王學(xué) 任麗君 張英為 周玉皆 (南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

細(xì)胞衰老現(xiàn)象最早在1961年被報(bào)道〔1〕，美國生物學(xué)家Leonard Hayflick 在體外培養(yǎng)正常人的成纖維細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使細(xì)胞在最適宜的條件，細(xì)胞分裂至一定代數(shù)時(shí)也會(huì)發(fā)生停滯，由此細(xì)胞周期進(jìn)入了一種“不可逆”的停滯狀態(tài)。Hayflick 基于這種現(xiàn)象提出了細(xì)胞衰老的概念。因此，細(xì)胞增殖的能力極限也被稱為 Hayflick 極限。研究表明〔2〕，這種現(xiàn)象是隨著復(fù)制次數(shù)的增多，染色體兩端端粒的逐步縮短伴隨端粒酶活性降低所致。后來，隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)許多因素均可導(dǎo)致細(xì)胞衰老，常見的包括活性氧自由基的產(chǎn)生、癌基因的激活或抑癌基因的失活、輻射及各種細(xì)胞因子和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。本文就細(xì)胞衰老分子機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞衰老

根據(jù)發(fā)生機(jī)制的不同，細(xì)胞衰老可分為兩大類，第一種由生理性原因引起的細(xì)胞衰老，稱之為復(fù)制性衰老。第二種是指細(xì)胞在達(dá)到 Hayflick極限之前，細(xì)胞就開始了衰老過程，被稱之為過早性衰老。衰老細(xì)胞可表現(xiàn)出一系列類似且特異性的特點(diǎn)，這些特點(diǎn)可以作為判斷細(xì)胞衰老的標(biāo)準(zhǔn)。這些特征包括：①細(xì)胞長久地處于細(xì)胞周期阻滯或永久退出細(xì)胞周期，增殖標(biāo)志(如Ki67)缺失;②形態(tài)上，衰老細(xì)胞通常變得扁平，胞體和胞核的體積變大;③衰老細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加，即形成衰老相關(guān)異染色質(zhì)集落(SAHF)。在衰老細(xì)胞內(nèi)，SAHF主要表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集，DNA凝結(jié)成散在、致密、大小不均一的異染色質(zhì)顆粒;④端?？s短;⑤衰老相關(guān)分泌表型(SASP)：衰老細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，如胰島素樣生長因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、白介素(IL)、Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1等，這些因子通過自分泌或旁分泌的方式作用于衰老細(xì)胞本身或周圍其他細(xì)胞，從而改變衰老細(xì)胞及其周圍的微環(huán)境;⑥表達(dá)腫瘤抑制因子P16，P21，P53等;⑦表達(dá)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)， SA-β-gal是一種催化β-半乳糖苷水解為單糖的水解酶，在衰老細(xì)胞中過度積累和表達(dá)。

2 細(xì)胞衰老的機(jī)制

2.1端粒參與細(xì)胞衰老的發(fā)生機(jī)制 端粒是由DNA(5'-TTAGGG-3')重復(fù)序列和6種特異性蛋白質(zhì)組成的環(huán)構(gòu)象的特殊結(jié)構(gòu)，位于染色體兩端，其功能是保護(hù)染色體的末端免受DNA修復(fù)過程的侵蝕或融合〔2〕。細(xì)胞分裂周期中端粒逐漸縮短，當(dāng)縮短至Hayflick 極限時(shí)，端粒末端暴露、染色體觸發(fā)經(jīng)典的DNA損傷修復(fù)(DDR)反應(yīng)，細(xì)胞周期進(jìn)入衰老停滯狀態(tài)〔3〕。且隨著年齡的增長端粒縮短和衰老細(xì)胞的數(shù)量均會(huì)增加〔4〕。端粒酶是合成端粒DNA的核糖核蛋白，由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和非編碼RNA端粒酶(TERC)組成，負(fù)責(zé)維持端粒長度，還可影響線粒體功能〔5〕。CCHC域含多克隆抗體(ZCCHC)8是脊椎動(dòng)物的一種含鋅關(guān)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)端粒酶3'末端成熟。TERT、TERC或ZCCHC8的雜合突變均可表現(xiàn)為經(jīng)典的短端粒綜合征，從而導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)〔6〕。

