雷力榮，金夢瑩，郭大樂，鄧 赟

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137）

海洋中藥是傳統(tǒng)中藥組成的一部分，其藥性以寒、涼、平為主，藥味以咸、甘為主，常歸為肝經(jīng)，以沉降為主。海洋中藥多具有清熱解毒、消腫止痛、軟堅散結(jié)、化痰止咳的功效，還有補虛作用，包括滋陰補血、補氣助陽［1］。海洋共附生真菌與宿主共生互利，協(xié)同進(jìn)化，對于維護(hù)宿主正常的生理功能有重要的作用。同時海洋資源豐富，特殊環(huán)境擁有特別的價值，能從中發(fā)現(xiàn)活性化合物。尖海龍是海龍的基原之一，具有溫腎壯陽、散結(jié)消腫的功效，用于腎陽不足、陽痿遺精、癓瘕積聚、瘰疬痰核、跌補損傷［2］。Talaromycesamestolkiae屬于真菌門子囊菌亞門不整子囊綱散囊目發(fā)菌科籃狀菌屬，其次生代謝產(chǎn)物研究較少，主要含有雜萜、聚酮、香豆素、吡喃酮、苯并呋喃等化合物，具有抗炎、抗菌等活性［3-6］。課題組前期對尖海龍共附生真菌Talaromycesamestolkiae次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從中分離得到9 個化合物［7］。本研究繼續(xù)深入，得到10 個化合物，其中化合物1 為新的天然產(chǎn)物，化合物3～5、8～10 為首次從該菌中分離。

1 材料

Q Exactive UHMR 復(fù)合四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾公司）； Bruker Bruker-Ascend-700-MHz 核磁共振儀、Bruker Bruker-Ascend-600-MHz 核磁共振儀（德國Bruker 公司）； NP7000 半制備高效液相色譜儀、NU3000 紫外檢測器（江蘇漢邦科技股份有限公司）； SL302N 電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）； 100-A 自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）； DZF 真空干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）； DF-90多功能暗箱式紫外透射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）； ChromCore PFP 色譜柱（10 mm×250 mm，5 μm）［納譜分析技術(shù)（蘇州）有限公司］； Pack ODS-A 色譜柱 （250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司）； MCI （75～150 μm，日本三菱公司）；Sephadex LH-20 （美國GE 公司）； 柱層析硅膠（200～300 目）、薄層層析硅膠板（5 cm×10 cm）（青島海洋化工有限公司）。三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、甲醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）。葡萄糖（成都市科隆化學(xué)品有限公司）； 蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）； 酵母提取粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）； 磷酸二氫鈉（北京索萊寶科技有限公司）；瓊脂（上海盛思生化科技有限公司）。

尖海龍于2018 年9 月采集于海南省陵水黎族自治縣，由成都中醫(yī)藥大學(xué)王光志副教授鑒定為尖海龍SyngnathusacusLinnaeus。

2 方法

2.1 菌種的獲得 從尖海龍中分離得到一株內(nèi)生菌，菌落一開始呈黃色，1 周后慢慢變成灰綠色，在M1 培養(yǎng)基（葡萄糖10 g／L、蛋白胨2 g／L、酵母提取粉1 g／L、磷酸二氫鈉1 g／L、瓊脂15 ～20 g／L）培養(yǎng)1 周后，菌落直徑為1 ～2 cm，表面粗糙，邊界呈規(guī)則圓狀，中間凸起，背部中間為黃色，周圍為白色，無凸起［8］，見圖1。Talaromyces amestolkiae菌種由生工生物工程（上海）股份有限公司鑒定完成（GenBank 登錄號DQ513513，序列號MH856395.1），現(xiàn)保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生化制藥實驗室。

2.2 菌種的擴培 將獲得的菌種接種Talaromyces amestolkiae接種于M1 培養(yǎng)基中（250 mL 錐形瓶，每瓶100 mL 培養(yǎng)基），30 ℃下120 r／min 振蕩培養(yǎng)得到發(fā)酵液，吸取5 mL 至糙米固體培養(yǎng)基［9］（綠糙米50 g、純水50 mL、5%人造海水、蛋白胨2 g）中，共180 瓶，室溫下靜態(tài)發(fā)酵30 d。

