白莉圓,趙 帥,曹 丹,張永利,閆宗科,賈智勇
(陜西西鳳酒股份有限公司,陜西鳳翔 721406)
鳳香型白酒具有以乙酸乙酯為主,己酸乙酯為輔的復(fù)合香氣,口感醇厚,諸味諧調(diào)[1-3]。每年為一個生產(chǎn)周期,經(jīng)過立窖、破窖、頂窖、圓窖、插窖、挑窖六個階段[4-5]。不同生產(chǎn)階段酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)不同,發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量亦不同,影響白酒的風味[6]。
近年來,高通量測序技術(shù)得到廣泛應(yīng)用[7-8],其優(yōu)點是全面,能檢測到含量很低的微生物,較好地揭示體系中微生物群落結(jié)構(gòu)組成。JIN 等[9]研究了14 份醬香大曲樣品的微生物群落多樣性與揮發(fā)性風味物質(zhì)之間的相關(guān)性;胡曉龍等[10]基于高通量測序技術(shù)分析了濃香型酒醅微生物群落演替規(guī)律;馬冰濤等[11]利用高通量測序技術(shù)對老白干香型白酒釀造過程中的微生物進行測序,得到310 個細菌屬和59 個真菌屬;ZHANG、YANG 等[12-13]研究表明酒醅中占主導的細菌是Lactobacillus。與其他香型白酒相比,鳳香型白酒酒醅多數(shù)是對發(fā)酵過程中理化指標、風味物質(zhì)的研究[3,14],對出池酒醅微生物多樣性的研究較少。掌握出池酒醅微生物多樣性的規(guī)律可以更好地分析微生物群體與鳳香型白酒品質(zhì)的關(guān)系。
本研究以鳳香型白酒各生產(chǎn)階段的出池酒醅為對象,運用高通量測序技術(shù)結(jié)合熒光定量PCR法,解析鳳香型白酒不同生產(chǎn)階段的酒醅微生物群落結(jié)構(gòu),分離鑒定酒醅中優(yōu)勢菌株,以豐富西鳳酒微生物菌種資源庫,為揭示鳳香型白酒發(fā)酵機理及提高產(chǎn)品質(zhì)量提供理論支撐。
1.1 材料、試劑及儀器
1.1.1 樣品
取樣地點:陜西西鳳酒股份有限公司903 制酒車間重點窖。
取樣時間:一個生產(chǎn)周期,即“立窖、破窖、頂窖、圓窖、插窖、挑窖”六個階段的出池酒醅,共計9個酒醅樣本。(立窖階段只投糧,不蒸餾,不出酒。)
取樣方法:使用取樣器取樣,取樣時選擇上、中、下層分別取樣,注意避開窖池靠窖池壁處,選擇中部略靠窖池壁處將三層的樣品混合均勻后存于-20 ℃冰箱備用。
1.1.2 主要試劑
MRS 培養(yǎng)基、WL 培養(yǎng)基、兩性霉素、氯霉素、氯化鈉、丙三醇等。
1.1.3 儀器與設(shè)備
LYZ 恒溫搖床,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;SPX-250-Ⅱ生化培養(yǎng)箱,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;SW-CJ-2D 潔凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司。
1.2 試驗方法
1.2.1 熒光定量PCR分析
將酒醅樣本送測序公司,利用絕對定量PCR(absolute quantification PCR,AQ-PCR)技術(shù)得出樣本中細菌、真菌的生物量。通過測定樣本的Ct 值,從標準曲線上計算出該樣本的拷貝數(shù)。
拷貝數(shù)(X0)計算方法:
注:K 表示標準曲線斜率,b 表示標準曲線截距
每g 樣品拷貝數(shù)=X0×50 μL(洗脫體積)/稱重
1.2.2 微生物多樣性檢測
將酒醅樣本送測序公司,利用Illumina 平臺進行高通量測序分析。提取樣本微生物總基因組后,對基因組的16S V3-V4(a)區(qū)和ITS1(a)區(qū)擴增子測序分析。
1.2.3 微生物分離鑒定
將酒醅中優(yōu)勢菌株選用MRS 培養(yǎng)基或WL 培養(yǎng)基進行分離純化后,存于甘油管中送測序公司進行種屬鑒定。
2.1 酒醅定量分析
2.1.1 酒醅細菌定量分析
細菌生物量標準曲線為:y=-3.32x+36.36,R2=0.9983,標準曲線線性良好。擴增效率為100%,說明熒光定量PCR達到了良好的擴增效果,可以用于熒光定量分析。
