周 娜，鐵雅楠，楊雅楠，王欣榮

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

0 引言

哺乳動物在發(fā)育前期，卵巢上的卵母細(xì)胞被單層扁平前體顆粒細(xì)胞包圍后形成了原始卵泡，出生后其原始卵泡總和高達(dá)上百萬個(gè)[1]；但隨著動物生長發(fā)育，只有不到1%的原始卵泡發(fā)育為成熟卵泡并釋放卵子，其余99%的原始卵泡將退化、凋亡，這種現(xiàn)象被稱為卵泡閉鎖[2]。卵泡閉鎖是一種為了維持卵泡內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、控制排卵周期內(nèi)排卵數(shù)目以及選擇優(yōu)質(zhì)卵子等功能的正常生理現(xiàn)象[3-4]。隨著胚胎生物工程技術(shù)的發(fā)展，研究者可以通過超數(shù)排卵獲得更多的可用卵子或胚胎[5]。超數(shù)排卵是指選擇哺乳動物適當(dāng)?shù)纳黼A段，使用各種外源性促性腺激素刺激卵巢，使之比正常情況下有更多的卵泡同時(shí)發(fā)育，并能夠排出具有受精能力卵子的技術(shù)，簡稱“超排”[6]。除激素的種類、濃度影響超排效果外，試驗(yàn)動物的體況、年齡、品種、氣候、季節(jié)及飼養(yǎng)條件也影響著超排效果[7-8]。本試驗(yàn)旨在研究不同濃度孕馬血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin,PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotrophin,HCG)的組合對家兔超排效果的影響，以篩選出試驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳激素組合濃度，為家兔及其他哺乳動物通過超排獲得更多優(yōu)質(zhì)可用胚胎、提高繁殖力、養(yǎng)殖生產(chǎn)效率等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

2020年6—8月在甘肅靖遠(yuǎn)某肉兔養(yǎng)殖場挑選若干品種純正、體格健壯的5月齡性成熟母兔，將其飼養(yǎng)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物場，以消毒清潔的飼養(yǎng)舍單籠飼養(yǎng)，自然光照、自由飲水，使用優(yōu)質(zhì)苜蓿顆粒飼料每天定時(shí)定量飼喂，約7天后進(jìn)行藥物處理和試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)藥械

PMSG和HCG（寧波第二激素廠，獸藥GMP證字11004號，1000 IU）、生理鹽水、沖胚液、M199培養(yǎng)基、M23沖洗液、1 mL注射器、5 mL注射器、頭皮針、5 mL離心管、培養(yǎng)皿、顯微鏡、超凈臺、10～100μL移液槍、細(xì)胞培養(yǎng)箱等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)分組 從試驗(yàn)動物中隨機(jī)挑選24只，每組6只，分別設(shè)計(jì)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ共4組。其中Ⅰ組為對照組，不做任何激素處理，試驗(yàn)開始后72 h合籠交配，交配后14～16 h處死動物并采集卵巢、輸卵管和子宮，從子宮角和輸卵管中沖洗出胚胎并對其進(jìn)行鑒定和培養(yǎng)。其余3組為試驗(yàn)組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，在試驗(yàn)開始第1天分別頸部皮下注射50、70 IU和90 IU的PMSG，繼續(xù)飼喂72 h后再分別耳緣靜脈注射100 IU的HCG，注射后與公兔合籠使其完成交配，并在合籠14～16 h后處死動物進(jìn)行沖胚、鑒定及培養(yǎng)。

1.3.2 合籠要求 合籠前通過外陰觀察法對母兔進(jìn)行發(fā)情鑒定，確定母兔發(fā)情后與公兔1:1合籠，發(fā)現(xiàn)交配成功后分離公母兔單籠飼養(yǎng)，若出現(xiàn)互相撕咬或母兔尾巴濕潤的情況復(fù)配一次，確保交配成功。

