章銀良，黃天琪，郭浩彬，趙宇，程夢(mèng)夢(mèng)，張麗，黃圓圓

(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001)

美拉德反應(yīng)(Maillard reaction，MR)是指在一定條件下含羰基的碳水化合物與含氨基的氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)之間的兩種基團(tuán)發(fā)生縮合反應(yīng)。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products,MRPs)是指羰基化合物和氨基化合物形成的復(fù)雜的棕黑色聚合物[1-2]。MRPs中因?yàn)榫哂羞€原酮、呋喃、類(lèi)黑精等物質(zhì)而具有較強(qiáng)的抗氧化活性[3-5]。食品加工過(guò)程中合理利用MRPs中抗氧化活性物質(zhì)的生成能夠很好地提高食品的貨架期、抑菌性等性能[6-7]。美拉德反應(yīng)在食品熱加工過(guò)程中經(jīng)常發(fā)生，且MRPs能和BHA、BHT等人工合成的抗氧化劑相媲美，因此,MRPs 也被稱(chēng)為天然抗氧化劑[8]。多數(shù)研究表明MRPs對(duì)脂質(zhì)氧化具有較好的抑制作用[9]。阮雁春等[10]將花生蛋白水解物和半乳糖反應(yīng)產(chǎn)生的MRPs應(yīng)用于豬肉脯中，發(fā)現(xiàn)MRPs能夠很好地抑制豬肉脯中蛋白和脂質(zhì)的氧化，起到護(hù)色和抗氧化的作用。葛偉等[11]研究表明超聲處理的酪蛋白-葡萄糖的MRPs具有很好的抗脂質(zhì)體氧化能力。章銀良等[12]應(yīng)用L-賴氨酸和D-阿拉伯糖反應(yīng)產(chǎn)生的MRPs與人工合成的BHA對(duì)肉餡進(jìn)行抗氧化活性比較，發(fā)現(xiàn)6% MRPs的處理組與添加0.02%BHA的肉餡抗氧化程度相近。

脂質(zhì)的氧化是造成食品變質(zhì)的重要原因之一[13]，油脂的氧化主要分為4種，分別是自動(dòng)氧化、光氧化、酶促氧化和熱氧化[14]。其中自動(dòng)氧化占比最大，自動(dòng)氧化過(guò)程主要分為誘導(dǎo)過(guò)程、自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程和二級(jí)氧化產(chǎn)物生成過(guò)程[15]。油脂氧化自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量自由基(R·、RO·、ROO·)，由于自由基存在時(shí)間較短，因此很難被捕捉到，電子自旋共振技術(shù)(electron spin resonance，ESR)能利用自由基的順磁性直接以譜圖的形式反映出自由基的含量以及種類(lèi)，能夠很好地借助其闡述油脂氧化的過(guò)程[16-17]。本文旨在利用ESR技術(shù)測(cè)定氧化前期的自由基總量和自由基種類(lèi)，以及過(guò)氧化值(POV)、茴香胺值(AV)、2-硫代巴比妥酸值(TBA)，從不同階段類(lèi)比研究L-精氨酸-D-核糖的MRPs與常見(jiàn)的抗氧化劑(BHA、TBHQ、茶多酚)對(duì)花生油的抗氧化效果，為完善天然抗氧化劑的檢測(cè)方法和深入研究MRPs提供了參考依據(jù)。

1 材料、設(shè)備與方法

1.1 試劑與材料

花生油(未添加抗氧化劑)：鄭州市紫竹路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；D-核糖(AR)、L-精氨酸(AR)：北京索萊寶科技有限公司；冰乙酸(AR)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；正丁醇(AR)、氫氧化鈉(AR)、可溶性淀粉、無(wú)水乙醇(AR)：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷(AR)、鹽酸(AR)：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH) (AR，進(jìn)口試劑)；丁基羥基茴香醚(BHA)(AR)、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)(AR)、異辛烷(AR)、N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)(97%)、P-茴香胺(AR)、硫代硫酸鈉(AR)、碘化鉀(AR)、2-硫代巴比妥酸(AR)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)(AR)：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；電子順磁共振波譜儀 美國(guó)布魯克科技(北京)有限公司；FE20 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-S水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠；DH-400A電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

