陳 曦，張成楠，李秀婷，王紅安，王 坤，朱 華，孫寶國

（1.中國商業(yè)聯(lián)合會釀酒微生物與酶分子工程重點實驗室，北京 100048；2.北京工商大學(xué)食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；3.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；4.北京華都釀酒食品有限責(zé)任公司，北京 102212）

醬香型白酒是中國傳統(tǒng)的白酒香型之一，廣受市場歡迎[1]。醬香型白酒的發(fā)酵周期為一年，共有八次的反復(fù)發(fā)酵，過程非常復(fù)雜[2]，所產(chǎn)出醬香型白酒共有七個輪次，每輪酒之間都有差異?；旌吓囵B(yǎng)發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵、糖化發(fā)酵和同時發(fā)酵等方法使得醬香型白酒深受地理環(huán)境、氣候變化的影響[3]。此外，發(fā)酵環(huán)境也為白酒提供了許多微生物菌種。研究表明，環(huán)境（室外地面、室內(nèi)地面、工具和其他未知環(huán)境）對細(xì)菌群落的貢獻(xiàn)率為62.61 %～90.90 %，對發(fā)酵真菌群落的貢獻(xiàn)率為20.00 %～38.94 %[4]。發(fā)酵溫度對微生物群落的生物多樣性和微生物代謝也很重要，研究表明，較低的初始溫度有利于微生物多樣性的維持[5]。

堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵是每一輪醬香型白酒發(fā)酵的最基本步驟[6]。堆積發(fā)酵的過程是指將原料蒸熟后攤開冷卻，在蒸熟的原料中加入一定比例的大曲，混合后堆積起來，在一定溫度下培養(yǎng)4～5 d，在堆子頂部的溫度達(dá)到45～50 ℃時，結(jié)束堆積發(fā)酵轉(zhuǎn)而入窖發(fā)酵[7]。堆積發(fā)酵是典型的多菌種開放的發(fā)酵過程，可以充分網(wǎng)羅環(huán)境中的微生物[8]。在堆積發(fā)酵的中后期，為了維持堆子的穩(wěn)定性，提升發(fā)酵質(zhì)量，對堆子進(jìn)行“倒堆”操作，是指在發(fā)酵生產(chǎn)中交換原料空間位置的過程，即里外顛倒，使表面層與中心層的酒醅相互交換，之后繼續(xù)發(fā)酵[9]。目前對“倒堆”操作及其對微生物菌群變化的實際影響研究較少。

研究結(jié)果顯示，在堆積過程中表面層和里芯層細(xì)菌的微生物多樣性經(jīng)過“倒堆”后顯著下降。從細(xì)菌整體的屬水平上看，表面層和里芯層共有大量的優(yōu)勢屬，沒有明顯的差異。在“倒堆”過程前后，核心微生物屬Lactobacillus、Lentibacillus和Bacillus的相對豐度含量發(fā)生了變化，無論是在表面層還是里芯層，Lactobacillus和Lentibacillus均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。目前對北京地區(qū)醬香型白酒的“倒堆”操作研究很少，其微生物群落變化的機(jī)制尚不明晰。

本研究旨在通過美吉平臺提供的數(shù)據(jù)，研究“倒堆”這一生產(chǎn)操作對堆積過程中微生物細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)演替的影響，以便更好地控制醬香型白酒的堆積發(fā)酵過程，為今后的實際生產(chǎn)提供理論參考和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

酒醅樣品采自北京華都釀酒食品有限公司。對第六輪次堆積發(fā)酵的酒醅進(jìn)行采樣，堆子成型開始記為0 h，堆積發(fā)酵總計持續(xù)84 h，在60～64 h 對堆積的酒醅進(jìn)行“倒堆”操作。分別在堆積發(fā)酵不同時間點（0 h、24 h、48 h、66 h、72 h、78 h、84 h）的堆子表、里兩層進(jìn)行取樣，每層的取樣位置固定，基本信息如表1所示，取樣后儲存于-80 ℃待用。

表1 各取樣點的詳細(xì)編號信息

1.1.2 試劑及耗材

E.Z.N.A ? Soil DNA Kit，美國Omega Bio-Tek 公司；rTaq DNA 聚合酶試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司；引物合成，上海生物工程股份有限公司；Gengree染料，上海賽百盛有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

