摘要 為優(yōu)化探索斑馬魚幼魚石蠟組織切片制作方法，以發(fā)育4 d的斑馬魚幼魚為試驗(yàn)材料，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行瓊脂預(yù)包埋、脫水、透明、浸蠟再包埋切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，比較瓊脂-石蠟雙包埋法與普通石蠟包埋法之間的優(yōu)勢(shì)。結(jié)果表明，瓊脂石蠟雙包埋法能保持斑馬魚幼魚的形態(tài)結(jié)構(gòu)，組織無(wú)變形、碎裂，鏡下結(jié)果明顯比普通石蠟包埋法清楚；HE染色效果好。瓊脂石蠟雙包埋法可以克服普通石蠟包埋法的不足，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，易于普及推廣。

關(guān)鍵詞 斑馬魚；瓊脂；石蠟；雙包埋法；石蠟切片

中圖分類號(hào) R-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）21-0080-05

Agar-paraffin double embedding method in the preparation of

juvenile zebrafish slices

ZHANG Ying1，2" " XIA Ming1，2，3" " HUANG Chunhua1，2，3" " LOU Didong1，2，3*

（1Department of Forensic Medicine， Guizhou University of Chinese Medicine， Guiyang 550000， China;

2Guizhou Provincial Key Laboratory of Forensic Medicine Toxicology， Guiyang 550000， China;

3Judicial Appraisal Center， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550000， China）

Abstract To explore and optimize the preparation method of paraffin tissue section of juvenile zebrafish. 4 d zebrafish juvenile were fixed with 4% paraformaldehyde for 24 h and then pre-embedded with agar，dehydrated， transparent， impregnated with wax and then embedded with the slices for hematoxylin-eosin （HE） staining. The advantages of the agar paraffin double embedding method and the conventional paraffin embedding method were compared. The results showed that the agar-paraffin double embedding method can maintain the morphology and structure of zebrafish juvenile without deformation or fragmentation， and the results under the microscope are obviously clearer than those of ordinary paraffin embedding method. HE staining is good. The agar-paraffin double embedding method can overcome the shortcomings of the conventional paraffin embedding method， and the equipment and operation is simple， easy to be popularized.

Keywords zebrafish; agar; paraffin; double embedding method; paraffin section

斑馬魚是一類典型的脊椎模式生物，因其性成熟期短、繁殖能力強(qiáng)、胚胎透明便于活體觀察以及與人類基因具有高度同源性等優(yōu)勢(shì)[1-3]，近年來(lái)受到廣大研究者的重視。斑馬魚幼魚較成魚在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科中的應(yīng)用更廣泛[4-5]，在對(duì)斑馬魚幼魚進(jìn)行研究的過(guò)程中，高質(zhì)量的組織病理學(xué)切片制作是必不可少的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。目前，有關(guān)斑馬魚幼魚病理切片制作的文獻(xiàn)較少，在斑馬魚研究經(jīng)典技術(shù)用書The Zebrafish Book中[6]，主要描述了胚胎和幼魚的組織學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)病理切片實(shí)驗(yàn)方法并未進(jìn)行詳細(xì)闡述。目前研究者在進(jìn)行斑馬魚幼魚石蠟切片時(shí)多采用普通石蠟切片制備方法[7]。而斑馬魚幼魚體積非常小，難以定位包埋，常規(guī)石蠟切片要經(jīng)歷脫水、透明和浸蠟過(guò)程，經(jīng)高濃度乙醇處理后組織易皺縮變形，二甲苯具腐蝕性，幼魚放入二甲苯10 min左右便會(huì)被腐蝕溶解，造成組織碎裂，由于存在以上問(wèn)題，采用普通石蠟包埋法制作斑馬魚幼魚切片過(guò)程較困難，切片質(zhì)量不高。為提高斑馬魚幼魚切片質(zhì)量，本研究借鑒電鏡超薄切片常用的制作方法，對(duì)不同瓊脂濃度以及脫水、透明和浸蠟具體時(shí)間進(jìn)行比較和觀察，以期獲得高質(zhì)量的斑馬魚幼魚切片，為后續(xù)斑馬魚幼魚的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用斑馬魚成魚為野生型AB品系，購(gòu)自中國(guó)國(guó)家斑馬魚資源中心，24周齡，雌雄各5尾，按照Westerfield的方法[6]飼養(yǎng)、繁殖和收集受精卵。受精卵放入胚胎培養(yǎng)液中，于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。試驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)，嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》（GB/T 3592—2018）要求執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器