在前期的優(yōu)化試驗(yàn)中，我們通過(guò)均勻試驗(yàn)得出L-精氨酸-D-核糖的最優(yōu)條件為精氨酸∶核糖為1∶1、pH 12、反應(yīng)時(shí)間200 min、反應(yīng)溫度160 ℃，其生產(chǎn)的MRPs對(duì)DPPH·的清除率為64.34%。DPPH自由基清除率測(cè)定方法：MRPs稀釋50倍，取500 μL與2 mL的0.5 mmol/L DPPH混合，暗反應(yīng)20 min后，立即放入電子順磁共振波譜儀的諧振腔中，待儀器自動(dòng)調(diào)諧完畢后開(kāi)始測(cè)量。ESR測(cè)定條件：頻率9.792 069 GHz，功率5.00 mW，中心磁場(chǎng)3 487 G，掃描寬度100 G，調(diào)制幅度2.27 G，調(diào)制頻率86.00 kHz，時(shí)間常數(shù)40.96，掃描時(shí)間83.88 s(20.97 s×4次)，橫坐標(biāo)點(diǎn)數(shù)512，接收機(jī)增益3.17×103。

1.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)量1.25 g D-核糖和1.25 g L-精氨酸，溶解于45 mL的去離子水中，并分別用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH至12.0，然后用去離子水定容至50 mL，混合均勻，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，置于160 ℃恒溫油浴槽中反應(yīng)200 min。反應(yīng)結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進(jìn)行相關(guān)測(cè)定，剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗氧化劑待測(cè)樣品的配制

取花生油置于錐形瓶中，按照GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的規(guī)定加入0.02%的BHA、TBHQ、茶多酚以及MRPs(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%)，超聲5 min后備用。

1.3.3 自由基總量的測(cè)定

溫度組：在1 mL花生油樣品中加入10 mg PBN捕獲劑(對(duì)照組加入6% MRPs)并超聲5 min，溶解后，用10 mL的注射器將其注射進(jìn)核磁管中，甩至底部。將其分別置于60，80，100，120，140 ℃的油浴鍋中，加熱2 min后迅速取出，置于電子自旋共振波譜儀的共振腔中，測(cè)定ESR強(qiáng)度(用二重積分表示)。

時(shí)間組：在1 mL花生油樣品及抗氧化劑待測(cè)樣品中加入10 mg PBN捕獲劑，并超聲5 min溶解后，用10 mL的注射器將其注射進(jìn)核磁管中，甩至底部。將其置于100 ℃的油浴鍋中，每隔2 min迅速取出，置于電子自旋共振波譜儀的共振腔中，測(cè)定ESR強(qiáng)度(用二重積分表示)。

1.3.4 花生油氧化不同自由基含量的測(cè)定

在1 mL加入不同抗氧化劑的花生油油樣及未加入抗氧化劑的花生油油樣中加入50 μL DMPO后超聲5 min，溶解后，用10 mL的注射器將其注射進(jìn)核磁管中甩至底部。將其置于120 ℃的油浴鍋中，每隔1 min迅速取出，置于電子自旋共振波譜儀的共振腔中，測(cè)定ESR強(qiáng)度(用二重積分表示)。

儀器測(cè)定條件：中心磁場(chǎng)3 487 G；掃描寬度100 G；微波頻率9.831 712 GHz；微波功率5 mW；調(diào)制幅度2.27 G；調(diào)制頻率100 kHz；保留時(shí)間40.96 s；掃描次數(shù)4次。

1.3.5 花生油主要品質(zhì)指標(biāo)的檢測(cè)

采用Schaal烘箱加速氧化試驗(yàn)研究花生油的氧化穩(wěn)定性[18-19]，取100 g油樣于錐形瓶中。將抗氧化劑待測(cè)油樣和花生油油樣置于(60±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光保存，每隔 1 d 取樣一次測(cè)定油樣的過(guò)氧化值(POV)、茴香胺值(AV)和2-硫代巴比妥酸值(TBA)。茴香胺值的測(cè)定參照 GB/T 24304—2009《動(dòng)植物油脂 茴香胺值的測(cè)定》;2-硫代巴比妥酸值的測(cè)定參照GB/T 35252—2017《動(dòng)植物油脂2-硫代巴比妥酸值的測(cè)定 直接法》；過(guò)氧化值的測(cè)定參照 GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》中的滴定法。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均做3次平行，采用WinEPR-Processing、Simfonia、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相關(guān)方法進(jìn)行處理，并用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05表示差異顯著)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同抗氧化劑對(duì)花生油自由基總量的影響

PBN捕獲的花生油ESR譜圖及擬合曲線見(jiàn)圖1。

圖1 PBN捕獲的花生油ESR譜圖及擬合曲線Fig.1 ESR spectrogram and fitting curve of peanut oil captured by PBN

PBN捕獲的花生油的ESR譜圖常用于表示油脂氧化生成的自由基的相對(duì)定量研究[20]，其譜圖的二重積分可表示為氧化前期自由基生成的總量，PBN捕獲的油脂自由基由1個(gè)N核和1個(gè)H核構(gòu)成，第三峰和擬合曲線不一致是因?yàn)榛ㄉ途哂休^大的黏性，導(dǎo)致實(shí)際信號(hào)和擬合信號(hào)不一致。

