒醅中的主要微生物[15]。

2.2 酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序，9個(gè)酒醅樣本共獲得661443 條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣本73494 條序列，最少59855 條，最多92895 條序列，所有細(xì)菌序列可歸類為1247個(gè)ASV。

(1)多樣性分析

通過(guò)Illumina 高通量測(cè)序?qū)? 個(gè)酒醅樣本進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1中Good’s coverage指數(shù)的數(shù)值在0.997531～0.999419 之間，表明樣本中未被檢測(cè)出的物種所占比例較少，本次測(cè)序結(jié)果能完整反映酒醅中細(xì)菌種群的真實(shí)情況。破窖出池酒醅的豐富度指數(shù)(Chao1 和Observed species)和多樣性指數(shù)(Shannon 和Simpson)數(shù)值均最大，說(shuō)明破窖出池酒醅中包含物種的數(shù)目最多，多樣性最高。

表1 酒醅中細(xì)菌種群Alpha多樣性指數(shù)

圖5 是各階段出池酒醅細(xì)菌種群PCA 主成分分析圖，兩個(gè)主成分坐標(biāo)軸PC1 和PC2 的累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.8 %，包含了原始數(shù)據(jù)99.8 %以上的信息，可以代表原始變量進(jìn)行分析，達(dá)到了降維的目的。圖5 中所有樣本點(diǎn)分布在主成分坐標(biāo)軸的一、三、四象限，破窖出池酒醅區(qū)別于其他酒醅，分布于坐標(biāo)軸的第三象限，細(xì)菌群落豐富度和多樣性最高；頂窖、圓窖1 排、圓窖4 排、圓窖5 排、插窖的出池酒醅分布于坐標(biāo)軸的第四象限，細(xì)菌物種組成較為相似，但樣本點(diǎn)位與中心原點(diǎn)的距離不同，各階段酒醅細(xì)菌組成存在差異；圓窖2 排、圓窖3 排、挑窖的出池酒醅分布于坐標(biāo)軸的第一象限，樣本間距離較遠(yuǎn)，各階段酒醅細(xì)菌組成差異較大。

圖5 酒醅細(xì)菌種群PCA分析

(2)物種組成分析

從各階段出池酒醅中共檢測(cè)到15 個(gè)細(xì)菌門，相對(duì)豐度大于1%的只有厚壁菌門Firmicutes 和變形菌門Proteobacteria，相對(duì)豐度之和達(dá)99.6%。由圖6可知，F(xiàn)irmicutes是各階段出池酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度在87 %～99 %之間，可見(jiàn)Firmicutes 在鳳香型酒醅中處于優(yōu)勢(shì)地位；Proteobacteria 在破窖出池酒醅中為優(yōu)勢(shì)菌門，豐度達(dá)11.47%。

圖6 酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析(門水平)

從各階段出池酒醅中共檢測(cè)到204 個(gè)細(xì)菌屬，相對(duì)豐度大于1%的有乳桿菌屬Lactobacillus和醋桿菌屬Acetobacter。由圖7可知，Lactobacillus是各階段出池酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度在84 %～99 %之間，故細(xì)菌的篩選集中在乳桿菌屬。破窖出池酒醅中Lactobacillus占主導(dǎo)地位，相對(duì)豐度達(dá)84.40 %，其次是Acetobacter和片球菌屬Pediococcus，相對(duì)豐度分別是9.86 %和1.68 %，這可能是破窖出池酒醅只進(jìn)行了一輪生產(chǎn)，只有三甑大米查加曲入窖，受環(huán)境影響較大，微生物種類更為豐富。

圖7 酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析(屬水平)

2.2.2 酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)真菌ITS 基因測(cè)序，9 個(gè)酒醅樣本共獲得824384 條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣本91598 條序列，最少57224 條，最多128555 條序列，所有真菌序列可歸類為516個(gè)ASV。