1.3.3 樣本采集 用耳緣靜脈注射空氣法處死試驗(yàn)動物并解剖，完整分離出輸卵管、子宮。將卵巢與輸卵管分離后觀察并測量卵巢的排卵點(diǎn)、充血卵泡等物理數(shù)據(jù)。沖胚操作時(shí)，手持連有子宮角的輸卵管，將培養(yǎng)皿懸空接在輸卵管傘部，再用已吸取5 mL沖卵液的注射器刺入子宮角與輸卵管連接處，并將止血鉗固定在針頭后方，緩慢推動注射器，使沖卵液從輸卵管傘部滴入培養(yǎng)皿，從而沖出胚胎。具體操作時(shí)要注意動作輕柔緩慢，避免沖卵液滴在培養(yǎng)皿邊緣及外面，可能會導(dǎo)致胚胎的遺失。

1.3.4 胚胎鑒定 將胚胎放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察和鑒定，根據(jù)胚胎整體形態(tài)、卵裂情況和碎片化程度進(jìn)行鑒定。將所得胚胎分成4個(gè)等級：A級胚胎卵裂球大小均勻整齊，結(jié)構(gòu)緊湊，整體形態(tài)完整輪廓清晰，呈球形；B級胚胎與A級相比卵裂球大小、形狀、密度存在一定的不規(guī)則性，整體輪廓清晰，色調(diào)透明度適中，可見少量液泡；C級胚胎卵裂球大小、密度不均，結(jié)構(gòu)松散凌亂，整體輪廓不清晰，色調(diào)發(fā)暗，游離液泡或細(xì)胞較多；D級碎片化嚴(yán)重、模糊不清、胚胎發(fā)暗、破碎甚至死亡[9-10]。A、B和C級胚胎統(tǒng)稱為可用胚胎，其中A、B級胚胎可用于鮮胚移植或冷凍，C級胚胎只可用于鮮胚移植，而D級為不可用胚胎[11]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 23.0軟件處理所得數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及多重比較。其中P＜0.01表明組間差異極顯著，P＜0.05表明組間差異顯著，P＞0.05表明組間差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PMSG超排處理對家兔輸卵管物理形態(tài)的影響

由表1可見，使用不同濃度的PMSG，家兔輸卵管形態(tài)表現(xiàn)出一定的變化。當(dāng)PMSG注射劑量為90 IU時(shí)，輸卵管長度是123.24 mm，輸卵管峽部的寬度是2.11 mm，宮管結(jié)合部的寬度是2.53 mm；而當(dāng)注射劑量為50 IU時(shí)，輸卵管傘部的寬度是2.88 mm。但無論是與對照組相比，還是不同處理間比較，各組數(shù)值均未表現(xiàn)出顯著差異(P＞0.05)。

表1 不同濃度PMSG/HCG對輸卵管物理形態(tài)的影響 mm

2.2 不同濃度PMSG對家兔超數(shù)排卵效果的影響

由表2可知，隨著PMSG處理濃度的增加，家兔卵巢上的只均充血卵泡數(shù)呈現(xiàn)出增多的趨勢，且差異極顯著(P＜0.01)。與對照組相比，注射50、70 IU和90 IU PMSG后的卵巢充血卵泡數(shù)分別增加了27.03%、91.46%、181.10%。隨著PMSG濃度的增加，家兔只均排卵點(diǎn)和沖出胚胎數(shù)呈現(xiàn)出先增多后又降低的趨勢，且組間差異極顯著(P＜0.01)。特別當(dāng)注射70 IU的PMSG時(shí)，只均排卵點(diǎn)和沖出胚胎數(shù)最多，分別達(dá)到29.00個(gè)和21.83枚，且極顯著高于對照組(P＜0.01)。與對照組相比，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組的只均排卵點(diǎn)增多率分別為66.67%、329.63%、234.52%，只均胚胎數(shù)增多率分別為62.86%、322.24%、230.37%。

表2 不同濃度PMSG/HCG處理后對家兔超數(shù)排卵效果的影響

2.3 不同濃度PMSG處理對胚胎質(zhì)量的影響

由圖1A可知，與對照組相比，試驗(yàn)組的胚胎回收率有所降低，且隨激素濃度的增大回收率上升，但差異不顯著(P＞0.05)。由圖1B可知，各組獲得的總可用胚分別為58、83、213、126枚，隨激素濃度的增大，總可用胚呈先增大后降低的趨勢，且差異極顯著(P＜0.01)，特別是III組獲得了最多的總可用胚，總計(jì)213枚。由圖1C可知，各組胚胎畸形率分別為6.45%、17.82%、18.70%和38.54%，隨PMSG注射濃度的增大，呈上升趨勢且差異極顯著(P＜0.01)，與對照組相比，畸形率分別增加了11.37%、12.25%、32.09%。

