摘要 從加州鱸（Micropterus salmoides）頭腎組織中克隆獲得Caspase家族中Caspase-3基因的編碼區(qū)序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析工具分析Caspase-3基因的蛋白結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)其功能并檢測(cè)其在加州鱸各組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明，該基因cDNA全長(zhǎng)890 bp，ORF為852 bp，可編碼283個(gè)氨基酸，蛋白理論分子質(zhì)量為73.06 ku，理論等電點(diǎn)（PI）為5.09；Caspase-3基因含有一個(gè)保守信號(hào)肽序列，不存在跨膜區(qū)；多序列比對(duì)結(jié)果顯示加州鱸Caspase-3與紅笛鯛（Lutjanus peru）Caspase-3相似度最高，高達(dá)88.38%；系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)加州鱸Caspase-3與紅笛鯛聚為一支；Caspase-3基因在所取組織中均有表達(dá)，在腦組織中表達(dá)量最高，在鰓組織中表達(dá)量最低。

關(guān)鍵詞 加州鱸；Caspase-3；生物信息學(xué)；組織表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S917.4；S9-9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）21-0073-07

Cloning and expression analysis of Caspase-3 in Micropterus salmoides

LIANG Fu" " SONG Changjiang" " TANG Huaiqing" " QIU Jinzhu" " ZHAO Tianzhen

ZHENG Hansheng" " SONG Haixia*

（Zhongshan Institute for Quality and Safety Inspection of Agricultural Products， Zhongshan 528400， China）

Abstract The sequence of the coding region of Caspase-3 gene in Caspase family was obtained from the head and kidney tissue of Micropterus salmoides， and the protein structure and function of Caspase-3 gene was analyzed by bioinformatics analysis tools . The results showed that the cDNA of Caspase-3 was 890 bp， ORF was 852 bp， encoding 283 amino acids. The theoretical molecular mass was 73.06 ku， and the theoretical isoelectric point （PI） was 5.09. This gene contained a conserved signal peptide sequence without the transmembrane region. Multiple sequence alignment showed that the M. salmoides Caspase-3 met Lutjanus peru Caspase-3 up to 88.38%. Phylogenetic analysis found that M. salmoides Caspase-3 and L. peru cluster together. The Caspase-3 gene was expressed in the selected tissues， which was the highest in brain tissues and the lowest in gill tissues.

Keywords Micropterus salmoides; Caspase-3; bioinformatics; tissue expression analysis

加州鱸（Micropterus salmoides）又稱大口黑鱸，原產(chǎn)于美國(guó)，目前在我國(guó)沿海內(nèi)陸地區(qū)廣泛養(yǎng)殖，是近年來(lái)我國(guó)主要養(yǎng)殖品種之一[1]。伴隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度的增加以及養(yǎng)殖水體的惡化，加州鱸養(yǎng)殖病害頻繁暴發(fā)，致病病原種類繁多，大致可以歸為以下3類，分別是細(xì)菌類病原鰤?mèng)~諾卡氏菌（Nocardia seriolae）[2]、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）[3]、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）等，病毒類病原虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus）[4]、彈狀病毒（Rhabdoviridae）等，寄生蟲類病原纖毛蟲（Chlamydodontida）[5]等。

細(xì)胞凋亡是一種基本而復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，使生物體能夠在發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和疾病期間殺死和去除不需要的細(xì)胞[6-7]。在所有參與細(xì)胞凋亡激活和執(zhí)行的蛋白質(zhì)中，半胱氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，迄今在人類中已鑒定出14種[8-9]。根據(jù)Caspase蛋白結(jié)構(gòu)與功能可將其分為3類：Caspase-1、-4、-5和-13與炎癥反應(yīng)相關(guān)；Caspase-2、-8、-9和-10是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)子；Caspase-3、-6和-7為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中Caspase-3是凋亡壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的關(guān)鍵介質(zhì)[10]。細(xì)胞凋亡信號(hào)通路一般可分為內(nèi)源性和外源性兩大類，外源性細(xì)胞凋亡由細(xì)胞表面死亡受體蛋白介導(dǎo)，而內(nèi)源性細(xì)胞凋亡由源自細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)觸發(fā)，外源性和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑都會(huì)導(dǎo)致Caspase-3的活化。研究表明，Caspase-3還與人類腫瘤形成以及神經(jīng)性疾病有關(guān)，如亨廷頓病和阿爾茲海默病[11]，此外，它還具有非凋亡功能，如參與機(jī)體組織分化和再生等[12]。Fernando等[13]研究表明，Caspase-3不僅參與細(xì)胞凋亡，還參與神經(jīng)干細(xì)胞的分化。另有研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3參與蠅精子細(xì)胞的個(gè)體分化過(guò)程[14]。Caspase-3在不同物種上發(fā)揮的主要功能仍需探索，目前已在部分魚類中研究了Caspase-3，但Caspase-3在魚類免疫中的定位尚不明確。本研究克隆了加州鱸Caspase-3基因開放閱讀框（ORF），對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析其基因結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)其蛋白功能，并檢測(cè)該基因在各組織中的分布，研究結(jié)果將為后續(xù)深入研究加州鱸Caspase-3的免疫學(xué)功能提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