不同溫度花生油自由基總量的影響曲線圖見(jiàn)圖2。

圖2 不同溫度花生油自由基總量的影響曲線圖Fig.2 Effect curves of the total amount of peanut oil radicals at different temperatures

隨著溫度的升高，花生油氧化產(chǎn)生的自由基越多，且高溫會(huì)導(dǎo)致自由基產(chǎn)生的速率增快，結(jié)果與李培等的研究一致。加入MRPs能夠延緩油脂的氧化。在溫度低于80 ℃時(shí)加入MRPs與空白組自由基總量十分接近，這說(shuō)明花生油中也有一定的抗氧化活性物質(zhì)，例如VE等，能夠在前期對(duì)油脂氧化進(jìn)行保護(hù)，而隨著溫度進(jìn)一步升高，MRPs對(duì)油脂自由基生成的抑制作用顯著提高。

不同抗氧化劑對(duì)花生油自由基總量的抑制情況見(jiàn)圖3。

圖3 不同抗氧化劑對(duì)花生油自由基總量的抑制曲線圖Fig.3 Inhibition curves of different antioxidants on total amount of free radicals in peanut oil

由圖3可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，花生油的氧化程度不斷加深。根據(jù)自由基生成總量對(duì)上述抗氧化劑的抗氧化效果進(jìn)行排序，即自由基清除能力大小依次為4% MRPs>6% MRPs>2% MRPs>TBHQ>BHA>茶多酚。隨著MRPs濃度不斷增加，其抗氧化效果也不斷增強(qiáng)。加入茶多酚后，理論上能夠提高花生油的抗氧化活性[21]，高溫下反而比空白花生油樣產(chǎn)生更多的自由基，這一原因需要進(jìn)一步研究。

2.2 不同抗氧化劑對(duì)花生油自由基總量的影響

不同加熱時(shí)間的花生油ESR譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 不同加熱時(shí)間的花生油ESR譜圖Fig.4 ESR spectrograms of peanut oil heated for different time

由圖4中B可知，未加熱時(shí)DMPO捕獲到的自由基為ROO·，而未捕獲到R·，這可能是由于油樣放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或注射器注射時(shí)混入過(guò)多的氧氣，導(dǎo)致烷基自由基氧化，而隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸捕獲到烷基自由基和DMPO-X自由基(見(jiàn)圖4中C和D)，而未捕獲到RO·，RO·一旦產(chǎn)生則很快參與自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而生成其他中間產(chǎn)物，導(dǎo)致其含量低，達(dá)不到儀器檢測(cè)限[22]。而烷基自由基的生成說(shuō)明溫度的升高能夠加速油脂自由基的生成，這和前期的試驗(yàn)結(jié)果一致，且花生油的氧化過(guò)程符合油脂氧化自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[15]。加熱3 min時(shí)的花生油ESR譜圖見(jiàn)圖4中C，其中1，2，3分別表示烷基自由基、烷過(guò)氧自由基、DMPO-X自由基。由圖4中A可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，DMPO捕獲到的花生油的ESR譜圖的峰高和峰數(shù)在不斷變化，且加熱能夠催化烷基自由基和烷過(guò)氧自由基的生成，當(dāng)加熱到4 min時(shí)，DMPO已經(jīng)過(guò)度出現(xiàn)開(kāi)環(huán)現(xiàn)象。

選取烷基自由基的第一條峰高和烷過(guò)氧自由基的第一條峰高繪制不同抗氧化劑對(duì)花生油氧化前期自由基的影響曲線圖，見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 烷過(guò)氧自由基隨時(shí)間變化曲線圖Fig.5 Changing curves of alkyl-peroxy radicals with time

圖6 烷基自由基隨時(shí)間變化曲線圖Fig.6 Changing of curves alkyl radicals with time

由圖5可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，烷過(guò)氧自由基的信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，升高的原因在于加熱加速油脂氧化，導(dǎo)致烷過(guò)氧自由基迅速積累，因此信號(hào)強(qiáng)度不斷增大，而進(jìn)一步加熱，核磁管中的氧氣有限，新生成的烷過(guò)氧自由基會(huì)減少，且大量的烷過(guò)氧自由基會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槎?jí)氧化產(chǎn)物[15]，因此造成烷過(guò)氧自由基信號(hào)強(qiáng)度不斷降低。此外由圖5可知，添加抗氧化劑可以抑制烷過(guò)氧自由基的生成，抑制效果由強(qiáng)到弱依次為2% MRPs>4% MRPs>茶多酚>TBHQ>6% MRPs>BHA。此外，加入抗氧化劑的花生油樣品比空白樣品的烷過(guò)氧自由基的下降時(shí)間有所提前，這極有可能是抗氧化劑消耗核磁管中的氧氣所致，因而對(duì)花生油具有保護(hù)作用。

