尹 旺， 鄧仁菊， 陳明俊， 羅小波， 雷尊國(guó)， 李 飛

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴州貴陽(yáng) 550006)

低溫糖化是馬鈴薯塊莖在低溫條件下的自我保護(hù)機(jī)制，是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，涉及塊莖低溫貯藏期間的淀粉降解與合成、蔗糖降解與合成、呼吸代謝等[1]。有關(guān)馬鈴薯低溫糖化相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究已成為馬鈴薯油炸加工型新品種培育的一個(gè)重要領(lǐng)域[2]。目前，馬鈴薯油炸加工型品種大西洋、snodon的區(qū)域適應(yīng)能力在逐步下降，栽培難度逐年增加，油炸加工型馬鈴薯新品種選育已成為我國(guó)當(dāng)前馬鈴薯新品種培育的短板[3]，其難點(diǎn)關(guān)鍵在于耐低溫糖化材料的創(chuàng)制和利用。因此，馬鈴薯耐低溫糖化能力鑒定和評(píng)價(jià)對(duì)油炸加工專用型馬鈴薯新品培育及產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。馬鈴薯塊莖中還原糖含量直接決定油炸品質(zhì)[4-5]。低溫條件下，馬鈴薯塊莖中還原糖含量升高的現(xiàn)象稱為馬鈴薯低溫糖化，而酸性轉(zhuǎn)化酶活性與馬鈴薯塊莖低溫糖化直接相關(guān)，抑制酸性轉(zhuǎn)化酶活性可以降低低溫貯藏下馬鈴薯塊莖的還原糖含量，改善油炸加工色澤[6-15]。當(dāng)前馬鈴薯中鑒定出了StInvInh2A、StInvInh2B2個(gè)PMEI類抑制子基因，能夠?qū)︸R鈴薯酸性轉(zhuǎn)化酶活性起到特異性抑制作用，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)超量或干涉其表達(dá)，能有效調(diào)控馬鈴薯低溫貯藏下的酸性轉(zhuǎn)化酶活力，從而調(diào)控馬鈴薯抗低溫糖化能力[16-18]。本研究前期研究測(cè)定馬鈴薯低溫糖化相關(guān)基因StInvInh2、StvacINV的相對(duì)表達(dá)量、低溫糖化生理生化指標(biāo)的還原糖含量、蔗糖含量、酸性轉(zhuǎn)化酶活性以及炸片色澤亨特系數(shù)a*、b*、L*，綜合評(píng)價(jià)47份馬鈴薯材料的耐低溫糖化能力。從而鑒選出耐低溫糖化馬鈴薯資源，為油炸加工專用型馬鈴薯新品種培育擴(kuò)大資源基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用的47份馬鈴薯材料由貴州省生物技術(shù)研究所提供，詳見表1。

表1 47份馬鈴薯材料名稱

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2020年10月收獲種植于貴州省畢節(jié)市威寧彝族回族苗族自治縣的47份馬鈴薯資源材料。將47份材料各取健康薯塊5個(gè)，室溫放置7 d，使表面充分木栓化。然后置于貴州省貴陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新大樓冰箱，4 ℃貯藏30 d后，再取出材料。將每個(gè)薯塊對(duì)半切開，一半用于生理生化指標(biāo)測(cè)定，一半用于分子指標(biāo)測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬鈴薯塊莖品質(zhì)測(cè)定 可溶性糖含量及酸性轉(zhuǎn)化酶活性參考張遲的方法[10]測(cè)定，還原糖含量采用二硝基水楊酸法測(cè)定，蔗糖含量采用國(guó)家衛(wèi)生部測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)(GB5009)測(cè)定。

1.3.2 馬鈴薯炸片色澤鑒定 利用立式炸片鍋進(jìn)行炸片，具體步驟如下：(1)馬鈴薯塊莖去皮，小型切片器切取厚2 mm左右薯片，置于清水中2 min；(2)取出切好的薯片，吸水紙吸干表面水分，做3個(gè)技術(shù)重復(fù)；(3)170 ℃油炸3 min至完全無(wú)水泡冒出；(4)拍照。炸片色澤采用Hunter Lab D25NC標(biāo)準(zhǔn)色差儀測(cè)定，在D65光源，距離100 mm，測(cè)定亨特系數(shù)(L*、a*、b*)。

1.3.3 基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

1.3.3.1 馬鈴薯塊莖總RNA提取 采用天根(DP441)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒。DP441試劑盒組成見表2。