(1)多樣性分析

通過(guò)Illumina 高通量測(cè)序?qū)? 個(gè)酒醅樣本進(jìn)行真菌多樣性分析，結(jié)果如表2所示。

表2 酒醅中真菌種群Alpha多樣性指數(shù)

表2 中Good’s coverage指數(shù)的數(shù)值在0.999757～0.999996 之間，表明樣本中未被檢測(cè)出的物種所占比例較少，本次測(cè)序結(jié)果能完整反映酒醅中真菌種群的真實(shí)情況。插窖出池酒醅的Chao1 和Observed species 指數(shù)數(shù)值最大，表明插窖出池酒醅樣本的豐富度最高；挑窖出池酒醅的Shannon 和Simpson 指數(shù)數(shù)值最大，說(shuō)明挑窖出池酒醅的多樣性最高。結(jié)合表1 和表2 可知，各階段出池酒醅中細(xì)菌種群的豐富度和多樣性高于真菌。

圖8 是各階段出池酒醅真菌種群PCA 主成分分析圖，兩個(gè)主成分坐標(biāo)軸PC1 和PC2 的累計(jì)貢獻(xiàn)率為88.1 %，包含了原始數(shù)據(jù)88.1 %以上的信息，可以選擇這2 個(gè)主因子進(jìn)行分析。圖中所有樣本點(diǎn)分布在主成分坐標(biāo)軸的一、二、三象限，破窖出池酒醅分布于坐標(biāo)軸的第三象限，真菌群落豐富度最低；頂窖、圓窖1 排的出池酒醅分布于坐標(biāo)軸的第一象限，樣本點(diǎn)位與中心原點(diǎn)的距離不同，真菌組成存在差異；其余階段出池酒醅分布于坐標(biāo)軸的第二象限，樣本間距離較近，真菌物種組成較為相似。

圖8 酒醅真菌種群PCA分析

(2)物種組成分析

從各階段出池酒醅中共檢測(cè)到6 個(gè)真菌門，其中相對(duì)豐度大于1%的只有子囊菌門Ascomycota，其他菌門占比均較小。由圖9 可知，Ascomycota 在所有出池酒醅中均為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度在85 %～99 %之間，由此可見(jiàn)Ascomycota 是鳳香型酒醅中的優(yōu)勢(shì)真菌菌門，也是醬香型白酒及食醋等多種發(fā)酵食品中的主要真菌種群[16]。

圖9 酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)分析(門水平)

從各階段出池酒醅中共檢測(cè)到140 個(gè)真菌屬，其中7 個(gè)菌屬較為豐富，分別是畢赤酵母屬Pichia、單孢酵母屬Kazachstania、曲霉屬Aspergillus、熱子囊菌屬Thermoascus、假絲酵母屬Candida、德克酵母屬Dekkera和紐曼菌屬Naumovozyma，相對(duì)豐度之和達(dá)82 %。由圖10 可知，不同階段的出池酒醅真菌組成雖有差異，但絕大多數(shù)均以Pichia為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。PCJP 中Candida為第一優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度達(dá)62.33 %，其次是Pichia(29.92 %)和Dekkera(6.49%)；DCJP、Y1CJP 中Kazachstania為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別是76.65%、51.72%；Y2CJP 中Thermoascus、Pichia和Aspergillus為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別是29.49 %、24.67 %和12.88 %；其余5 個(gè)出池酒醅中Pichia占主導(dǎo)地位，相對(duì)豐度在33 %～50 %之間。Naumovozyma在Y1CJP、Y5CJP、CCJP 中為優(yōu)勢(shì)真菌屬，相對(duì)豐度分別是8.78%、8.29%和2.22%，同時(shí)也是濃香型白酒酒醅中的優(yōu)勢(shì)酵母菌[17-19]。

圖10 酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)分析(屬水平)