瓊脂糖（實(shí)驗(yàn)級(jí)，西班牙Biwose），Tricaine（實(shí)驗(yàn)級(jí)，德國(guó)sigma），多聚甲醛（實(shí)驗(yàn)級(jí)，北京蘭杰柯），乙醇（分析純，重慶川東化工），二甲苯（分析純，重慶川東化工），HE染色試劑盒（實(shí)驗(yàn)級(jí)，北京索萊寶）。切片機(jī)（型號(hào)ARTOS 3D，德國(guó)徠卡），正置光學(xué)顯微鏡（型號(hào)CX33，日本奧林巴斯）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 固定、預(yù)包埋" 用0.2%的Tricainee（ethylm-aminobenzoate，1 mol/L Tris-HCl，pH值9.0）對(duì)發(fā)育4 d的幼魚進(jìn)行麻醉；隨后用4%多聚甲醛固定24 h；固定完成后將樣本放入裝有蒸餾水的離心管中，清洗3次，每次15 min。

瓊脂預(yù)包埋以6孔細(xì)胞培養(yǎng)板為模具，提前將斑馬魚幼魚放入模具中，吸干多余水分，將瓊脂粉預(yù)先配成1%、2%、4%、6%和8%的瓊脂粉懸濁液，放入微波爐中加熱至50 ℃以上使瓊脂融化成液體狀態(tài)，用移液槍將瓊脂加入到放好樣本的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，凝固之前用眼科撥針將斑馬魚幼魚擺放至所需要的位置，將凝固好含有斑馬魚幼魚的瓊脂切成大小約6 mm×3 mm×5 mm的塊狀模型，如圖1—2所示。

1.3.2 脫水、透明、浸蠟、再包埋和切片" 將整個(gè)瓊脂塊作為一個(gè)透明組織按常規(guī)組織的脫水包埋程序做石蠟包埋；單純石蠟包埋法的脫水包埋程序借鑒何嘉玲等[8]的方法進(jìn)行石蠟包埋操作。待蠟塊徹底冷卻后，置于-20 ℃的冰箱冷凍1 h，然后修塊，制備成5 μm切片。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1-4。

1.3.3 HE染色" 切片放入60 ℃烘箱2 h后浸入二甲苯脫蠟：二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各2 min；隨后用梯度乙醇水化：無(wú)水乙醇2 min，95%乙醇1 min，80%乙醇1 min，75%乙醇1 min，蒸餾水2 min。蘇木精-伊紅（HE）染色：蘇木素3 min，自來(lái)水沖洗；分化液5 s，自來(lái)水反藍(lán)15 min；伊紅1 min，自來(lái)水沖洗；再次脫水透明，95%乙醇Ⅰ 1 min，95%乙醇Ⅱ 2 min，無(wú)水乙醇I和無(wú)水乙醇Ⅱ各2 min，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各1 min，最后中性樹膠封片，制成永久切片。顯微鏡下觀察并采集圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同瓊脂濃度、脫水、透明和蠟化時(shí)間對(duì)試驗(yàn)過(guò)程及切片效果的影響

不同瓊脂濃度黏稠度和凝固時(shí)間有區(qū)別，會(huì)影響預(yù)包埋時(shí)調(diào)整位置的難易程度。脫水效果不同，會(huì)影響瓊脂和石蠟融合情況以及切片難易程度。不同瓊脂濃度對(duì)試驗(yàn)過(guò)程及切片效果的影響比較詳見(jiàn)表5。

經(jīng)過(guò)比較，以能完全脫水、置換透明劑、浸蠟所需的最短時(shí)間作為最佳選擇，得出最優(yōu)的瓊脂濃度與脫水、透明、蠟化的具體時(shí)間，最佳試驗(yàn)流程見(jiàn)圖3。

2.2 瓊脂石蠟雙包埋法與單純石蠟包埋法制作切片效果比較

普通石蠟包埋法經(jīng)脫水、透明和浸蠟后的斑馬魚幼魚變形嚴(yán)重，體軸彎曲，制作出的切片發(fā)生了收縮和破碎，各部位結(jié)構(gòu)顯示不清，有變形甚至破裂現(xiàn)象。由于瓊脂塊在組織周圍能起保護(hù)作用，瓊脂石蠟雙包埋法的斑馬魚幼魚經(jīng)脫水、透明和浸蠟后組織形態(tài)完好，切片觀察結(jié)構(gòu)完整，無(wú)皺縮和變形，能清楚看到各個(gè)器官（圖4—5）。

