石瑞雪，李艷和

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

0 引言

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)，俗稱淡水小龍蝦。原產(chǎn)于美國南部和墨西哥北部，20世紀(jì)30年代由日本傳至中國南京一代[1]，因?yàn)槠溥m應(yīng)性廣，繁殖力強(qiáng)，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，市場前景好，各地迅速掀起了人工養(yǎng)殖克氏原螯蝦的熱潮，養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展迅速。然而，由病原體侵襲和非病原體因素的影響而爆發(fā)的疾病問題仍然給廣大養(yǎng)殖者造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了小龍蝦產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。其中，病原體的侵襲主要包括細(xì)菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲性疾??；非病原體因素的影響主要包括水環(huán)境的改變和食物短缺造成克氏原螯蝦互相殘殺，以及藥物殘留、消毒不徹底等多種因素造成的克氏原螯蝦中毒現(xiàn)象[2]。目前研究較多的對克氏原螯蝦具有致病性的病原有氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[3-4]、豚鼠氣單胞菌(Ameromonas caviae)[5]和維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)[6]，檸檬酸桿菌屬的弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)[7]與布氏檸檬酸桿菌(Citrobacter braakii)[8-10]，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)[11]，異常嗜糖氣單胞菌(Aeromonas allosaccharophila)[12]和白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)[13-14]。這些致病性病原的研究對于克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。為了能夠?qū)ξr病進(jìn)行有效的預(yù)防和治療，對于克氏原螯蝦病原的進(jìn)一步鑒定尤為重要。

微小桿菌屬(Exiguobacterium spp.)是一種具有廣闊生境分布的革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在環(huán)境生物修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮作用[15]。據(jù)報(bào)道，Exiguobacterium aurantiacum可能與凡納濱對蝦肝胰腺壞死癥有關(guān)[16]，Exiguobacterium indicum是原料小龍蝦的優(yōu)勢腐敗菌[17]，Exiguobacterium profundum最早發(fā)現(xiàn)于深海熱液口，中度嗜熱，具有耐鹽性[18]。筆者從瀕死克氏原螯蝦肝胰臟中分離到一株優(yōu)勢菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定、16srRNA基因序列測定，鑒定該菌為Exiguobacterium profundum，進(jìn)行了回歸感染實(shí)驗(yàn)，并對其耐藥性進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

分離菌所用克氏原螯蝦來自湖北省洪湖市某養(yǎng)殖場；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；淀粉水解培養(yǎng)基、盧戈氏碘液、SIM培養(yǎng)基、氧化酶試紙、3%過氧化氫酶試劑、硝酸鹽肉湯、硝酸鹽還原試劑盒、蔗糖發(fā)酵管、甲基紅、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基、VP甲液、VP乙液和明膠生化管購自青島海博生物有限公司；NaCL和胰蛋白胨購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Premix TaqTM購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；DL 2000 DNA Marker購自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 細(xì)菌分離與純化

取克氏原螯蝦用生理鹽水反復(fù)沖洗體表3～5次后放在無菌培養(yǎng)皿中，于超凈臺中解剖取出肝胰腺，用接種環(huán)蘸取肝胰腺后于營養(yǎng)瓊脂平板劃線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h后觀察菌落形態(tài)，挑取單一形態(tài)菌落反復(fù)劃線，直至長出大小形態(tài)一致菌落。將分離純化得到的單一形態(tài)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中增殖備用，分離純化的細(xì)菌平板保存于4℃。將純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并鏡檢觀察。

1.3 生理生化鑒定

使用一次性接種針挑取單個(gè)菌落，涂于氧化酶試紙，30 s內(nèi)觀察顏色變化。按照說明書配置SIM培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基和磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基。將分離菌株接種于上述培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。滴加Kovacs氏靛基質(zhì)試劑于SIM培養(yǎng)基表面，靜置10 min觀察現(xiàn)象；滴加盧戈氏碘液于淀粉水解培養(yǎng)基中的菌落觀察顏色；滴加VP甲液2滴、VP乙液1滴于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)箱孵育2 h后觀察顏色；滴加甲基紅1滴于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基觀察顏色。將菌株接種于不同濃度NaCl胰胨水(0%、3%、6%、8%、10%、12%)、明膠生化管、硝酸鹽肉湯和蔗糖發(fā)酵管，按照說明書要求進(jìn)行培養(yǎng)并觀察。上述每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)平行。