3 提取與分離

將發(fā)酵瓶中的發(fā)酵物用筷子攪拌疏松，加入甲醇沒過發(fā)酵物，浸泡1 d，取出發(fā)酵物置于燒杯中，超聲處理20 min，倒入帶有開關(guān)閥門的鐵桶中，蓋上蓋子，浸泡2 d，收集濾液，取出發(fā)酵物放于燒杯中，加入甲醇，重復(fù)上述操作。將2 次收集的濾液合并濃縮至流浸膏狀態(tài)，加水活化，再加入等量乙酸乙酯，萃取3 次，得到浸膏65 g。浸膏（65 g）經(jīng)硅膠柱，以石油醚-丙酮（100 ∶0 ～1 ∶9）梯度洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.1 ～Fr.27。Fr.12 經(jīng)Sephdex LH-20 凝膠柱，以三氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.12-1 ～Fr.12-4。Fr.12-1 經(jīng)制備HPLC 純化，以90%甲醇洗脫，得到化合物1 （tR＝12.5 min，3.42 mg）。Fr.12-2 經(jīng)制備HPLC 純化，以60%甲醇洗脫，得到化合物2（tR＝14.5 min，13.6 mg）。Fr.20 經(jīng)Sephdex LH-20凝膠柱，以三氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.20-1 ～Fr.20-14。Fr.20-5 經(jīng)中壓C18柱，以甲醇-水（10 ∶90 ～90 ∶10）梯度洗脫，得到Fr.20-5-1～Fr.20-5-8。Fr.20-5-5 經(jīng)制備HPLC純化，以43%甲醇洗脫，得到化合物3 （tR＝39.0 min，10.72 mg）。Fr.20-6 經(jīng)中壓MCI 柱，以甲醇-水（20 ∶80～90 ∶10）梯度洗脫，得到Fr.20-6-1 ～Fr.20-6-14。Fr.20-6-2 經(jīng)制備HPLC 純化，以13%甲醇洗脫，得到化合物4 （tR＝39.0 min，9.84 mg）。Fr.20-6-5～Fr.20-6-10 合并，經(jīng)硅膠柱，得到Fr.20-6-5-1 ～Fr.20-6-5-22。Fr.20-6-5-7 經(jīng)制備HPLC 純化，以甲醇洗脫，得到化合物5 （tR＝15.9 min，1.8 mg）。Fr.21 經(jīng)Sephdex LH-20 凝膠柱，以三氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.21-1～Fr.21-19。Fr.21-5 經(jīng)制備HPLC純化，以45%甲醇洗脫，得到化合物6 （tR＝21.0 min，1 mg）。Fr.21-6 經(jīng)中壓C18柱，以甲醇-水（70 ∶30 ～90 ∶10）梯度洗脫，得到Fr.21-6-1 ～Fr.21-6-7。Fr.21-6-1 與 Fr.21-6-2 合并，經(jīng)Sephdex LH-20 凝膠柱，以甲醇洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.21-6-1-1～Fr.21-6-1-9。Fr.21-6-1-3 經(jīng)制備HPLC 純化，以45%甲醇洗脫，得到化合物7（tR＝20.0 min，11.11 mg）。Fr.21-6-1-7 經(jīng)制備HPLC 純化，以50% 甲醇洗脫，得到化合物8（tR＝17.0 min，1.18 mg）、9 （tR＝26.0 min，1.11 mg）。Fr.23 經(jīng)Sephdex LH-20 凝膠柱，以三氯甲烷-甲醇 （1 ∶ 1）洗脫，TLC 檢識合并，得到Fr.23-1～Fr.23-19。Fr.23-10 經(jīng)制備HPLC 純化，以27%甲醇洗脫，得到化合物10 （tR＝27.0 min，8 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色固體。1H-NMR （700 MHz，CD3OD）δ：7.48 （1H，s，H-3），7.29 （1H，dd，J＝8.5，2.5 Hz，H-5），7.18 （1H，dd，J＝8.5，1.0 Hz，H-6），4.97 （1H，m，H-1′），4.85（1H，m，H-1′），4.57 （1H，m，H-2′），4.49（1H，m，H-2′），1.46 （9H，s，H-4′），1.33（9H，s，H-6′）；13C-NMR （175 MHz，CD3OD）δ：149.7 （ C-4），148.8 （ C-2），140.6 （ C-1），126.2 （C-6），125.8 （C-3），120.6 （C-5），71.7（C-2′），38.1 （C-1′），36.2 （C-3′），35.9 （C-5′），32.2 （C-4′），31.2 （C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報道基本一致，故鑒定為2，4-bis （1，1-dimethylethyl）benzeneethanol。