健康加州鱸采集于中山某養(yǎng)殖場(chǎng)，規(guī)格（200±10）g/尾。本試驗(yàn)所用常規(guī)試劑均購(gòu)買于深圳市科普生物有限公司；RNA提取、cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒和熒光定量相關(guān)試劑盒均由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成" 撈取暫養(yǎng)的健康加州鱸3尾，收集心臟、脾臟、頭腎、胸腺、腸道和肝臟等10個(gè)器官的組織各10～20 mg，迅速放入裝有Trizol（無(wú)RNA酶）的試管中，用DEPC水處理過(guò)的鋼珠打碎組織，然后置于-80 ℃保存。待樣品處理完畢后，取出冷凍保存的組織樣品，參照TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說(shuō)明書提取加州鱸總RNA，再參照北京全式金EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 Caspase-3基因全長(zhǎng)的克隆" 根據(jù)NCBI上已知加州鱸基因組信息，設(shè)計(jì)克隆Caspase-3基因ORF序列的引物Caspase-3-F和Caspase-3-R（表1），PCR產(chǎn)物由廣州生工生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 Caspase-3基因的生物信息學(xué)分析" 用生物信息學(xué)軟件對(duì)獲得的加州鱸Caspase-3序列進(jìn)行拼接，并進(jìn)行序列比對(duì)。然后利用生物信息學(xué)網(wǎng)站在線分析加州鱸Caspase-3的氨基酸理化性質(zhì)、涉及的通路、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位以及三維結(jié)構(gòu)。在NCBI上下載與加州鱸Caspase-3氨基酸相似的其他物種的Caspase-3序列，利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.4 Caspase-3基因的組織表達(dá)分析" 根據(jù)Caspase-3基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物qMs-Caspase-3-F和qMs-Caspase-3-R（表1），使用qTower 3.0熒光定量?jī)x進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，分析Caspase-3基因在健康加州鱸各組織中的特異性分布，qRT-PCR反應(yīng)條件：90 ℃，3 min；95 ℃，10 s；60 ℃，5 s；共40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因（表1），每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，試驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算，用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 加州鱸Caspase-3基因的克隆

以Caspase-3-F、Caspase-3-R作為引物，以加州鱸頭腎組織中提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行拼接，通過(guò)NCBI Blast分析鑒定該擴(kuò)增產(chǎn)物為加州鱸Caspase-3基因。該基因的ORF為852 bp，可編碼283個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 加州鱸Caspase-3基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)生物信息學(xué)在線分析結(jié)果，Caspase-3蛋白的理論分子量為73.06 ku，理論等電點(diǎn)（PI）為5.09；脂溶指數(shù)為27.98；不穩(wěn)定指數(shù)為40.23，總體平均親水性為0.790。經(jīng)過(guò)蛋白親疏水性分析后發(fā)現(xiàn)該蛋白為親水性蛋白（圖2）。經(jīng)信號(hào)肽在線預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白前21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列（圖3）。利用TMHMM Server 2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Caspase-3蛋白在細(xì)胞中各位置的分布概率：33.3%（細(xì)胞壁）、33.3%（細(xì)胞質(zhì)）、22.2%（細(xì)胞液）、11.1%（細(xì)胞核）。通過(guò)Cell-PLoc預(yù)測(cè)，Caspase-3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。通過(guò)SoftBerry-Psite預(yù)測(cè)該序列功能位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該序列酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，C末端定位信號(hào)序列微體5個(gè)，N-豆蔻?；稽c(diǎn)和CAAX box 各3個(gè)，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和細(xì)胞吸附序列各2個(gè)，N-糖基化位點(diǎn)、Caspase家族組氨酸活性位點(diǎn)和Caspase家族半胱氨酸活性位點(diǎn)各1個(gè)。

通過(guò)SOPMA預(yù)測(cè)加州鱸Caspase-3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)無(wú)規(guī)則卷曲由140個(gè)氨基酸組成，占49.47%；α-螺旋由80個(gè)氨基酸組成，占28.27%；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)由18個(gè)氨基酸組成，占6.36%；延伸鏈由45個(gè)氨基酸組成，占15.90%（圖4）。利用SWISS-MODLE在線構(gòu)建蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。

2.3 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化

不同脊椎動(dòng)物Caspase-3的氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果如圖6所示，加州鱸Caspase-3與其他物種的相似度為45.85%～88.38%，與紅笛鯛（Lutjanus peru）的相似度最高，為88.38%。其中存在高度保守序列HIS信號(hào)（HSCHASFVCVLLSHG）和CYS活性位點(diǎn)（KPKLFFIQACRG）。將NCBI上已知的其他物種的Caspase-3基因和加州鱸Caspase-3基因通過(guò)N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)加州鱸與紅笛鯛聚為一支，這與多序列比對(duì)結(jié)果相符（圖7）。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)Caspase-3基因在加州鱸組織中的相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)結(jié)果顯示，該基因在各個(gè)組織中均能表達(dá)，其中在腦組織中相對(duì)表達(dá)量最高，其次為肌肉和肝臟，在頭腎、鰓和眼等其他組織中相對(duì)表達(dá)量較低（圖8）。