Thermal Cycler 型梯度PCR 儀，美國Bio-rad 公司；Zealway G154DW 型高壓蒸汽滅菌鍋，致徽（廈門）儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司；DYY-8C 型電泳儀，北京六一儀器廠；JS-680C型凝膠成像儀，上海培清科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品總DNA提取

取酒醅樣品10 g于50 mL離心管中，加入30 mL滅菌后的0.1 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）懸浮，加入5～7 顆玻璃珠，充分振蕩7 min，400 r/min 離心5 min，吸取上清液。將沉淀用PBS 洗滌，漩渦振蕩4 min，400 r/min 離心5 min，收集上清液，重復(fù)用PBS 洗滌，直至得到40～50 mL 上清液。將所得液體進(jìn)行12000 r/min 離心5 min，棄上清液，收集沉淀?？侱NA 提取步驟參照E.Z.N.A?Soil DNA Kit操作說明。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

采用16S rRNA通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3')擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 高變區(qū)V3-V4。

PCR 條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；30 次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，之后降至4 ℃。

PCR 擴(kuò)增體系包括：5×TransStart Fast Pfubuffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正向引物(5 μmol/L)0.8 μL，反向引物(5 μmol/L) 0.8 μL，Trans Start Fast Pfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。

1.2.3 Illumina Miseq 測序

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit 進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST 進(jìn)行檢測定量。將純化后的擴(kuò)增片段在Illumina MiSeq平臺上構(gòu)建文庫，并進(jìn)行測序，分別對細(xì)菌V3-V4 高變區(qū)序列進(jìn)行測序分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)及圖片處理

應(yīng)用Fastp 軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用Usearch 軟件，在97 %的相似性閾值水平下，對基因序列進(jìn)行OTU 聚類分析。利用RDP classifer進(jìn)行分類學(xué)注釋分析。Alpha 多樣性指數(shù)、優(yōu)勢細(xì)菌屬的相對豐度均采用單因素方差分析(one way analysis of variance，one way ANOVA)結(jié)合最小顯著性差異法（Least-Significant Difference，LSD）分析不同堆積發(fā)酵時長樣品間的差異顯著性（P＜0.05）。通過unweighted Unifrac 算法計算不同樣品間的距離形成Beta 多樣性計算矩陣，并利用主坐標(biāo)分析(Principal Component Analysis，PCA)進(jìn)行可視化展示。利用Origin 2019b 軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alpha多樣性分析

為探究北京地區(qū)第六輪次堆積酒醅細(xì)菌群落的動態(tài)變化，對42 個酒醅樣品中的原核微生物16S rRNA 基因的V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行序列分析，獲得了3,491,384 個有效基因序列。OTU 聚類分析結(jié)果表明，堆積發(fā)酵樣品的基因序列聚類成1634 個OTU?；贠TU 聚類分析結(jié)果，對不同堆積時間的樣品進(jìn)行Alpha 多樣性分析，分別計算Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)反映酒醅樣品中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性[10]。

圖1A 和圖1B 表明，表面層和里芯層的所有酒醅樣品基于Shannon 指數(shù)和Chao 指數(shù)的稀釋曲線均逐漸趨向平緩，表明對酒醅中微生物多樣性的分析已覆蓋樣品中的主要細(xì)菌種類[11]，樣本具有研究價值。Shannon指數(shù)反映酒醅樣品中細(xì)菌群落的多樣性，數(shù)值越大代表樣本中的細(xì)菌群落豐度的均勻性越強(qiáng)；Chao 指數(shù)反映酒醅樣品中細(xì)菌群落的豐富度，數(shù)值越大代表樣本中的物種數(shù)量越多。堆積發(fā)酵過程中表面層和里芯層細(xì)菌的Shannon 指數(shù)和Chao 指數(shù)在倒堆前呈上升趨勢（圖1 C、圖1D），在堆積剛剛開始時，受車間內(nèi)各類環(huán)境因素例如溫度、濕度和工具等影響，原料發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)菌等微生物?！暗苟选鼻昂?，表面層與里芯層細(xì)菌的Shannon指數(shù)顯著性下降，說明“倒堆”這個操作擾動了原有的微生物發(fā)酵體系，使細(xì)菌微生物的α多樣性下降；表面層和里芯層的Chao 指數(shù)上升說明“倒堆”操作使酒醅充分富集了環(huán)境中的微生物，增加了細(xì)菌種類?！暗苟选焙?，表面層和里芯層細(xì)菌的微生物菌Shannon 指數(shù)下降，Chao 指數(shù)先下降再上升?？傮w上看，表面層和里芯層的Shannon 指數(shù)和Chao指數(shù)變化趨勢一致，與姜明慧等[12]的研究一致。