2.2抑癌基因參與的細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制 磷酸酶基因(PTEN)位于十號(hào)染色體，為一種抑癌基因，具有磷酸酯酶的活性。在各種細(xì)胞中通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/ 蛋白激酶B(AKT)途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、凋亡和黏附。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB是PI3K/AKT信號(hào)通路的重要靶標(biāo)，且NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑可促進(jìn)SASP的出現(xiàn)。體外實(shí)驗(yàn)表明，用博來霉素處理肺泡上皮細(xì)胞(AEC)觀察到AEC出現(xiàn)細(xì)胞衰老的同時(shí)PTEN基因表達(dá)也降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除PTEN基因可加速AEC衰老，而敲低NF-κB的表達(dá)或通過藥理抑制NF-κB信號(hào)可逆轉(zhuǎn)AEC衰老。在肺纖維化動(dòng)物模型中，上調(diào)PTEN基因表達(dá)可延長小鼠的壽命，其下調(diào)可加速小鼠衰老。這些結(jié)果表明，PTEN基因經(jīng)由NF-κB信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控細(xì)胞衰老，PTEN基因下調(diào)/缺失與肺泡上皮細(xì)胞衰老相關(guān)〔7〕。

2.3線粒體參與的細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制 線粒體是負(fù)責(zé)產(chǎn)能的雙膜細(xì)胞器，其完整性是通過生物合成和吞噬等多個(gè)過程協(xié)調(diào)維持，統(tǒng)稱為線粒體質(zhì)量控制(MQC)。MQC失調(diào)和炎癥發(fā)生是細(xì)胞衰老和衰老相關(guān)性疾病的主要特征之一，稱為線粒體功能障礙〔8〕。眾多學(xué)者認(rèn)為線粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體活性氧(ROS)持續(xù)增加，使得線粒體DNA突變積累，氧化磷酸化、抗氧化防御能力受損加重DDR，導(dǎo)致細(xì)胞衰老的發(fā)生〔9〕。

此外，研究發(fā)現(xiàn)在衰老的AEC中雷帕霉素/過氧化物酶體增殖物激活的受體-γ復(fù)合物1α/β(mTOR/PGC-1α/β)軸明顯上調(diào)。在肺纖維化小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，隨著該軸的激活細(xì)胞中線粒體數(shù)目、氧化磷酸化過程、ROS產(chǎn)量均增加。抑制mTOR復(fù)合物1的功能不僅恢復(fù)了線粒體的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)也降低了AEC的衰老。Summer等〔10〕將線粒體特異性超氧化物清除劑MitoTempo處理暴露于博萊霉素后的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)mTOR /PGC-1α/β軸的活性、線粒體耗氧量、細(xì)胞衰老標(biāo)志物的表達(dá)均顯著降低。由此推測(cè)，mTOR /PGC-1α/β軸在線粒體參與細(xì)胞衰老的過程中起到了重要的參與和調(diào)控作用。