1.4 16s rRNA基因序列分析

超凈臺中使用無菌接種環(huán)挑取LB固體培養(yǎng)基中單一菌落，置于加入150μL無菌雙蒸水的1.5 mL無菌離心管內(nèi)，并將其置于100℃中煮沸10～15 min，冷卻后放入離心機(jī)中，12000 r/min，離心10 min，取上清液為細(xì)菌DNA模板，保存于-20℃冰箱中。

使用16srRNA通用引物27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT3’進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為25μL，Premix TaqTM12.5μL，上下游引物各1μL，模板2μL，滅菌雙蒸水8.5μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送擎科生物有限公司測序。測序結(jié)果通過NCBI Blast進(jìn)行序列比對，并使用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將分離菌16s rRNA基因序列通過NCBI進(jìn)行Blast同源序列分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，在Genebank中獲取與分離菌為同一屬的菌種16srRNA基因序列，并獲取大腸桿菌16s rRNA基因序列作為外源菌，在MEGA 7中采用ClustaLW進(jìn)行多序列比對，并使用鄰接法(Neighbor joining method)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，并通過1000次的自舉分析(Bootstrap)以檢測置信度。

1.6 藥物敏感實(shí)驗(yàn)

使用涂布器將100μL 0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木壕鶆蛲坎加谄胀↙B固體培養(yǎng)基，使用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，每種藥敏紙片做3組平行。正面放置3 min后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.7 人工感染實(shí)驗(yàn)

將保存于LB液體培養(yǎng)基的菌液解凍后取部分菌液接種于LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化并繁殖。將菌液稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基，使用菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用0.65%無菌生理鹽水將菌液稀釋為5個(gè)梯度的菌懸液進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)：108、107、105、103、101。選取四肢健全、活力好的克氏原螯蝦，每組10尾，2個(gè)平行組，在第二腹節(jié)處肌肉注射100μL菌液，對照組注射100μL 0.65%無菌生理鹽水。感染后觀察7天，期間每天定時(shí)投喂1次，并及時(shí)換水吸污保持水質(zhì)，對瀕死的克氏原螯蝦進(jìn)行細(xì)菌的再分離及鑒定。

1.8 數(shù)據(jù)處理和分析

藥物敏感實(shí)驗(yàn)測得抑菌圈直徑及7天人工感染實(shí)驗(yàn)過程中克氏原螯蝦死亡數(shù)目采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及圖表繪制。測得抑菌圈直徑數(shù)值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，并參照杭州微生物試劑有限公司的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行敏感性判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌形態(tài)特征

從克氏原螯蝦肝胰臟中分離純化得到一株黃色隆起、邊緣不整齊的圓形形態(tài)菌株（圖1）。經(jīng)革蘭氏染色為陽性菌（圖2），命名為W菌株。

圖1 在LB培養(yǎng)基生長的分離菌W菌落形態(tài)

圖2 分離菌株W革蘭氏染色結(jié)果

2.2 生化鑒定結(jié)果

參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1，分離菌W生化特性與微小桿菌E.profundum一致，初步鑒定為E.profundum。

表1 分離菌株W的生理生化特性

2.3 細(xì)菌16s rRNA分子鑒定

通過PCR擴(kuò)增得到W菌株的16srRNA片段，經(jīng)凝膠電泳檢測其長度約為1400 bp長度片段（圖3）。將基因序列通過NCBI進(jìn)行同源序列比對分析，結(jié)果顯示E.profundum與該菌同源性大于99%。通過Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)該菌與E.profundum聚為一個(gè)分支（圖4），結(jié)合該菌的生理生化鑒定結(jié)果將其鑒定為E.profundum。

圖3 分離菌株16srRNA擴(kuò)增結(jié)果

圖4 W菌株基于16srRNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.4 藥敏特性

分離菌株W的藥敏特性詳見表2。菌株W對青霉素G、苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、紅霉素、麥迪霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙氟哌酸、萬古霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、痢特靈、氯霉素、克林霉素30種藥物均敏感。