圖1 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過程中表面層和里芯層細(xì)菌群落的Alpha多樣性分析

2.2 群落組成分析

為了探究第六輪次堆積發(fā)酵中細(xì)菌α多樣性變化的原因，本研究進(jìn)一步分析了第六輪次堆積發(fā)酵中表面層和里芯層不同發(fā)酵時長的酒醅樣品在門水平上的群落結(jié)構(gòu)差異，如圖2所示。

第六輪次表面層和里芯層堆積發(fā)酵樣品中所檢出的細(xì)菌群落歸屬于29 個門。將相對豐度大于1%的細(xì)菌門定義為優(yōu)勢細(xì)菌門。從圖2 可以清晰看出，表面層和里芯層的優(yōu)勢細(xì)菌門均為Firmicutes、Actinobacteria 和Proteobacteria?！暗苟选鼻昂?，表面層、里芯層的Firmicutes 豐度增加，Actinobacteria 豐度減少，Wang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)習(xí)水地區(qū)7個發(fā)酵輪次中細(xì)菌優(yōu)勢門為Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes 和Fusobacteria，與本研究結(jié)果基本一致。戴奕杰等[14]研究了同樣來源于貴州省產(chǎn)區(qū)的醬香型白酒，發(fā)現(xiàn)在第六輪次堆積發(fā)酵中優(yōu)勢細(xì)菌門包括Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria 和Bacteroidetes 等，其中Proteobacteria 的相對豐度略高于Firmicutes。

圖2 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過程中表面層和里芯層細(xì)菌在門水平上的群落組成

在門水平分析基礎(chǔ)上，對42 個酒醅樣品進(jìn)行了科水平上的群落組成分析，發(fā)現(xiàn)第六輪次表面層和里芯層堆積發(fā)酵樣品中所檢出的細(xì)菌群落歸屬于285 個科。將相對豐度大于1 %的的細(xì)菌科定義為優(yōu)勢細(xì)菌科。在表面層酒醅中檢測出Lactobacillaceae、Bacillaceae、Thermoactinomycetaceae、Staphylococcaceae、Pseudonocardiaceae、Leuconostocaceae、Sporolactobacillaceae、Actinopolysporaceae和Corynebacteriaceae 共9 個優(yōu)勢科。在里芯層酒醅中檢測出Lactobacillaceae、Bacillaceae、Thermoactinomycetaceae、Staphylococcaceae、Pseudonocardiaceae、Sporolactobacillaceae、Leuconostocaceae、Enterobacteriaceae、Planococcaceae、Actinopolysporaceae 和Moraxellaceae 共11 個優(yōu)勢科（圖3）。已有研究發(fā)現(xiàn)Actinopolysporaceae、Bacillaceae、Lactobacillaceae、Leuconostocaceae、Sporolactobacillaceae、Staphylococcaceae、Thermoactinomycetaceae、Moraxellaceae 和Pseudonocardiaceae 是醬香型大曲細(xì)菌的主體科組成[15]。

圖3 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過程中表面層和里芯層細(xì)菌在科水平上的群落組成

由圖5 可知，表面層7 個取樣時間點的酒醅樣品中總共有124 個屬；里芯層7 個取樣點的酒醅樣品中總共有116 個屬。研究發(fā)現(xiàn)表面層經(jīng)過“倒堆”后獨有的菌屬增加，里芯層則相反。將北京地區(qū)第六輪次表面層和里芯層堆積發(fā)酵樣品中所檢出的細(xì)菌群落歸屬于706 個屬。將相對豐度大于1%的的細(xì)菌屬定義為優(yōu)勢細(xì)菌屬。由圖4A 和圖4B 可知，表面層細(xì)菌樣品中的優(yōu)勢屬共15 個：Lactobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Pediococcus、Saccharopolyspora、Thermoactinomyces、Weissella、Sporolactobacillaceae、Bacillaceae、norank _f__Actinopolysporaceae、Pseudogracilibacillus和Corynebacterium_1。里芯層細(xì)菌樣品中的優(yōu)勢屬為Lactobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Thermoactinomyces、Pedio-coccus、Saccharopolyspora、Sporolactobacillaceae、Weissella、Bacillaceae、Actinopolysporaceae、Kurthia、Acinetobacter和Enterobacter。與其他地區(qū)的優(yōu)勢細(xì)菌屬類似[16]。