圖1 細菌定量PCR標準曲線
依據(jù)上述標準曲線計算各酒醅樣本的細菌16S rRNA基因拷貝數(shù),結(jié)果如圖2所示。
圖2 酒醅中細菌的熒光定量PCR結(jié)果
在整個生產(chǎn)周期內(nèi),出池酒醅細菌的生物量在107~109copies/g 酒醅之間,呈先上升后下降趨勢。破窖出池酒醅細菌的生物量達到4.50×107copies/g 酒醅,較其他酒醅低,可能是因為破窖出池酒醅只進行了一輪生產(chǎn),積累的微生物較少。隨著發(fā)酵的進行,各階段酒醅細菌的生物量逐漸增加,在圓窖5 排時達到最大值(1.21×109copies/g 酒醅),隨后有所減少。
2.1.2 酒醅真菌定量分析
圖3 真菌定量PCR標準曲線
真菌生物量標準曲線為:y=-3.54x+37.99,R2=0.9965,標準曲線線性良好。擴增效率為92 %,說明熒光定量PCR達到了良好的擴增效果,可以用于熒光定量分析。
依據(jù)上述標準曲線計算各酒醅樣本的真菌ITS基因拷貝數(shù),結(jié)果如圖4所示。
圖4 酒醅中真菌的熒光定量PCR結(jié)果
在整個生產(chǎn)周期內(nèi),出池酒醅真菌的生物量在106~108copies/g 酒醅之間。破窖出池酒醅真菌的生物量最少,僅達到4.28×106copies/g 酒醅,其余酒醅真菌的生物量均在107copies/g酒醅以上。
結(jié)合圖2 和圖4 可知,不同生產(chǎn)階段出池酒醅細菌的生物量高于真菌,可能是隨著發(fā)酵的進行,窖池內(nèi)逐漸形成厭氧、高濃度的有機酸和乙醇等特殊環(huán)境,更利于細菌微生物的生存,例如乳酸菌屬于兼性厭氧菌,能夠耐受較低的pH 值,這些特性可能導致其逐漸成為發(fā)酵酒醅中的主要微生物[15]。
2.2 酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)分析
2.2.1 酒醅細菌群落結(jié)構(gòu)分析
經(jīng)細菌16S rRNA基因測序,9個酒醅樣本共獲得661443 條高質(zhì)量序列,平均每個樣本73494 條序列,最少59855 條,最多92895 條序列,所有細菌序列可歸類為1247個ASV。
(1)多樣性分析
通過Illumina 高通量測序?qū)? 個酒醅樣本進行細菌多樣性分析,結(jié)果見表1。
表1中Good’s coverage指數(shù)的數(shù)值在0.997531~0.999419 之間,表明樣本中未被檢測出的物種所占比例較少,本次測序結(jié)果能完整反映酒醅中細菌種群的真實情況。破窖出池酒醅的豐富度指數(shù)(Chao1 和Observed species)和多樣性指數(shù)(Shannon 和Simpson)數(shù)值均最大,說明破窖出池酒醅中包含物種的數(shù)目最多,多樣性最高。
表1 酒醅中細菌種群Alpha多樣性指數(shù)
圖5 是各階段出池酒醅細菌種群PCA 主成分分析圖,兩個主成分坐標軸PC1 和PC2 的累計貢獻率為99.8 %,包含了原始數(shù)據(jù)99.8 %以上的信息,可以代表原始變量進行分析,達到了降維的目的。圖5 中所有樣本點分布在主成分坐標軸的一、三、四象限,破窖出池酒醅區(qū)別于其他酒醅,分布于坐標軸的第三象限,細菌群落豐富度和多樣性最高;頂窖、圓窖1 排、圓窖4 排、圓窖5 排、插窖的出池酒醅分布于坐標軸的第四象限,細菌物種組成較為相似,但樣本點位與中心原點的距離不同,各階段酒醅細菌組成存在差異;圓窖2 排、圓窖3 排、挑窖的出池酒醅分布于坐標軸的第一象限,樣本間距離較遠,各階段酒醅細菌組成差異較大。
圖5 酒醅細菌種群PCA分析
(2)物種組成分析
從各階段出池酒醅中共檢測到15 個細菌門,相對豐度大于1%的只有厚壁菌門Firmicutes 和變形菌門Proteobacteria,相對豐度之和達99.6%。由圖6可知,F(xiàn)irmicutes是各階段出池酒醅中的絕對優(yōu)勢菌門,相對豐度在87 %~99 %之間,可見Firmicutes 在鳳香型酒醅中處于優(yōu)勢地位;Proteobacteria 在破窖出池酒醅中為優(yōu)勢菌門,豐度達11.47%。