2.4輻射參與的細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制 放射治療是現(xiàn)在多種腫瘤的基本治療手段，放療產(chǎn)生的電離輻射(IR)卻是細(xì)胞衰老的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑。一方面，IR會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA受損，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，激活腫瘤免疫監(jiān)視；另一方面，IR可誘導(dǎo)周圍正常細(xì)胞衰老，導(dǎo)致正常組織纖維化和器官功能障礙〔11〕。同時(shí)IR刺激免疫系統(tǒng)迅速消除這些衰老細(xì)胞。如果衰老細(xì)胞產(chǎn)量超過免疫系統(tǒng)清除能力或免疫系統(tǒng)受損而無法有效清除這些衰老細(xì)胞，則衰老細(xì)胞會(huì)積累。Palacio等〔12〕發(fā)現(xiàn)將小鼠暴露于IR后脾臟T細(xì)胞的增殖反應(yīng)降低，脾細(xì)胞種群中SASP和p16的表達(dá)增加。通過消除p16陽性細(xì)胞的小鼠發(fā)現(xiàn)受損的T細(xì)胞增殖會(huì)部分逆轉(zhuǎn)。此外，從受輻射的脾臟中分離出的巨噬細(xì)胞在體外吞噬活性也降低，該活性也通過消除p16表達(dá)而得以恢復(fù)。這表明IR所導(dǎo)致的衰老細(xì)胞被清除后，免疫細(xì)胞功能可得到一定的恢復(fù)。

2.5其他因素參與的細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制

2.5.1DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)參與的細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制 DNA-PK是PI3K相關(guān)酶家族的成員，由DNA-PK催化亞基(DNA-PKcs)和Ku80、Ku70亞基組成的Ku異二聚體，是DNA損傷反應(yīng)的主要調(diào)控因子，在DNA雙鏈斷裂修復(fù)和有絲分裂中起作用〔13〕。最近的證據(jù)表明，DNA-PK活性隨年齡增長而增加，從而促進(jìn)線粒體丟失和體重增加〔14〕。 Liu等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)從正常衰老個(gè)體分離的成纖維細(xì)胞DNA中DNA-PKcs、Ku70、Ku80的表達(dá)水平均降低，且抑制DNA-PKcs的表達(dá)可使原代血管平滑肌細(xì)胞的增殖降低，研究結(jié)果顯示DNA-PK表達(dá)降低可導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降。Habiel等〔16〕用DNA-PKCs抑制劑Nu7441處理肺成纖維細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，與未處理的細(xì)胞相比，經(jīng)Nu7441處理的肺成纖維細(xì)胞在形態(tài)上變得扁平，體積變大。同時(shí)對(duì)經(jīng)Nu7441處理的肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行RNA分析，發(fā)現(xiàn)與衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本也增加。因此作者推測(cè)DNA-PKCs也參與了肺成纖維細(xì)胞的衰老。DNA-PK參與細(xì)胞衰老發(fā)生的可能原因有二。其一，DNA-PK可維持端粒的功能，Ku亞單位可與端粒結(jié)合，缺乏Ku70、Ku80或DNA-PKcs的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)具有更高數(shù)量的端粒融合〔17〕。其二，端粒長度的調(diào)控是由端粒和端粒酶共同控制。人類細(xì)胞系HCT116中DNA-PK的失活縮短了端粒，表明DNA-PK在端粒長度維持中也起一定作用〔18〕。為了確定DNA-PKCs在端粒長度控制中的作用是否依賴于端粒酶，Espejel等〔19〕將DNA-PKCs和端粒酶雙重缺陷的小鼠與單純端粒酶缺陷的小鼠相比，發(fā)現(xiàn)DNA-PKCs和端粒酶雙重缺陷的小鼠端?？s短的速度更快、程度更重，研究結(jié)果表明DNA-PKCs在端粒長度的調(diào)控中是依賴于端粒酶的。

2.5.2IL參與的細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制 IL-18屬于IL-1 基因家族，是一種促炎性細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫中起作用〔20〕。用IL-18處理肺成纖維細(xì)胞72 h后發(fā)現(xiàn)表達(dá)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)陽性細(xì)胞顯著增加，且進(jìn)入G1期細(xì)胞比例大幅上升，同時(shí)在成纖維細(xì)胞中P21、P53和P27的表達(dá)也急劇增加。P27蛋白介導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯、減緩或阻止細(xì)胞分裂。這些結(jié)果表明IL-18觸發(fā)肺成纖維細(xì)胞的衰老。Klotho是一種新型的抗衰老基因，編碼具有多個(gè)多效作用的單程跨膜蛋白；降低Klotho的蛋白水平或活性可導(dǎo)致年齡性相關(guān)疾病的發(fā)生甚至降低壽命〔21〕。Zhang等〔22〕發(fā)現(xiàn)IL-18處理肺成纖維細(xì)胞72 h后，細(xì)胞中Klotho的表達(dá)降低；上調(diào)Klotho表達(dá)水平可減弱IL-18誘導(dǎo)的上述細(xì)胞衰老效應(yīng)，抑制SASP產(chǎn)生。綜上，這些研究提示IL-18可能通過下調(diào)Klotho表達(dá)促進(jìn)成纖維細(xì)胞衰老。