圖4 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過程中表面層和里芯層細(xì)菌在屬水平上的群落組成

圖5 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過程Venn圖

“倒堆”前，表面層Lactobacillus相對豐度含量下降，里芯層Lactobacillus相對豐度含量上升，可能是因為Lactobacillus為厭氧型細(xì)菌，表面層與外界環(huán)境接觸距離近，氧含量高，里芯層與外界環(huán)境距離遠(yuǎn)，氧含量低。表面層的Lentibacillus和Bacillus豐度含量上升，里芯層的Lentibacillus和Bacillus豐度含量下降，有研究表明，Lentibacillus物種屬于Bacillaceae，在白酒生產(chǎn)中的作用可能與Bacillus屬相似[17]。“倒堆”前后，表面層和里芯層的Lactobacillus豐度含量上升，Lentibacillus豐度含量下降，Zhang 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境溫度和堆積所產(chǎn)生的生物熱導(dǎo)致堆積酒醅中溫度的差異，可以影響Lactobacillus的生長代謝，進(jìn)而影響整體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律[19]?！暗苟选焙?，表面層的Lactobacillus相對豐度含量顯著上升并達(dá)到70.8%（B84 h），里芯層的Lactobacillus相對豐度含量呈下降趨勢。表面層的Bacillus豐度含量下降，在里芯層的豐度含量則上升。有研究報道芽孢桿菌屬Bacillus屬于嗜熱菌屬，不僅產(chǎn)生可以促進(jìn)酒醅液化的α-淀粉酶，還產(chǎn)生中性或酸性蛋白酶，這些生物酶催化淀粉和蛋白質(zhì)降解為葡萄糖、氨基酸和高級脂肪酸[20]。

2.3 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步探究北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過程中表面層與里芯層細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化規(guī)律，聚焦堆積發(fā)酵過程中相對豐度較高的細(xì)菌屬，分別計算兩兩細(xì)菌屬間的Spearman 相關(guān)系數(shù)，繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。由圖6A 和圖6B 中可知，第六輪次堆積發(fā)酵表面層的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖包含39 個細(xì)菌屬間的正相關(guān)關(guān)系，10 個負(fù)相關(guān)關(guān)系；里芯層的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖包含44 個細(xì)菌屬間的正相關(guān)關(guān)系，13個負(fù)相關(guān)關(guān)系。相關(guān)性分析表明大多數(shù)細(xì)菌屬之間呈正相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。

相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中的高相關(guān)性關(guān)鍵節(jié)點是指與分類水平前20 名的物種與其他微生物均有相關(guān)性的微生物，又稱關(guān)鍵性位點（hubs）[21]，其數(shù)量和種類可直觀的反映微環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[21]。在圖6A 中發(fā)現(xiàn)，表面層微生物中共有15 個hubs，圖6B 中發(fā)現(xiàn)，里芯層微生物中共有18 個hubs。在圖4A 和圖4B 中相對豐度含量較高的Lactobacillus和Lentibacillus呈負(fù)相關(guān)，無論是表面層還是里芯層的Lactobacillus均與多個細(xì)菌菌屬呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，成為核心負(fù)相關(guān)性hubs 之一，與其他9 個細(xì)菌菌屬存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明在堆積發(fā)酵中Lactobacillus對部分細(xì)菌菌屬有拮抗作用，Li 等[22]研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus的相對豐度在發(fā)酵谷物中也占據(jù)絕對優(yōu)勢。在堆積發(fā)酵過程中，Lactobacillus可以產(chǎn)生乳酸，乳酸是乳酸乙酯的前體，可以增強(qiáng)中國白酒的醇厚感[23]；Lactobacillus還可以產(chǎn)生大量乙酸，乙酸的堆積可以顯著降低酒醅的pH 值，從而抑制不耐酸微生物的生長[24]。從圖6A 中同樣可以看出Bacillus與多數(shù)細(xì)菌菌屬呈正相關(guān)，成為主要的正相關(guān)hubs 之一。芽孢桿菌是一種重要的微生物，在白酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生芳香物質(zhì)[25]。地衣芽孢桿菌可以產(chǎn)生四甲基吡嗪、苯乙醇和高級脂肪酸酯，它們給白酒帶來獨特的風(fēng)味和額外的健康益 處[26]。Saccharopolyspora和norank_f__Actinopolysporaceae也為核心正相關(guān)hubs，分別與10 個和8 個細(xì)菌菌屬間存在正相關(guān)關(guān)系。從圖6B 中可以得知，里芯層的Lentibacillus與10 個細(xì)菌菌屬呈正相關(guān)，屬于核心正相關(guān)hubs 之一，這可能與其含量在“倒堆”前較高有關(guān)（圖4B）。“倒堆”影響了微生物的種類與含量，進(jìn)而影響了表面層與里芯層微生物間的相互作用關(guān)系，最終影響了微生物發(fā)酵過程中的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制，維持了整個堆積體系的自然穩(wěn)態(tài)發(fā)展和動態(tài)平衡[27]。