2.3 酒醅優(yōu)勢(shì)微生物分離鑒定

2.3.1 MRS培養(yǎng)基分離篩選酒醅中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌

由圖7 可知，Lactobacillus是各階段出池酒醅中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，在發(fā)酵過(guò)程中可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸類物質(zhì)[20-21]，故選用MRS 培養(yǎng)基對(duì)酒醅中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化。將篩選得到的細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，共鑒定出36 株細(xì)菌，見(jiàn)表3。

由表3 可知，36 株菌株屬于細(xì)菌域的1 個(gè)門(厚壁菌門Firmicutes)、3 個(gè)屬(乳桿菌屬Lactobacillus、片球菌屬Pediococcus、芽孢桿菌屬Bacillus)、12 個(gè)種。分離得到5 種相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌種，包括小片球菌Pediococcus parvulus、布氏乳桿菌Lactobacillus buchneri、短乳桿菌Lactobacillus brevis、棒狀乳桿菌Lactobacillus coryniformis、開(kāi)菲爾乳桿菌Lactobacillus kefiri。平均相對(duì)豐度達(dá)10 %的耐酸乳桿菌Lactobacillus acetotolerans未篩選到，可能是該菌株需要在嚴(yán)格的無(wú)氧環(huán)境下篩選[22]。

表3 細(xì)菌比對(duì)結(jié)果

2.3.2 WL培養(yǎng)基分離篩選酒醅中優(yōu)勢(shì)真菌

由圖10 可知，各階段出池酒醅中有7 個(gè)真菌屬較為豐富，Pichia、Kazachstania為主要優(yōu)勢(shì)真菌屬，故選用WL 培養(yǎng)基對(duì)酒醅中優(yōu)勢(shì)真菌進(jìn)行分離純化。將篩選得到的真菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，共鑒定出25株真菌，見(jiàn)表4。

由表4 可知，25 株菌株屬于真菌域的1 個(gè)門(子囊菌門Ascomycota)、7 個(gè)屬(紐曼菌屬Naumovozyma、單孢酵母屬Kazachstania、酵母屬Saccharomyces、復(fù)膜孢酵母屬Saccharomycopsis、畢赤酵母屬Pichia、孢圓酵母屬Torulaspora和假絲酵母屬Candida)、10 個(gè)種。分離得到5 種相對(duì)豐度排名前十的優(yōu)勢(shì)菌種，包括Kazachstania humilis、發(fā)酵畢赤酵母Pichia fermentans、乙醇假絲酵母Candida ethanolica、Kazachstania bulderi、Naumovozyma castellii。

表4 真菌比對(duì)結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 在整個(gè)生產(chǎn)周期內(nèi)，出池酒醅細(xì)菌的生物量在107～109copies/g 酒醅之間，真菌的生物量在106～108copies/g 酒醅之間，細(xì)菌的生物量高于真菌。

3.2 各階段出池酒醅中細(xì)菌種群的豐富度和多樣性高于真菌；共檢測(cè)到15 個(gè)細(xì)菌門和6 個(gè)真菌門，厚壁菌門Firmicutes和子囊菌門Ascomycota為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門；共檢測(cè)到204 個(gè)細(xì)菌屬和140 個(gè)真菌屬，乳桿菌屬Lactobacillus為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，畢赤酵母屬Pichia、單孢酵母屬Kazachstania、曲霉屬Aspergillus、熱子囊菌屬Thermoascus、假絲酵母屬Candida、德克酵母屬Dekkera和紐曼菌屬Naumovozyma為優(yōu)勢(shì)真菌屬。

3.3 通過(guò)分離純化、DNA 種屬鑒定得到36 株細(xì)菌和25 株真菌，3 種細(xì)菌(小片球菌Pediococcus parvulus、布氏乳桿菌Lactobacillus buchneri、短乳桿菌Lactobacillus brevis)和5 種真菌(Kazachstania humilis、發(fā)酵畢赤酵母Pichia fermentans、乙醇假絲酵母Candida ethanolica、Kazachstania bulderi、Naumovozyma castellii)是酒醅中相對(duì)豐度排名前10 的優(yōu)勢(shì)菌種。