2.5.3纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1參與的細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制 PAI-1是組織型和尿激酶型纖溶酶原激活物的主要抑制劑，可將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶促進(jìn)纖維蛋白溶解〔23〕。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)〔24，25〕，衰老細(xì)胞中PAI-1的表達(dá)增加。證據(jù)表明〔26〕PAI-1不僅是細(xì)胞衰老的標(biāo)志物，更是細(xì)胞衰老的媒介。當(dāng)細(xì)胞處于非分裂狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)抑癌基因處于非磷酸化的狀態(tài)，非磷酸化的Rb和轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，從而綁定E2F、抑制E2F轉(zhuǎn)錄活性使細(xì)胞周期發(fā)生停滯。PAI-1可以誘導(dǎo)P53的活性，激活后的P53可入核誘導(dǎo)P21表達(dá)，其調(diào)控下游細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子(CDKN1A)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白(cyclin)是細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用的兩類蛋白，CDK/cyclin 復(fù)合物促使非磷酸化Rb和E2F分離調(diào)控細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期。CDKN1A的表達(dá)抑制了 CDK/cyclin 復(fù)合物活性，使得磷酸化Rb蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榉橇姿峄疪b蛋白從而綁定E2F(P53-P21-PRb細(xì)胞周期途徑)，細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，啟動(dòng)細(xì)胞衰老進(jìn)程。

2.5.4microRNA(miRNA)參與的細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制 miRNA是非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在多種病理中起著重要的作用。研究報(bào)道m(xù)iRNA介導(dǎo)細(xì)胞衰老過程〔27〕。P53可誘導(dǎo)miR-34家族miRNA的表達(dá)，其已被確定為P53調(diào)控細(xì)胞周期的下游介質(zhì)，上調(diào)miR-34可導(dǎo)致參與細(xì)胞周期的關(guān)鍵靶基因包括E2F1、c-Myc和周期蛋白(CCN)E2的表達(dá)下調(diào)。miR-34表達(dá)上調(diào)直接抑制c-Myc及其下游P16基因的表達(dá)，P16下游CDK/cyclin 復(fù)合物活性降低阻止非磷酸化Rb和E2F分離，細(xì)胞周期進(jìn)入阻滯；miR-34上調(diào)可直接抑制E2F基因表達(dá)，阻止細(xì)胞增殖。miRNA通過參與P16-PRb細(xì)胞周期增殖途徑，抑制周期中各種靶基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老〔28〕。

DNA質(zhì)量控制和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制對(duì)維持動(dòng)物生理的年輕化至關(guān)重要。因此，DNA質(zhì)量控制和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機(jī)制被認(rèn)為是細(xì)胞衰老和衰老的關(guān)鍵靶點(diǎn)。然而，這兩種質(zhì)量控制機(jī)制的性能都受到線粒體和胞質(zhì)中產(chǎn)生的ROS影響〔29〕。已知miRNAs可導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，據(jù)報(bào)道〔30〕miR-24通過直接靶向DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOP)Ⅰ來加劇ROS的產(chǎn)生，破壞DNA質(zhì)量控制和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的發(fā)生。Yu等〔31〕發(fā)現(xiàn)miR-141在復(fù)制型和組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACI)誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老中的過度表達(dá)，ZMPSTE24人源重組蛋白(Q01)是其直接靶標(biāo)，它參與了層黏連蛋白A的翻譯后成熟，并導(dǎo)致與細(xì)胞衰老相關(guān)的重組核纖層蛋白前體A的積累，促使細(xì)胞進(jìn)入衰老停滯階段。