化合物2：棕色油狀物，ESI-MSm／z：249［M＋H］＋。1H-NMR （700 MHz，CD3OD）δ：7.46（1H，dd，J＝8.4，7.4 Hz，H-6），6.85 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），6.79 （1H，d，J＝7.4 Hz，H-5），4.62 （1H，m，H-3），2.91 ～3.05 （2H，m，H-4），2.60 （2H，t，J＝7.0 Hz，H-3′），2.17 （3H，s，H-5′），1.83 （2H，m，H-1′），1.75 （ 2H，m，H-2′）；13C-NMR （ 175 MHz，CD3OD）δ：211.2 （C-4′），171.3 （C-1），163.1（C-8），141.4 （C-10），137.3 （C-6），119.2 （C-5），116.6 （C-7），109.3 （C-9），81.0 （C-3），43.5 （C-3′），34.9 （C-4），33.5 （C-1′），29.7（C-5′），20.0 （C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報道基本一致，故鑒定為aspergillumarins A。

化合物3：無色油狀，HR-ESI-MSm／z：267［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：7.56（1H，dd，H-6），7.06 （1H，d，J＝7.4 Hz，H-5），6.92 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），4.62 （1H，d，J＝7.3 Hz，H-4），4.43 （1H，m，H-3），3.74（1H，m，H-4′），1.87 （2H，m，H-1′），1.68（2H，m，H-2′），1.47 （2H，m，H-3′），1.16（3H，d，J＝6.2 Hz，H-5′）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：170.2 （C-1），162.9 （C-8），144.2（C-4a），137.8 （C-6），117.9 （C-5），117.8 （C-7），108.0 （C-8a），85.2 （C-3），68.3 （C-4），68.1 （C-4′），39.8 （C-3′），32.8 （C-1′），23.5（C-5′），22.4 （C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報道基本一致，故鑒定為peniciisocoumarins H。

化合物 4：棕色粉末，ESI-MSm／z：233［M-H］-。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：6.61（1H，d，J＝2.2 Hz，H-8），6.59 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-6），6.02 （1H，s，H-3），4.18 （1H，m，H-2），2.67 （3H，s，-CH3），2.61 （2H，m，H-1），1.24 （3H，d，J＝6.2 Hz，-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：182.4 （C-4），167.5 （C-2），163.6 （C-7），161.9 （C-9），144.1 （C-5），118.5 （ C-3），116.2 （ C-10），112.9 （ C-6），102.1 （C-8），66.8 （C-2），44.6 （C-1），23.9（-CH3），23.6 （-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［12］報道基本一致，故鑒定為2- （2-hydroxypropyl）-5-methyl-7-hydroxychromone。

化合物 5：黃色固體，ESI-MSm／z：314［M＋H］＋。1H-NMR （700 MHz，CD3OD）δ：7.95（1H，s，H-2′），6.83 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-7），6.76 （1H，dq，J＝7.0，15.4 Hz，H-2″），6.74 （1H，d，J＝1.6 Hz，H-5），6.30 （1H，s，H-3），6.26 （1H，dq，J＝1.4，15.4 Hz，H-1″），6.20 （1H，s，H-5″），3.81 （3H，s，H-8），1.94（3H，dd，J＝7.0，1.4 Hz，H-3″）；13C-NMR （175 MHz，CD3OD）δ：180.3 （C-4′），172.8 （C-1），165.2 （ C-6′），162.9 （ C-6），157.6 （ C-2′），157.0 （ C-4），138.6 （ C-2″），130.7 （ C-7a），127.3 （C-3a），124.6 （C-3′），124.3 （ C-1″），113.6 （ C-5′），106.2 （ C-5），103.4 （ C-7），76.4 （C-3），56.7 （C-8），19.0 （C-3″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［13］報道基本一致，故鑒定為6-demethylvermistatin。

化合物6：無色油狀物，ESI-MSm／z：265［M＋H］＋。1H-NMR （700 MHz，CD3OD）δ：7.54（1H，dd，J＝8.5，7.5 Hz，H-6），7.06 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-7），6.91 （1H，d，J＝7.7 Hz，H-5），4.44 （ 1H，m，H-3 ），3.90 （ 3H，s，-OCH3），3.75 （1H，m，H-4′），2.98 （1H，dd，J＝16.8，3.5 Hz，H-4），2.91 （1H，dd，J＝16.1，11.9 Hz，H-4），1.83 （1H，m，H-1′），1.72 （1H，m，H-1′），1.59 （2H，m，H-2′），1.49 （2H，m，H-3′），1.17 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-5′）；13C-NMR （175 MHz，CD3OD）δ：165.2（C-1），162.2 （C-8），143.6 （C-4a），136.1 （C-6），120.4 （C-5），114.0 （C-8a），111.9 （C-7），79.5 （C-3），68.1 （C-4′），56.2 （-OCH3），39.6（C-3′），35.5 （C-1′），34.7 （C-4），23.3 （C-5′），22.1 （C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報道基本一致，故鑒定為penicimarin B。