由圖6可知，烷基自由基隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸積累，而茶多酚和TBHQ的烷基自由基含量要高于空白油樣組，綜上所述，由烷過(guò)氧自由基與空白油樣對(duì)比可推測(cè)，茶多酚和TBHQ的作用效果極有可能是阻止油脂鏈?zhǔn)阶杂苫袕耐榛杂苫蛲檠踝杂苫屯檫^(guò)氧自由基生成這一過(guò)程。隨著MRPs添加量的不斷增大，烷基自由基的生成量不斷減少，說(shuō)明烷基自由基的生成量和MRPs的添加量相關(guān)，烷基自由基量大小為：2% MRPs>4% MRPs>6% MRPs，而上述烷過(guò)氧自由基和自由基總量MRPs低于空白油樣，因此MRPs也極有可能和TBHQ的作用機(jī)制一致。添加BHA的樣品生成的烷基自由基的信號(hào)強(qiáng)度明顯弱于空白組，因此BHA可抑制烷基自由基的生成且可能能夠作用于鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng)前期誘導(dǎo)作用這一過(guò)程。

2.3 不同抗氧化劑對(duì)花生油品質(zhì)的影響

不同抗氧化劑對(duì)花生油品質(zhì)的影響見(jiàn)圖7～圖9。

圖7 不同抗氧化劑對(duì)花生油過(guò)氧化值的影響曲線圖Fig.7 Effect curves of different antioxidants on the peroxide value of peanut oil

由圖7可知，添加抗氧化劑和MRPs能夠很好地抑制油脂的過(guò)氧化物以及醛類(lèi)、酮類(lèi)物質(zhì)的生成。隨著加速氧化的進(jìn)行，空白組和對(duì)照組的過(guò)氧化值隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，對(duì)于花生油的氧化保護(hù)作用由強(qiáng)到弱依次為T(mén)BHQ>4% MRPs>6% MRPs>2% MRPs>茶多酚>BHA，在加速氧化前3 d可以觀察到MRPs對(duì)花生油的抑制效果隨其濃度的增大而增大，而后4% MRPs抑制過(guò)氧化物的能力>6% MRPs的抑制能力，這可能是用于MRPs本身的抗氧化作用能夠抑制油脂氧化，而MRPs的加入也意味著會(huì)加入水，而水的加入會(huì)促進(jìn)油脂氧化，因此POV(4% MRPs)

圖8 不同抗氧化劑對(duì)花生油TBA值的影響曲線圖Fig.8 Effect curves of different antioxidants on the TBA value of peanut oil

由圖8可知，隨著加速氧化的不斷進(jìn)行，花生油不斷氧化產(chǎn)生丙二醛，上述抗氧化劑對(duì)于丙二醛的生成均具有較好的抑制效果。不同抗氧化劑抑制丙二醛的能力強(qiáng)弱依次為T(mén)BHQ>6% MRPs>茶多酚>4% MRPs>2% MRPs>BHA，因此MRPs的添加量越大，對(duì)于花生油氧化生成的丙二醛的抑制效果越好。因此合理添加MRPs有利于抑制花生油的氧化，提高花生油的品質(zhì)。

圖9 不同抗氧化劑對(duì)花生油AV值的影響曲線圖Fig.9 Effect curves of different antioxidants on the AV value of peanut oil

由圖9可知，隨著加速氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，花生油的茴香胺值不斷增大，添加的各種抗氧化劑對(duì)于AV值的抑制強(qiáng)弱約為T(mén)BHQ>BHA>茶多酚>4% MRPs>6% MRPs>2% MRPs，幾種抗氧化劑對(duì)于花生油氧化產(chǎn)生的游離脂肪酸的效果較為接近。

3 結(jié)論

運(yùn)用ESR探究不同抗氧化劑對(duì)花生油自由基總量和種類(lèi)可以得出：花生油隨著加熱溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，其自由基總量不斷增大。茶多酚和TBHQ會(huì)使花生的烷基自由基增大，但是會(huì)抑制烷基自由基向烷過(guò)氧自由基轉(zhuǎn)化這一過(guò)程，MRPs和BHA能夠抑制花生油生成烷基自由基和烷過(guò)氧自由基，且MRPs的抑制效果與其添加量呈正相關(guān)。通過(guò)測(cè)定花生油的POV值、AV值、TBA值可以得出：上述抗氧化劑均能很好地抑制花生油的氧化，其中抑制效果最好的抗氧化劑是TBHQ。MRPs的添加量能夠影響花生油氧化的二級(jí)產(chǎn)物的生成。綜上所述，運(yùn)用ESR分析脂質(zhì)的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，能更細(xì)致地了解油脂氧化的機(jī)制，MRPs能抑制花生油的氧化。