1.3.3.2 RNA反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn) 參照TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Code No.FSQ-101)進(jìn)行，步驟如下：(1)RNA變性：將RNA樣品65 ℃水浴5 min，立即置于冰上冷卻(提高易于形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA的反轉(zhuǎn)錄效率)。(2)參照表3進(jìn)行反應(yīng)體系配制。(3)參照表4進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(PCR儀)。反應(yīng)完成后，置于-20 ℃或4 ℃保存，在進(jìn)行real time qPCR反應(yīng)時(shí)應(yīng)適當(dāng)稀釋。

表2 DP441試劑盒組成

表3 反應(yīng)體系

表4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

1.3.3.3 Real time qPCR試驗(yàn) 參照vazyme RT-qPCR試劑盒(AceQ?qPCR SYBR? Green Master Mix)進(jìn)行操作，步驟如下：(1)參照表5進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)體系配制。(2)RT-qPCR反應(yīng)程序。本試驗(yàn)采用兩步法程序反應(yīng)，RT-qPCR儀(博樂(lè) CFX96TMOptics Module，785BR06729)，程序見表6。(3)采用博樂(lè)對(duì)應(yīng)軟件Bio-Rad CFX 3.1/BioRadCFXManager進(jìn)行分析。

表5 RT-qPCR反應(yīng)體系

表6 RT-qPCR反應(yīng)程序

1.3.3.4 引物序列 本研究采用的引物名稱及引物序列見表7。

表7 引物名稱及引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫貯藏后相關(guān)品質(zhì)、相關(guān)基因表達(dá)量及炸片色澤亨特系數(shù)的變異分析

由表8可知，4 ℃貯藏30 d后，不同馬鈴薯材料低溫糖化相關(guān)基因(StvacINV、StInvInh2)的相對(duì)表達(dá)量、低溫糖化生理生化指標(biāo)、炸片色澤亨特系數(shù)的變異系數(shù)差異較大，其大小順序依次為StInvInh2相對(duì)表達(dá)量>還原糖含量>a*>酸性轉(zhuǎn)化酶活性>蔗糖含量>StvacINV相對(duì)表達(dá)量>L*>b*，其中StInvInh2相對(duì)表達(dá)量變異系數(shù)達(dá)到80.74%，還原糖含量變異系數(shù)達(dá)到79.34%，a*變異系數(shù)達(dá)到70.50%，酸性轉(zhuǎn)化酶活性變異系數(shù)達(dá)69.33%。

表8 馬鈴薯相關(guān)品質(zhì)、相關(guān)基因表達(dá)量及炸片色澤亨特系數(shù)的變異分析

2.2 低溫貯藏后馬鈴薯品質(zhì)、相關(guān)基因表達(dá)量及油炸色澤亨特系數(shù)間的相關(guān)性分析

從表9中可以看出，4 ℃貯藏30 d后，8個(gè)指標(biāo)間，6對(duì)指標(biāo)呈極顯著正相關(guān)，9對(duì)指標(biāo)呈極顯著負(fù)相關(guān)，其中還原糖含量與酸性轉(zhuǎn)化酶活性、亨特系數(shù)a*間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.967、0.701；與StInvInh2相對(duì)表達(dá)量、亨特系數(shù)L*、b*間呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 -0.771、-0.754、-0.513。蔗糖含量與StInvInh2相對(duì)表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.399；與亨特系數(shù)a*呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為 -0.405。酸性轉(zhuǎn)化酶活性與亨特系數(shù)a*間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.652；與StInvInh2相對(duì)表達(dá)量、亨特系數(shù)L*、b*呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.781、-0.710、-0.503。StvacINV相對(duì)表達(dá)量與其他指標(biāo)間不存在顯著相關(guān)性；StInvInh2相對(duì)表達(dá)量與亨特系數(shù)L*呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.664；與亨特系數(shù)a*呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.654。亨特系數(shù)L*與b*呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.553，與a*呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.864。