2.5.5Wnt信號(hào)通路參與的細(xì)胞衰老發(fā)生機(jī)制 Wnt信號(hào)通路控制細(xì)胞的遷移、增殖、分化等過程，配體是分泌糖蛋白，可通過作用于各種跨膜受體來激活β-catenin依賴性經(jīng)典或非經(jīng)典WNT途徑〔32〕。缺乏Wnt2/2B或β-catenin的小鼠無法形成肺這一事實(shí)說明了Wnt信號(hào)對(duì)于肺發(fā)育的重要性。迄今為止，有關(guān)Wnt信號(hào)和肺衰老的報(bào)道很少。但Lehmann等〔33〕探索了衰老小鼠肺中Wnt相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的Wnt信號(hào)隨著年齡的增長而減少，而在老年肺中非經(jīng)典Wnt5A的表達(dá)增加，并且在老化的造血干細(xì)胞(HSC)中Wnt5A的表達(dá)也增加。此外，與3個(gè)月大的小鼠相比，在12個(gè)月大的小鼠肺中Wnt2和β-catenin基因表達(dá)被下調(diào)。因此，科學(xué)家認(rèn)為肺衰老一定程度上是由Wnt信號(hào)通路的異常活動(dòng)所驅(qū)動(dòng)，這個(gè)過程也被叫做拮抗多效性或發(fā)育漂移。有研究顯示，秀麗隱桿線蟲中不同Wnt配體的敲除或突變可影響蠕蟲壽命，表明Wnt微環(huán)境的變化也可直接影響衰老〔33〕。

2.5.6TGF-β TGF-β是一種多效性細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程〔34〕。證據(jù)表明〔35〕，TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)與衰老相關(guān)疾病之間存在多方面的關(guān)聯(lián)。TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損或表達(dá)上調(diào)均可導(dǎo)致細(xì)胞變性、組織纖維化、再生能力降低、代謝功能異常。TGF-β與細(xì)胞表面的配體結(jié)合后通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶激活誘導(dǎo)Smad2和Smad3蛋白磷酸化，形成特異性R-Smads，激活的R-Smads與共同伙伴Smad4形成復(fù)合體，該復(fù)合物易位至細(xì)胞核并通過以下幾種方式參與細(xì)胞衰老的過程：①TGF-β上調(diào)P15、P21、P27等蛋白的表達(dá)及抑制增殖基因c-Myc的轉(zhuǎn)錄使得細(xì)胞進(jìn)入衰老周期；②TGF-β誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體產(chǎn)生ROS，觸發(fā)經(jīng)典的DDR反應(yīng)，細(xì)胞進(jìn)入衰老停滯狀態(tài)；③TGF-β下調(diào)細(xì)胞中TERT的表達(dá)來抑制端粒酶活性，引起端?？s短，細(xì)胞隨即進(jìn)入衰老周期；④TGF-β使PAI-1的活性、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的表達(dá)均增加，且PAI-1和ECM均可使SASP表達(dá)增加，SASP以自分泌或旁分泌方式誘導(dǎo)和維持細(xì)胞衰老表型。

綜上，細(xì)胞衰老無時(shí)無刻不在機(jī)體發(fā)生，其既有積極一面，也有消極一面。復(fù)制性衰老可保護(hù)機(jī)體的新陳代謝，阻止受損及衰老細(xì)胞的繼續(xù)增殖。過早性衰老參與機(jī)體許多病理過程，與衰老相關(guān)疾病的發(fā)生密不可分，比如癌癥和纖維化。本文總結(jié)了參與細(xì)胞衰老發(fā)生的不同機(jī)制，為細(xì)胞衰老的發(fā)生過程及抗衰老靶向藥物的研究提供了依據(jù)。