圖6 酒醅細菌群落結(jié)構(gòu)分析(門水平)
從各階段出池酒醅中共檢測到204 個細菌屬,相對豐度大于1%的有乳桿菌屬Lactobacillus和醋桿菌屬Acetobacter。由圖7可知,Lactobacillus是各階段出池酒醅中的絕對優(yōu)勢菌屬,相對豐度在84 %~99 %之間,故細菌的篩選集中在乳桿菌屬。破窖出池酒醅中Lactobacillus占主導地位,相對豐度達84.40 %,其次是Acetobacter和片球菌屬Pediococcus,相對豐度分別是9.86 %和1.68 %,這可能是破窖出池酒醅只進行了一輪生產(chǎn),只有三甑大米查加曲入窖,受環(huán)境影響較大,微生物種類更為豐富。
圖7 酒醅細菌群落結(jié)構(gòu)分析(屬水平)
2.2.2 酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)分析
經(jīng)真菌ITS 基因測序,9 個酒醅樣本共獲得824384 條高質(zhì)量序列,平均每個樣本91598 條序列,最少57224 條,最多128555 條序列,所有真菌序列可歸類為516個ASV。
(1)多樣性分析
通過Illumina 高通量測序?qū)? 個酒醅樣本進行真菌多樣性分析,結(jié)果如表2所示。
表2 酒醅中真菌種群Alpha多樣性指數(shù)
表2 中Good’s coverage指數(shù)的數(shù)值在0.999757~0.999996 之間,表明樣本中未被檢測出的物種所占比例較少,本次測序結(jié)果能完整反映酒醅中真菌種群的真實情況。插窖出池酒醅的Chao1 和Observed species 指數(shù)數(shù)值最大,表明插窖出池酒醅樣本的豐富度最高;挑窖出池酒醅的Shannon 和Simpson 指數(shù)數(shù)值最大,說明挑窖出池酒醅的多樣性最高。結(jié)合表1 和表2 可知,各階段出池酒醅中細菌種群的豐富度和多樣性高于真菌。
圖8 是各階段出池酒醅真菌種群PCA 主成分分析圖,兩個主成分坐標軸PC1 和PC2 的累計貢獻率為88.1 %,包含了原始數(shù)據(jù)88.1 %以上的信息,可以選擇這2 個主因子進行分析。圖中所有樣本點分布在主成分坐標軸的一、二、三象限,破窖出池酒醅分布于坐標軸的第三象限,真菌群落豐富度最低;頂窖、圓窖1 排的出池酒醅分布于坐標軸的第一象限,樣本點位與中心原點的距離不同,真菌組成存在差異;其余階段出池酒醅分布于坐標軸的第二象限,樣本間距離較近,真菌物種組成較為相似。
圖8 酒醅真菌種群PCA分析
(2)物種組成分析
從各階段出池酒醅中共檢測到6 個真菌門,其中相對豐度大于1%的只有子囊菌門Ascomycota,其他菌門占比均較小。由圖9 可知,Ascomycota 在所有出池酒醅中均為絕對優(yōu)勢菌門,相對豐度在85 %~99 %之間,由此可見Ascomycota 是鳳香型酒醅中的優(yōu)勢真菌菌門,也是醬香型白酒及食醋等多種發(fā)酵食品中的主要真菌種群[16]。
圖9 酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)分析(門水平)
從各階段出池酒醅中共檢測到140 個真菌屬,其中7 個菌屬較為豐富,分別是畢赤酵母屬Pichia、單孢酵母屬Kazachstania、曲霉屬Aspergillus、熱子囊菌屬Thermoascus、假絲酵母屬Candida、德克酵母屬Dekkera和紐曼菌屬Naumovozyma,相對豐度之和達82 %。由圖10 可知,不同階段的出池酒醅真菌組成雖有差異,但絕大多數(shù)均以Pichia為主要優(yōu)勢菌屬。PCJP 中Candida為第一優(yōu)勢菌屬,相對豐度達62.33 %,其次是Pichia(29.92 %)和Dekkera(6.49%);DCJP、Y1CJP 中Kazachstania為絕對優(yōu)勢菌屬,相對豐度分別是76.65%、51.72%;Y2CJP 中Thermoascus、Pichia和Aspergillus為主要優(yōu)勢菌屬,相對豐度分別是29.49 %、24.67 %和12.88 %;其余5 個出池酒醅中Pichia占主導地位,相對豐度在33 %~50 %之間。Naumovozyma在Y1CJP、Y5CJP、CCJP 中為優(yōu)勢真菌屬,相對豐度分別是8.78%、8.29%和2.22%,同時也是濃香型白酒酒醅中的優(yōu)勢酵母菌[17-19]。