表9 馬鈴薯品質(zhì)、相關(guān)基因表達(dá)量及油炸色澤亨特系數(shù)間的相關(guān)性分析

2.3 低溫貯藏后馬鈴薯品質(zhì)、相關(guān)基因表達(dá)量及油炸色澤亨特系數(shù)主成分分析

表10顯示，前5個(gè)主要成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)96.142%，表明前5個(gè)主要成分涵括了不同馬鈴薯資源低溫貯藏后的主要差異指標(biāo)信息。其中，第1成分特征值為4.407，貢獻(xiàn)率為55.093%；第2成分特征值為1.338，貢獻(xiàn)率為16.729%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為71.822%；第3成分特征值為0.821，貢獻(xiàn)率為10.268%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為82.090%；第4成分特征值為0.605，貢獻(xiàn)率為7.563%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為89.653%。對(duì)前5個(gè)成分特征向量(表11)分析可知，第1成分中還原糖含量特征向量絕對(duì)值最大，為0.938，表明還原糖含量對(duì)第1成分影響最大，故篩選還原糖含量因子作為第1成分；第2成分中StvacINV相對(duì)表達(dá)量特征向量絕對(duì)值最大，為0.710，故篩選StvacINV相對(duì)表達(dá)量因子作為第2成分；第3成分中，因StvacINV相對(duì)表達(dá)量已作為第2成分，故篩選亨特系數(shù)b*因子作為第3成分，特征向量為-0.510；依次類推，第4成分和第5成分分別為蔗糖含量因子和亨特系數(shù)a*因子，特征向量分別為0.551、-0.416。

表10 馬鈴薯主要性狀的主成分分析

表11 前5個(gè)主成分對(duì)應(yīng)的特征向量

2.4 種質(zhì)資源聚類分析

采用平方歐式距離組內(nèi)鄰接法對(duì)47份馬鈴薯資源4 ℃貯藏30 d后的還原糖含量、蔗糖含量、酸性轉(zhuǎn)化酶活性、StvacINV相對(duì)表達(dá)量、StInvInh2相對(duì)表達(dá)量及亨特系數(shù)L*、a*、b*進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果顯示：當(dāng)平均歐式距離D=8時(shí)，將47份馬鈴薯資源分成5類(圖1)。第Ⅰ類18個(gè)資源(含炸片加工專用型品種大西洋、snodon)，該類還原糖含量為(3.1±1.0) mg/g，變幅1.38～5.46 mg/g；蔗糖含量為(2.19±0.76) mg/g，變幅1.35～3.35 mg/g；酸性轉(zhuǎn)化酶活性為(10.67±2.95) μgRS/(min·g)，變幅6.99～18.23 μgRS/(min·g)；StvacINV相對(duì)表達(dá)量為2.19±0.42，變幅1.4～2.9；StInvInh2相對(duì)表達(dá)量為3.87±1.50，變幅1.1～7.5；亨特系數(shù)L*為46.8±3.85，變幅36.33～52.55，亨特系數(shù)a*為7.49±2.08，變幅2.41～11.44，亨特系數(shù)b*為26.47±1.83，變幅21.60～29.08。第Ⅱ類16個(gè)資源，該類還原糖含量為(1.27±0.59) mg/g，變幅0.67～2.28 mg/g，蔗糖含量為(2.75±0.54) mg/g，變幅1.48～3.45 mg/g；酸性轉(zhuǎn)化酶活性為(6.30±2.21) μgRS/(min·g)，變幅3.85～10.33 μgRS/(min·g)；StvacINV相對(duì)表達(dá)量為2.08±0.46，變幅 1.3～3.2；StInvInh2相對(duì)表達(dá)量為8.87±3.25，變幅 3.6～13.4；亨特系數(shù)L*為54.11±3.31，變幅45.67～58.39，亨特系數(shù)a*為3.26±2.41，變幅0.39～8.89，亨特系數(shù)b*為25.22±2.11，變幅22.22～28.48。第Ⅲ類3個(gè)資源，該類還原糖含量為(10.04±1.12) mg/g，變幅9.34～11.34 mg/g，蔗糖含量為(2.45±0.49) mg/g，變幅2.16～3.02 mg/g；酸性轉(zhuǎn)化酶活性為(34.69±0.79) μgRS/(min·g)，變幅33.79～35.22 μgRS/(min·g)；StvacINV相對(duì)表達(dá)量為1.77±0.15，變幅 1.6～1.9；StInvInh2相對(duì)表達(dá)量為0.37±0.12，變幅0.3～0.5；亨特系數(shù)L*為44.27±3.68，變幅40.76～48.10，亨特系數(shù)a*為10.16±1.86，變幅8.04～11.50，亨特系數(shù)b*為25.16±3.17，變幅21.52～27.29。第Ⅳ類6個(gè)資源，該類還原糖含量為(6.48±0.86) mg/g，變幅5.73～7.99 mg/g，蔗糖含量為(1.64±0.25) mg/g，變幅1.37～1.99 mg/g；酸性轉(zhuǎn)化酶活性為(20.78±2.27) μgRS/(min·g)，變幅17.44～23.82 μgRS/(min·g)；StvacINV相對(duì)表達(dá)量為2.35±0.26，變幅2.1～2.8，StInvInh2相對(duì)表達(dá)量為1.32±0.38，變幅0.9～1.9；亨特系數(shù)L*為39.34±3.88，變幅34.59～44.91，亨特系數(shù)a*為11.45±0.57，變幅10.57～12.24，亨特系數(shù)b*為23.66±2.72，變幅19.92～26.76。第Ⅴ類4個(gè)資源，該類還原糖含量為(9.61±1.57) mg/g，變幅7.88～11.56 mg/g；蔗糖含量為(2.40±0.74) mg/g，變幅 1.68～3.26 mg/g；酸性轉(zhuǎn)化酶活性為(31.22±3.84) μgRS/(min·g)，變幅28.45～36.87 μgRS/(min·g)；StvacINV相對(duì)表達(dá)量為2.23±0.15，變幅2.1～2.4，StInvInh2相對(duì)表達(dá)量為0.70±0.22，變幅0.4～0.9；亨特系數(shù)L*為33.07±2.09，變幅30.47～35.14，亨特系數(shù)a*為11.51±1.28，變幅9.67～12.46，亨特系數(shù)b*為18.44±2.89，變幅15.25～21.98。