圖6 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過程中細(xì)菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 Beta多樣性分析

從圖7 中可以清晰看出，“倒堆”操作的發(fā)生擾亂了整個發(fā)酵體系，影響了不同堆積時長樣本的物種組成。相較于表面層（圖7 A），里芯層（圖7 B）的細(xì)菌菌屬群落在“倒堆”操作后變化更為明顯。隨著堆積發(fā)酵時長的延長，堆積發(fā)酵堆子的不同空間位置的理化指標(biāo)（如酸度含量、還原糖含量、酒精度、含氧量與溫度）均出現(xiàn)差異[28]，“倒堆”操作可以更好的調(diào)控這些差異，促進(jìn)優(yōu)勢菌群的生長[29]。

圖7 北京地區(qū)醬香型白酒第六輪次堆積發(fā)酵過程中表面層和里芯層細(xì)菌群落的Beta多樣性分析

3 結(jié)果與討論

本研究利用高通量測序方法分析比較了北京地區(qū)第六輪次醬香型白酒堆積發(fā)酵中表面層和里芯層的細(xì)菌結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化。

在細(xì)菌α多樣性分析上，發(fā)現(xiàn)無論是表面層還是里芯層的Shannon 指數(shù)在“倒堆”前后均明顯下降?！暗苟选辈僮魇贡砻鎸雍醚跷⑸锫竦嚼镄緦痈艚^空氣，里芯層厭氧微生物與大量的空氣接觸，達(dá)到控制菌群種類與數(shù)量的目的，延長堆積發(fā)酵時間使原料各個位置組分發(fā)酵更為完全，為入窖發(fā)酵做好準(zhǔn)備，同時提高最后輪次產(chǎn)酒的質(zhì)量與風(fēng)味。

在細(xì)菌群落組成分析上，表面層和里芯層的優(yōu)勢屬共有12 個，為Lactobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Bacillus、Staphylococcus、Pediococcus、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora、Sporolactobacillaceae、Weissella和Bacillaceae，總和占總菌屬相對豐度95 %以上。說明“倒堆”操作并沒有改變表面層和里芯層的菌屬種類，只調(diào)控了微生物堆積發(fā)酵的過程，維持了整個堆積體系的自然穩(wěn)態(tài)發(fā)展和動態(tài)平衡。

在細(xì)菌Beta多樣性分析上，里芯層在“倒堆”操作后，細(xì)菌群落組成變化差異比表面層更為明顯，這可能是因為除了氧氣含量，“倒堆”前堆積發(fā)酵中產(chǎn)生的乙酸、乳酸與生物熱等隨著空間位置的原因積攢在里芯層，導(dǎo)致里芯層細(xì)菌受外界環(huán)境因素的影響程度強(qiáng)于表面層，群落變化差異明顯。

本研究可為了解北京地區(qū)醬香型白酒釀造過程中細(xì)菌群落演替提供數(shù)據(jù)支撐，為探究不同產(chǎn)區(qū)白酒釀造的特征差異提供科學(xué)基礎(chǔ)，解釋“倒堆”操作對堆積發(fā)酵的影響，為生產(chǎn)實際提供基礎(chǔ)參數(shù)，在未來可以加強(qiáng)對“倒堆”工藝的管理與控制。