摘要 為探究烏鱧p65基因在機(jī)體中免疫應(yīng)答的作用，本研究克隆烏鱧p65基因（Cap65）的開放閱讀框（ORF），推導(dǎo)Cap65序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）分析其在各組織的分布及諾卡氏菌感染后的表達(dá)模式，探究p65基因在魚類免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制，為研究該基因在魚類免疫上的作用提供參考。

關(guān)鍵詞 烏鱧；p65；組織分布；免疫應(yīng)答

中圖分類號 S917.4；S9-9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）21-0067-06

魚類諾卡氏菌病是由諾卡氏菌引起，該致病菌廣泛分布于水中，主要感染魚類的脾臟、肝臟、體腎和頭腎，并在免疫器官表面形成白色結(jié)節(jié)[1]。20世紀(jì)60年代，學(xué)者從海水魚紅大麻哈魚中分離鑒定了星狀諾卡氏菌（Nocardia asteroides）[2]。迄今為止，在多種魚類中相繼分離到諾卡氏菌，諾卡氏菌主要分為3種不同類型，分別是星狀諾卡氏菌（N. asteroides）[3]、殺鮭諾卡氏菌（N. salmonicida）[4]和鰤魚諾卡氏菌（N. seriolae）[5]。其中鰤魚諾卡氏菌（N. seriolae）是一種革蘭氏陽性分支絲狀菌，為魚類諾卡氏菌病的主要病原?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，鰤魚諾卡氏菌是一種條件致病菌，只有適合條件下才會感染魚類[1]。該菌可以通過魚鰓或傷口感染魚體，其發(fā)病周期長，感染率和死亡率均較高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大經(jīng)濟(jì)損失[6]。

烏鱧（Channa argus），隸屬于鱧科鱧屬，又叫烏魚、俗稱黑魚，具有較高的藥用價值，同時其肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者熱愛[7]，在我國廣東、安徽和福建等地區(qū)廣泛養(yǎng)殖。烏鱧性格兇猛、喜集群、好斗，經(jīng)常出現(xiàn)皮膚潰爛的情況，易感染諾卡氏菌。研究發(fā)現(xiàn)，烏鱧感染諾卡氏菌后，前期出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、食欲下降、體表潰瘍等癥狀，后期在其鰓絲或內(nèi)臟組織中形成白色結(jié)節(jié)，易導(dǎo)致其大量死亡[1]。

p65基因又被稱為RelA，是構(gòu)成核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）家族成分之一，其與RelB、c-Rel、裂解蛋白NF-κB 1（p50）與NF-κB 2（p52）構(gòu)成NF-κB炎性信號通路，同時，p65能夠和p50形成異源二聚體在NF-κB信號通路中傳導(dǎo)信號，且廣泛存在于大多數(shù)細(xì)胞中[8]。研究發(fā)現(xiàn)，p65、RelB和c-Rel可通過位于N末端內(nèi)的Rel同源結(jié)構(gòu)域進(jìn)行表征，而且這些同源結(jié)構(gòu)域須與位于C末端內(nèi)的反式激活域相結(jié)合[9]。而NF-κB 1和NF-κB 2可由大型前體NF-κB前體蛋白（p105和p100）進(jìn)入p50和p52亞基，介導(dǎo)激活NF-κB信號通路[10]。研究發(fā)現(xiàn)，p65可以通過多種刺激激活NF-κB信號通路，刺激包括自由基氧化、紫外線輻射（UV）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素1-beta（IL-1β）、病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或細(xì)菌脂多糖（LPS）[11]。目前有關(guān)p65的研究主要集中在哺乳動物，在魚類中相關(guān)研究較少。本研究克隆烏鱧p65基因（Cap65）的開放閱讀框（ORF），推導(dǎo)Cap65序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用熒光定量PCR（qRT-PCR）分析其在各組織的分布及諾卡氏菌感染后的表達(dá)模式，進(jìn)一步探究p65基因在魚類免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

從廣東省中山市某養(yǎng)殖廠采集的健康烏鱧（200±10 g/尾）。諾卡氏菌為前期從患病烏鱧病灶部位分離純化、并于-80 ℃進(jìn)行低溫保藏的菌種。試驗(yàn)所用常規(guī)試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，DNA凝膠回收純化試劑盒和qPCR相關(guān)試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Cap65基因ORF擴(kuò)增" 參考宋長江等[12]的方法，按照全式基因RNA試劑盒說明書操作，提取烏鱧總RNA，隨后使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)NCBI上已知烏鱧基因組信息，設(shè)計克隆Cap65基因ORF序列的引物Cap65-F和Cap65-R，隨后將PCR產(chǎn)物連接到pMD18T載體上，轉(zhuǎn)入Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，送由廣州生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 Cap65基因序列分析" 用生物學(xué)軟件（Bioedit 7.0、DNAMANV6和DNAstar等）對Cap65測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，并將拼接結(jié)果進(jìn)行比對。參考宋長江等[12]的方法，利用生物信息學(xué)網(wǎng)站在線分析Cap65氨基酸理化性質(zhì)、涉及的通路、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位及三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建。在NCBI上下載與Cap65氨基酸相似其他物種p65序列，利用MEGA 5.0.3對這些氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.3 Cap65基因組織表達(dá)" 取3尾健康活力較好的烏鱧，無菌條件下解剖取其肝臟、脾臟、頭腎、腸道、皮膚以及血液等10個組織，放入RNAlater暫存，按照全式基因RNA試劑盒說明書方法提取烏鱧總RNA，并立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Cap65基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計熒光定量引物qCap65-F和qCap65-R（表1），使用qTower 3.0熒光定量儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，程序設(shè)置參考汪志文等[13]的方法。每個樣品重復(fù)檢測3次。qRT-PCR以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因（表1），用2–??Ct法來計算相對表達(dá)量，采用GraphPad Prism 9數(shù)據(jù)分析軟件分析數(shù)據(jù)之間的顯著性。