3 討論與結(jié)論

已有研究表明：馬鈴薯酸性轉(zhuǎn)化酶直接參與塊莖低溫糖化過(guò)程[10-14]，故酸性轉(zhuǎn)化酶活性相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)均可影響馬鈴薯耐低溫糖化能力，前期研究發(fā)現(xiàn)煙草酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因VIH[19]和馬鈴薯酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因StInvInh2[18]均可調(diào)節(jié)馬鈴薯塊莖還原糖含量。本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯低溫貯藏后，StInvInh2相對(duì)表達(dá)量與酸性轉(zhuǎn)化酶活性、還原糖含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明馬鈴薯酸性轉(zhuǎn)化酶抑制子基因可能通過(guò)抑制酸性轉(zhuǎn)化酶活性， 從而影響塊莖蔗糖代謝，從而降低塊莖中還原糖含量。同時(shí)，塊莖中的還原糖含量、酸性轉(zhuǎn)化酶活性與炸片色澤亨特系數(shù)L*、a*、b*均存在極顯著相關(guān)性，StInvInh2相對(duì)表達(dá)量與炸片色澤亨特系數(shù)L*、a*均存在極顯著相關(guān)性，而StvacINV相對(duì)表達(dá)量與炸片色澤亨特系數(shù)L*、a*、b*相關(guān)性不顯著，表明在低溫貯藏中，還原糖含量、酸性轉(zhuǎn)化酶活性、StInvInh2相對(duì)表達(dá)量是馬鈴薯油炸加工色澤變化的主要內(nèi)在因素，馬鈴薯低溫糖化的關(guān)鍵在于酸性轉(zhuǎn)化酶活性和其抑制子基因StInvInh2的相對(duì)表達(dá)量，而酸性轉(zhuǎn)化酶基因StvacINV的相對(duì)表達(dá)量在馬鈴薯低溫糖化過(guò)程中影響較小。

表12 5個(gè)類群的類平均標(biāo)準(zhǔn)差及變幅

目前，我國(guó)馬鈴薯油炸加工專用型新品種選育工作進(jìn)展緩慢。油炸加工專用型馬鈴薯品種單一且自育品種少[3，20]，本研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯低溫貯藏后遺傳多樣性豐富，其中以還原糖含量、酸性轉(zhuǎn)化酶活性、StInvInh2相對(duì)表達(dá)量、亨特系數(shù)a*4個(gè)指標(biāo)變異系數(shù)較大，含豐富的遺傳信息，而主成分分析結(jié)果中前5個(gè)特征向量分別為還原糖含量、StvacINV相對(duì)表達(dá)量、亨特系數(shù)b*、蔗糖含量、亨特系數(shù)a*，可作為馬鈴薯資源低溫貯藏后差異分析的主要因子。另外，對(duì)47份資源的聚類分析結(jié)果表明，第Ⅱ類共16份馬鈴薯資源的耐低溫糖化能力明顯優(yōu)于其他4類，包括優(yōu)于目前油炸加工專用型馬鈴薯品種大西洋、snodon，因此可作為下一步油炸加工型馬鈴薯品種的更新和品種儲(chǔ)備。