3 結(jié)論與討論

瓊脂石蠟雙包埋法在制作電鏡標(biāo)本及一些精細(xì)組織的光鏡切片上有著很大的優(yōu)勢(shì)，其具有凝固性、支持性和穩(wěn)定性[9-12]。固態(tài)瓊脂含有網(wǎng)狀孔隙[13]，乙醇、二甲苯和石蠟均可透過(guò)瓊脂滲入組織，不受瓊脂影響，可將瓊脂作為一個(gè)整體進(jìn)行脫水、透明和浸蠟，在經(jīng)歷乙醇梯度脫水和二甲苯透明之后，瓊脂會(huì)收縮和硬化[14]，為保證脫水完全，瓊脂塊不易過(guò)大，以每個(gè)瓊脂塊體積約6 mm×3 mm×5 mm為宜，如圖2所示。

瓊脂石蠟雙包埋法使用的瓊脂濃度不易過(guò)低或過(guò)高[15]，以能順利調(diào)整至理想位置，包埋時(shí)能與石蠟完整融合，易于出片為宜。低濃度（1%和2%）的瓊脂不能完全脫水，瓊脂最終組織較軟，浸蠟效果不好，瓊脂塊和石蠟不能很好融合；高濃度瓊脂（8%）可能因瓊脂密度過(guò)高，瓊脂塊內(nèi)部網(wǎng)狀孔隙過(guò)窄，導(dǎo)致乙醇、二甲苯不易浸入其內(nèi)部，脫水效果不理想；6%的瓊脂較為黏稠，預(yù)包埋時(shí)容易很快凝固，不易掌握。經(jīng)濃度梯度對(duì)照試驗(yàn)表明，4%的瓊脂濃度用于預(yù)包埋較為合適。

制作石蠟切片時(shí)要經(jīng)歷脫水、透明和浸蠟，脫水是為了除去組織內(nèi)部水分[16]，透明則是將組織內(nèi)部的脫水劑（乙醇）替換為透明劑（二甲苯），浸蠟則是將組織內(nèi)的透明劑替換為石蠟，如果水分不能除盡，或未完全置換為透明劑，都會(huì)影響到后續(xù)透明浸蠟的效果，導(dǎo)致組織內(nèi)的透明劑不能完全被石蠟所替換，不能成功制片[17]。斑馬魚幼魚體積小，因此脫水、透明、蠟化所需時(shí)間均比較短，尤其在使用二甲苯透明時(shí)要嚴(yán)格控制時(shí)間，以防止二甲苯腐蝕斑馬魚幼魚組織造成損傷，本試驗(yàn)設(shè)置了不同時(shí)間梯度比較[18]，得出最佳處理時(shí)間（圖3）。

瓊脂石蠟雙包埋法包埋斑馬魚幼魚最大的優(yōu)勢(shì)[14]是在預(yù)包埋時(shí)可以調(diào)整固定斑馬魚至理想位置[19]。如在制作斑馬魚橫斷面的切片時(shí)，斑馬魚因體積太小幾乎無(wú)法直立以獲得橫斷面所需要的體位，而將瓊脂塊作為一個(gè)整體組織便很容易擺放至理想位置。另外，瓊脂在整個(gè)制片過(guò)程中也可以起到很好地支撐和保護(hù)作用，使斑馬魚幼魚組織最后不會(huì)因高濃度乙醇脫水出現(xiàn)變形，也不會(huì)因二甲苯長(zhǎng)時(shí)間透明造成幼魚組織破損和溶解，也避免了制片過(guò)程中鑷子夾取等造成的人為機(jī)械性損傷[15]。

瓊脂石蠟雙包埋法可廣泛用于微小和易碎裂組織[20-23]，其方法僅在單純石蠟包埋法的基礎(chǔ)上先使用瓊脂預(yù)包埋，操作簡(jiǎn)單便捷。本研究借鑒電鏡超薄切片常用的制作方法，對(duì)不同瓊脂濃度以及脫水、透明和浸蠟具體時(shí)間進(jìn)行比較優(yōu)化，有效解決了單純石蠟包埋法制作斑馬魚幼魚切片中的諸多問(wèn)題，獲得高質(zhì)量的斑馬魚幼魚切片，對(duì)斑馬魚幼魚顯微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)研究具有一定的實(shí)用價(jià)值。

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（責(zé)編：何 艷）