1.2.4 諾卡氏菌刺激后Cap65基因的組織表達(dá)" 隨機(jī)選取120尾健康烏鱧，平均分成2組，每組60尾。其中一組腹腔注射0.1 mL諾卡氏菌（1×105 CFU/mL，重懸于無菌PBS），另一組腹腔注射相同量無菌PBS。分別在注射后0、3、6、12、24、72、120和168 h各取試驗(yàn)組和對照組的烏鱧3尾，剖取腸道、脾臟、頭腎和體腎組織，放入2.0 mL無RNase酶離心管中，將組織完全浸泡于TransZol Up，在-80 ℃下保存。根據(jù)上述1.2.1方法提取RNA和合成cDNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏鱧p65基因的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫已公布的烏鱧p65基因ORF設(shè)計引物，以烏鱧肝臟組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得產(chǎn)物與pMD-18T進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，最終將陽性克隆送公司測序，分析判斷該擴(kuò)增產(chǎn)物為烏鱧p65基因，ORF為1 884 bp，可編碼627個氨基酸。

2.2 烏鱧p65基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 p65氨基酸序列理化性質(zhì)" ProtParam在線分析結(jié)果表明，烏鱧p65蛋白理論分子量為69.43 ku，理論等電點(diǎn)為5.86。同時，其氨基酸序列中含量最低的氨基酸為色氨酸（Trp，0.8%）；含量最高的氨基酸為絲氨酸（Ser，10.5%）。其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）有69個，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）有57個；不穩(wěn)定系數(shù)為45.60，較為穩(wěn)定。最后，通過ProtScale分析（圖1）該蛋白親疏水性，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與ProtParam分析結(jié)果一致，烏鱧p65蛋白為親水性蛋白。

通過Signal IP 4.1 Server預(yù)測該序列的信號肽（圖2），結(jié)果顯示并沒有信號肽序列，為胞外蛋白。利用TMHMM Server 2.0預(yù)測顯示該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。經(jīng)由生物信息學(xué)在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該序列N-糖基化位點(diǎn)6個，糖胺聚糖附著位點(diǎn)1個，cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)2個，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)11個，酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)6個，N-豆蔻酰化位點(diǎn)6個，丙烯基結(jié)合位點(diǎn)（CAAX box）2個，C末端定位信號序列微體7個，NF-kappa-B/Rel/背側(cè)結(jié)構(gòu)域（F-R-Y-x-C-E-G）1個。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)該蛋白主要存在于線粒體中。

2.2.2 p65的高級結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測" 通過SOPMA分析烏鱧p65蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白二級結(jié)構(gòu)中由107個氨基酸組成延伸鏈（Extended strand），占17.07%；由110個氨基酸組成α螺旋（Alpha helix），占17.54%，β折疊占4.15%（圖3）。利用SWISS-MODLE在線構(gòu)建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)結(jié)果如圖4。

2.2.3 烏鱧p65同源性及進(jìn)化分析" 通過與NCBI上已發(fā)布的p65氨基酸進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)烏鱧p65與它們的相似度為50.91%～79.36%，其中與翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）相似度最高，高達(dá)79.36%。使用ClustalW與MEGA 5.3.2軟件將烏鱧p65與其他物種的p65根據(jù)N-J鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），發(fā)現(xiàn)S. chuatsi聚為一支，統(tǒng)歸于魚類。

隨后使用GENEDOC軟件將烏鱧與NCBI上已公布物種的p65氨基酸進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在烏鱧p65氨基酸序列中存在一個RHD（55-223 aa）結(jié)構(gòu)域和一個IPT結(jié)構(gòu)域（223-291 aa）。

2.3 烏鱧p65基因的組織分布

使用qTower 3.0熒光定量儀進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測健康烏鱧各組織p65基因的表達(dá)量，由圖6可知，烏鱧p65基因在所檢測10個組織中均有表達(dá)，在腦中表達(dá)量最高，肝臟、脾臟、血液以及頭腎等組織中表達(dá)量較少，在肌肉組織中表達(dá)量最少。