3 結(jié)論與討論

本研究克隆了加州鱸Caspase-3基因ORF序列，全長(zhǎng)852 bp，編碼283個(gè)氨基酸。該蛋白包含一個(gè)信號(hào)肽序列，剪切位點(diǎn)位于第20—21個(gè)氨基酸，屬于分泌性蛋白；其不穩(wěn)定指數(shù)超過(guò)40，屬于不穩(wěn)定蛋白；Caspase-3蛋白氨基酸序列親水性殘基較疏水性殘基多，表現(xiàn)為親水性，進(jìn)一步說(shuō)明Caspase-3屬于不穩(wěn)定蛋白；Caspase-3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋組成，與蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示Caspase-3蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示Caspase-3不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，這進(jìn)一步證實(shí)了亞細(xì)胞定位結(jié)果，表明Caspase-3蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中合成。對(duì)加州鱸Caspase-3蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析有利于揭示其可能參與的生物過(guò)程，為后續(xù)研究Caspase-3在加州鱸中的其他功能奠定了基礎(chǔ)。

將加州鱸Caspase-3氨基酸序列上傳至NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示加州鱸Caspase-3基因與硬骨魚類序列非常相似，加州鱸與紅笛鯛的相似度最高，為88.38%。與斑馬魚、牛、雞和林蛙的相似度分別為74.19%、62.34%、62.01%和45.85%。盡管不同物種多序列比對(duì)的同源性有高有低，但其結(jié)構(gòu)上都具有高度保守序列，如HIS活性位點(diǎn)和CYS活性位點(diǎn)。NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，加州鱸與紅笛鯛聚為一支，表明它們可能來(lái)源于一個(gè)祖先，且與BLAST比對(duì)結(jié)果相符。綜合以上結(jié)果，表明加州鱸Caspase-3與其他物種的Caspase-3蛋白在結(jié)構(gòu)上具有一定相似性，由結(jié)構(gòu)延伸至功能，它們?cè)诠δ苌弦部赡芫哂邢嗨菩浴?/p>

Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，相應(yīng)的Caspase蛋白酶通過(guò)內(nèi)源性途徑和外源性途徑激活Caspase-3 [15]。近年來(lái)，Caspase-3已經(jīng)在多種魚類物種中被克隆和鑒定，包括斑馬魚（Danio rerio）[16]、大黃魚（Larimichthys crocea）[17]、攀鱸魚（Anabas testudineus）[18]、河豚（Fugu obscurus）[19]、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[20]、海鱸（Lateolabrax japonicus）[21]和牙鲆（Paralichthys olivaceus）[22]，此外有學(xué)者從舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）[23]中克隆了Caspase-3基因序列。加州鱸Caspase-3組織定量分布結(jié)果表明，該基因廣泛分布于各檢測(cè)組織中，這與以往的研究結(jié)果相符。其中Caspase-3在加州鱸腦中表達(dá)量最高，肌肉和肝臟的表達(dá)量次之，其他組織中的表達(dá)量較低，鰓的表達(dá)量最低。而在舌齒鱸[23]相關(guān)研究中，Caspase-3在脾臟、頭腎、肝臟和腸道中的表達(dá)量極低，而在胸腺和心臟中的表達(dá)量較高，與本試驗(yàn)結(jié)果存在差異，這可能是Caspase-3在健康加州鱸中處于未激活狀態(tài)，也可能是不同物種間的特異性導(dǎo)致的差異。目前，Caspase-3在魚類中研究較少，且多集中于其在魚類發(fā)育和凋亡過(guò)程中的作用，如Yabu等[24]研究表明Caspase-3在誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生以及在斑馬魚胚胎階段起著至關(guān)重要的作用。研究表明Caspase-3在不同魚類各組織中的表達(dá)量存在差異，后續(xù)試驗(yàn)還需探究Caspase-3在加州鱸病毒感染中的作用并加以驗(yàn)證。

本研究成功克隆了加州鱸Caspase-3基因，該基因cDNA全長(zhǎng)890 bp，ORF為852 bp，可編碼283個(gè)氨基酸。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因具有一個(gè)典型的信號(hào)肽序列，剪切位點(diǎn)位于第20—21號(hào)氨基酸之間，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，存在Caspase家族組氨酸活性位點(diǎn)和Caspase家族半胱氨酸活性位點(diǎn)各1個(gè)。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)Caspase-3基因在健康加州鱸組織中均有表達(dá)，在腦、肌肉、肝臟中表達(dá)水平較高，在鰓組織中的表達(dá)量最低。

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（責(zé)編：何 艷）