圖10 酒醅真菌群落結(jié)構(gòu)分析(屬水平)
2.3 酒醅優(yōu)勢微生物分離鑒定
2.3.1 MRS培養(yǎng)基分離篩選酒醅中優(yōu)勢細菌
由圖7 可知,Lactobacillus是各階段出池酒醅中的絕對優(yōu)勢細菌屬,在發(fā)酵過程中可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸類物質(zhì)[20-21],故選用MRS 培養(yǎng)基對酒醅中優(yōu)勢細菌進行分離純化。將篩選得到的細菌進行分子生物學鑒定,共鑒定出36 株細菌,見表3。
由表3 可知,36 株菌株屬于細菌域的1 個門(厚壁菌門Firmicutes)、3 個屬(乳桿菌屬Lactobacillus、片球菌屬Pediococcus、芽孢桿菌屬Bacillus)、12 個種。分離得到5 種相對豐度較高的優(yōu)勢菌種,包括小片球菌Pediococcus parvulus、布氏乳桿菌Lactobacillus buchneri、短乳桿菌Lactobacillus brevis、棒狀乳桿菌Lactobacillus coryniformis、開菲爾乳桿菌Lactobacillus kefiri。平均相對豐度達10 %的耐酸乳桿菌Lactobacillus acetotolerans未篩選到,可能是該菌株需要在嚴格的無氧環(huán)境下篩選[22]。
表3 細菌比對結(jié)果
2.3.2 WL培養(yǎng)基分離篩選酒醅中優(yōu)勢真菌
由圖10 可知,各階段出池酒醅中有7 個真菌屬較為豐富,Pichia、Kazachstania為主要優(yōu)勢真菌屬,故選用WL 培養(yǎng)基對酒醅中優(yōu)勢真菌進行分離純化。將篩選得到的真菌進行分子生物學鑒定,共鑒定出25株真菌,見表4。
由表4 可知,25 株菌株屬于真菌域的1 個門(子囊菌門Ascomycota)、7 個屬(紐曼菌屬Naumovozyma、單孢酵母屬Kazachstania、酵母屬Saccharomyces、復(fù)膜孢酵母屬Saccharomycopsis、畢赤酵母屬Pichia、孢圓酵母屬Torulaspora和假絲酵母屬Candida)、10 個種。分離得到5 種相對豐度排名前十的優(yōu)勢菌種,包括Kazachstania humilis、發(fā)酵畢赤酵母Pichia fermentans、乙醇假絲酵母Candida ethanolica、Kazachstania bulderi、Naumovozyma castellii。
表4 真菌比對結(jié)果
3.1 在整個生產(chǎn)周期內(nèi),出池酒醅細菌的生物量在107~109copies/g 酒醅之間,真菌的生物量在106~108copies/g 酒醅之間,細菌的生物量高于真菌。
3.2 各階段出池酒醅中細菌種群的豐富度和多樣性高于真菌;共檢測到15 個細菌門和6 個真菌門,厚壁菌門Firmicutes和子囊菌門Ascomycota為絕對優(yōu)勢菌門;共檢測到204 個細菌屬和140 個真菌屬,乳桿菌屬Lactobacillus為絕對優(yōu)勢細菌屬,畢赤酵母屬Pichia、單孢酵母屬Kazachstania、曲霉屬Aspergillus、熱子囊菌屬Thermoascus、假絲酵母屬Candida、德克酵母屬Dekkera和紐曼菌屬Naumovozyma為優(yōu)勢真菌屬。
3.3 通過分離純化、DNA 種屬鑒定得到36 株細菌和25 株真菌,3 種細菌(小片球菌Pediococcus parvulus、布氏乳桿菌Lactobacillus buchneri、短乳桿菌Lactobacillus brevis)和5 種真菌(Kazachstania humilis、發(fā)酵畢赤酵母Pichia fermentans、乙醇假絲酵母Candida ethanolica、Kazachstania bulderi、Naumovozyma castellii)是酒醅中相對豐度排名前10 的優(yōu)勢菌種。