2.4 N. seriolae感染后烏鱧p65在不同組織中的表達(dá)模式

為分析細(xì)菌感染對烏鱧p65基因表達(dá)影響，本研究選取烏鱧血液、脾臟、頭腎和肝臟4個免疫器官的組織，并通過檢測烏鱧在感染N. seriolae后不同時間點(diǎn)（3、6、12、24、72、120和168 h）p65基因表達(dá)變化，分析該基因在烏鱧免疫應(yīng)答過程中的作用。由圖7可知，烏鱧在感染N. seriolae后，p65基因在血液、脾臟、頭腎和肝臟這4個組織中均有表達(dá)。隨著時間推移，在脾臟中p65基因呈現(xiàn)先上升后下降變化趨勢，具有時間依賴性。而在血液中，僅在感染N. seriolae 6 h后，烏鱧p65基因發(fā)生顯著性上調(diào)。在肝臟和頭腎中，烏鱧p65基因相對表達(dá)量在感染24 h時呈現(xiàn)顯著上調(diào)。

3 結(jié)論與討論

3.1 烏鱧p65基因的結(jié)構(gòu)特征

本研究克隆的烏鱧p65基因ORF為1 884 bp，可編碼627個氨基酸，包含有一個RHD（55-223 aa）結(jié)構(gòu)域和一個IPT結(jié)構(gòu)域（223-291 aa）。已在多種魚類中克隆并鑒定到p65基因，其中卵形鯧鲹（Trachinotus Ovatus）[14]p65的ORF為1 866 bp，編碼621個氨基酸；牙鲆（Paralichthys olivacaus）[15]p65的ORF為1 914 bp，編碼626個氨基酸；鱖魚（Siniperca chuatsi）[16]p65的ORF為1 914 bp，編碼637個氨基酸；鯉魚（Cyprinus carpio）[17]p65的ORF為1 662 bp，編碼553個氨基酸；草魚（Ctenopharyngodon idella）[17]p65的ORF為1 833 bp，編碼610個氨基酸。綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p65基因在淡海水魚類中所編碼氨基酸序列長度差異不大，進(jìn)化過程保守。隨后通過多序列比對以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，Cap65與其他魚類同源性較高，其中與鱖魚（Siniperca chuatsi）同源性最高，同其他魚類聚為一支。隨后對Cap65蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因上存在RHD和IPT這2個保守結(jié)構(gòu)域。以往研究表明，在野豬p65和草魚p65蛋白上還存在一個PDB結(jié)構(gòu)域和一個TAD結(jié)構(gòu)域，但是本研究中并未預(yù)測到，這表明PDB結(jié)構(gòu)域和TAD結(jié)構(gòu)域并不保守[14]。

3.2 烏鱧p65基因的組織表達(dá)模式

在健康烏鱧體內(nèi)p65基因在腦中表達(dá)量最高，其次是肝臟，脾臟，血液以及頭腎等免疫組織，在肌肉組織中表達(dá)量最少。已有研究表明，在草魚（Ctenopharyngodon idella）[17]、大黃魚（Larimichthys crocea）[18]、鯉魚（Cyprinus carpio）[16]、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[15]和卵形鯧鲹（Trachinotus Ovatus）[19]等魚類中，p65在免疫組織中表達(dá)量相對較高。與以往研究對比發(fā)現(xiàn)，p65基因在不同魚類不同組織中表達(dá)量不同，但是在免疫組織中相對表達(dá)量較高。這有可能是p65基因在非特異性免疫中具有一定功能，但是參與具體途徑及其作用機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步探索。

3.3 N. seriolae感染后烏鱧p65基因的組織表達(dá)變化

經(jīng)過N. seriolae感染后的烏鱧，在脾臟、肝臟和頭腎這3個免疫組織中，烏鱧p65基因相對表達(dá)量在感染12、24 h時呈現(xiàn)顯著上調(diào)，這與脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激后，卵形鯧鲹（Trachinotus Ovatus）、草魚（Ctenopharyngodon idella）和大黃魚（Larimichthys crocea）p65基因在脾臟、肝臟和頭腎組織中的表達(dá)模式相似。研究表明，LPS可以通過激活NF-κB通路，引起炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α和NO等的釋放，形成炎癥反應(yīng)[17，19]。N. seriolae作為致病菌，具LPS相同的功能，而p65是NF-κB家族重要組成部分，因此該基因在機(jī)體受到感染后，免疫組織中的p65基因表達(dá)顯著上調(diào)，說明p65可能參與機(jī)體先天免疫應(yīng)答。經(jīng)過N. seriolae感染6 h后，Cap65基因在血液中表達(dá)顯著上調(diào)，這主要是由于血液是機(jī)體運(yùn)輸養(yǎng)分的通道，通往各個組織，N. seriolae經(jīng)由血液感染機(jī)體多個組織。

4 結(jié)語

烏鱧p65基因ORF為1 884 bp，可編碼627個氨基酸，包含有一個RHD（55-223 aa）結(jié)構(gòu)域和一個IPT結(jié)構(gòu)域（223-291 aa），在進(jìn)化上相對保守，和其他脊椎動物具有相似的功能。N. seriolae感染后p65基因相對表達(dá)量均顯著上調(diào)，這表明p65基因參與烏鱧抗細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答過程。

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（責(zé)編：王 菁）