表2 分離菌株W藥物敏感結(jié)果（杭州微生物試劑有限公司）

續(xù)表2

2.5 人工感染

經(jīng)過人工感染后的克氏原螯蝦出現(xiàn)部分死亡，其死亡情況如表3所示。分離菌株W感染克氏原螯蝦后其死亡率與感染濃度不呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，對照組也出現(xiàn)死亡情況。對瀕死蝦肝胰腺進(jìn)行細(xì)菌的分離純化，從感染蝦肝胰腺中均分離得到E.profundum，從對照組瀕死蝦和感染組瀕死蝦肝胰腺中均分離到弗氏檸檬酸桿菌，但對照組未分離到E.profundum。

表3 分離菌株W感染克氏原螯蝦后的死亡率

3 結(jié)論

本研究從瀕死克氏原螯蝦肝胰腺分離出優(yōu)勢菌株W，經(jīng)過革蘭氏染色為陽性菌，對該菌生理生化特性進(jìn)行鑒定，該菌過氧化氫酶陽性，能夠還原硝酸鹽，氧化酶、硫化氫、吲哚、V-P、甲基紅陰性，不能水解淀粉，具有耐鹽性，能夠在0%～12%NaCl胰胨水中生長，與E.profundum生理特性一致[15]。生理特性鑒定結(jié)果結(jié)合16sRNA序列比對結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果確定該分離菌為E.profundum，屬于微小桿菌屬。該菌對青霉素G、氨芐西林、頭孢氨芐等30種抗菌藥物均敏感，回歸感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其可能參與克氏原螯蝦的致病過程。

4 討論

克氏原螯蝦具有極強(qiáng)的繁殖力、環(huán)境適應(yīng)力，風(fēng)味獨(dú)特，受到人們的廣泛喜愛，自傳至中國起，逐漸成為中國主要的淡水養(yǎng)殖蝦類，其養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加，至2020年其產(chǎn)量已超過239萬t。伴隨著養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加，其病害的發(fā)生也變得頻繁[19]。目前對于其病原的研究主要集中在氣單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬細(xì)菌及白斑綜合癥病毒[20]，本研究首次報(bào)道從瀕死克氏原螯蝦肝胰腺中分離出微小桿菌E.profundum。

微小桿菌屬是具有耐熱/冷性、耐堿性、耐鹽性等獨(dú)特性質(zhì)的一類革蘭氏陽性菌[21]，目前對于該菌屬的研究主要集中于其對環(huán)境污染的生物修復(fù)中[22-24]，關(guān)于其對生物致病性相關(guān)的報(bào)道較少。E.profundum首次發(fā)現(xiàn)于深海熱液口[18]，具有耐鹽性，在本研究生理生化特性的耐鹽性實(shí)驗(yàn)中，其在12%NaCl胰胨水中仍可生長，但生長狀況不如較低濃度。基于16s rRNA基因序列進(jìn)行細(xì)菌鑒定是一種常用的有效工具，本研究通過擴(kuò)增獲取分離菌16srRNA基因序列，將其在NCBI中進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)其與E.profundum同源性最高。通過NCBI獲取微小桿菌屬菌種16s rRNA序列，并以大腸桿菌作為外源菌與分離菌16s rRNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果顯示其與E.profundum聚為一支。結(jié)合生理特性鑒定結(jié)果可確定該分離菌為E.profundum，屬于微小桿菌屬。

本研究使用E.profundum對克氏原螯蝦進(jìn)行回歸感染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，感染組與對照組克氏原螯蝦均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。經(jīng)過對瀕死蝦進(jìn)行細(xì)菌的分離純化與鑒定，發(fā)現(xiàn)感染組除分離到E.profundum外，另分離到弗氏檸檬酸桿菌；對照組同樣分離到弗氏檸檬酸桿菌，未分離到E.profundum。弗氏檸檬酸桿菌具有致病性，能感染克氏原螯蝦、羅非魚、加州鱸、虹鱒等多種水生生物[25-28]。回歸感染實(shí)驗(yàn)中克氏原螯蝦的死亡可能與弗氏檸檬酸桿菌有關(guān)，E.profundum可能參與致病，但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

抗生素是目前防控細(xì)菌性疾病的重要手段[29]，本研究使用30種藥物對其耐藥性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其對青霉素G、氨芐西林、頭孢氨芐、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、諾氟沙星、復(fù)方新諾明等30種藥物均敏感，為該菌的防治提供了理論依據(jù)。該菌對藥物較敏感，但在養(yǎng)殖種防治疾病仍需要根據(jù)具體情況對癥下藥，防止抗生素濫用，使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[6]。