化合物 7：棕色油狀，ESI-MSm／z：281［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ：7.13（1H，d，J＝8.2 Hz，H-6），6.87 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），4.42 （1H，m，H-3），3.96 （3H，s，-OCH3），3.82 （1H，m，H-4′），2.86 （1H，dd，J＝15.9，11.2 Hz，H-4），2.81 （1H，dd，J＝16.0，3.2 Hz，H-4），1.86 （1H，m，H-1′），1.70 （1H，m，H-1′），1.60 （2H，m，H-2′），1.50 （2H，m，H-3′），1.20 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-5′）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ：162.8 （C-1），149.0 （C-7），148.6 （C-8），132.2 （C-4a），123.1 （ C-5），120.5 （ C-6），117.5 （ C-8a），78.8 （C-3），68.0 （C-4′），62.5 （-OCH3），39.0（C-3′），34.8 （C-1′），33.7 （C-4），23.7 （C-5′），21.4 （C-2′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報道基本一致，故鑒定為penicimarin C。

化合物 8：無色油狀，ESI-MSm／z：207［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：6.42（1H，d，J＝2.2 Hz，H-7），6.28 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-5），6.20 （1H，s，H-4），3.86 （3H，s，6-OCH3），2.17 （3H，d，J＝0.9 Hz，3-CH3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：167.6 （C-1），165.5 （ C-6），162.8 （ C-8），156.5 （ C-3），144.4 （C-4a），105.4 （C-4），104.4 （C-8a），101.9 （C-5），100.2 （C-7），56.7 （6-OCH3），19.6 （C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報道基本一致，故 鑒 定 為8-hydroxy-6-methoxy-3-methylisocoumarin。

化合物9：白色固體，HR-ESI-MSm／z：221［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：6.48（1H，d，J＝2.4 Hz，H-5），6.46 （1H，d，J＝2.4 Hz，H-7），3.88 （3H，s，-OCH3），2.24（3H，s，H-9），2.06 （3H，s，H-10）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：166.6 （C-1），165.3 （C-6），162.1 （C-8），151.6 （C-3），144.6 （C-4），108.7 （C-4a），102.0 （C-8a），101.6 （C-5），99.2 （C-7），56.2 （-OCH3），17.1 （C-9），12.7（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］報道基本一致，故鑒定為polygonolide。

化合物10：棕色油狀，HR-ESI-MSm／z：234［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：8.16（1H，s，H-8），8.15 （1H，s，H-2），3.56 （2H，s，H-β），1.96 （3H，s，H-δ），1.82 （6H，s，H-β′）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：208.5（C-γ），157.6 （C-6），153.1 （C-2），151.4 （C-4），141.6 （C-8），121.4 （C-5），59.3 （C-α），51.8 （C-β），31.4 （C-δ），28.2 （C-β′）。以上數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)［17］報道基本一致，故鑒定為靈芝嘌呤。

4 討論

本研究對尖海龍共附生真菌Talaromyces amestolkiae固體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，共得到10個化合物。其中化合物1 為新的天然產(chǎn)物，化合物2～4、6～9 為香豆素類，區(qū)別在于取代基不同，化合物5 為聚酮類，化合物10 為含氮化合物。除化合物2、6～7 外，其余化合物均為首次從中分離得到。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，化合物2 表現(xiàn)出α-葡萄糖苷酶抑制作用，IC50值為38.1 μmol／L［6］?；衔?對HelicoverpaarmigeraHubner 初孵幼蟲有生長抑制作用［11］?；衔? 對PANC-1 細(xì)胞系具有一定的細(xì)胞毒性［18］。化合物6 ～7 對Candidaalbicans、Staphylococcusepidermidis、Bacillussubtilis、Escherichia coli有抑菌作用，MIC 值在50～100 μg／mL 之間［19］?；衔?8 對Bacillussubtilis、Agrobacterium tumefaciens、Xanthomonasvesicatoria有一定的抑制作用，MIC 值分別為25、75、25 μg／mL［20］?；衔? 有一定的抗炎作用［21］。本研究豐富了Talaromycesamestolkiae次生代謝產(chǎn)物的種類，為其產(chǎn)生的活性物質(zhì)研究提供參考，也為開發(fā)海洋中藥的次生代謝產(chǎn)物提供研究基礎(chǔ)。