圖1 不同濃度PMSG對家兔胚胎的影響

3 討論

研究認(rèn)為，多種生殖激素如PMSG、HCG、促卵泡素 (Follicle-stimulating Hormone,FSH)、 孕 酮(Progesterone，P4、雌二醇(Estradiol，E2)、促黃體激素(Luteinizing Hormone,LH)、前 列腺素(prostaglandin,PG)等均可以用于動物超排，但各激素之間通過相互協(xié)同和制約共同發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)[12]，因此用于家畜超排時(shí)，多以激素組合的形式進(jìn)行，常見的組合有PMSG+HCG的組合及FSH+HCG的組合[13]。HCG是胎盤膜組織中合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的糖蛋白，生物學(xué)活性主要為LH，F(xiàn)SH的活性很小[14]。FSH主要是促進(jìn)卵泡的生長和發(fā)育，而PMSG是由孕馬的子宮內(nèi)膜杯分泌的一種糖蛋白激素，同時(shí)具有FSH和LH的生物學(xué)功能[15]。PMSG價(jià)格便宜容易獲取，但半衰期較長，代謝困難，過量使用會增加母畜患卵巢疾病的風(fēng)險(xiǎn)，不足則起不到相應(yīng)的作用，所以在使用時(shí)要控制最佳劑量[16]。本試驗(yàn)使用相同劑量的HCG和不同濃度的PMSG作為超排激素組合，以研究家兔輸卵管的變化狀況，并從整體超排效果和胚胎質(zhì)量方面來篩選各組合中的效果最佳者。

3.1 不同濃度PMSG對家兔輸卵管物理形態(tài)的影響

譚景和等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，超排處理對輸卵管傘部大小無明顯影響。而關(guān)于生殖激素對母畜輸卵管長度和寬度影響的研究卻鮮有報(bào)道，本研究中試驗(yàn)動物均為體重、體況相當(dāng)?shù)耐慢g健康伊拉肉兔。試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組的輸卵管長度、寬度相比較，各試驗(yàn)組并沒有顯著差異性變化，該結(jié)果也與樊寶仁等[18]的研究結(jié)果吻合。說明在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的激素濃度范圍內(nèi)，PMSG濃度的變化對輸卵管長度和寬度沒有顯著影響。

3.2 不同濃度PMSG對家兔超排效果和胚胎質(zhì)量的影響

超數(shù)排卵作為提高母畜繁殖力和獲得胚胎的重要途徑之一，受多重因素的影響，如超排方法、超排激素、光照、飼養(yǎng)條件、供體母畜所處發(fā)情階段等[19-20]。雖然超排可以獲得更多的胚胎，但通過外源激素的刺激獲得的胚胎質(zhì)量需要進(jìn)行科學(xué)的評估。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著激素濃度的增大，胚胎的畸形率也逐步上升。特別在90 IU的PMSG處理時(shí)不僅排卵點(diǎn)降低，而且胚胎的畸形率增大，導(dǎo)致總可用胚數(shù)少。因此從胚胎質(zhì)量的角度分析，當(dāng)使用PMSG+HCG組合對家兔進(jìn)行超數(shù)排卵，HCG的劑量為100 IU時(shí)，PMSG也不宜超過70 IU。超排所得的卵子是母畜卵巢上的卵母細(xì)胞受外源性激素和母畜原有激素共同協(xié)同調(diào)節(jié)下形成的，因此卵子質(zhì)量也與超排所用的外源性激素有關(guān)，所以超排后胚胎質(zhì)量下降很有可能是受超排激素的影響。有研究表明，超數(shù)排卵可以刺激大量的卵泡發(fā)育，使之在發(fā)育過程中對營養(yǎng)、空間的競爭致使黃體質(zhì)量下降，從而影響所得胚胎回收率及質(zhì)量[21]。王改蘭[22]在用FSH對羊進(jìn)行超排試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨FSH濃度的增大，胚胎畸形率逐步上升。但在林峰等[23]用PMSG對家兔進(jìn)行超排的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)激素濃度對胚胎發(fā)育無影響，但其使用的PMSG和HCG分別為50 IUPMSG和PMSG+HCG為50+50的組合，因此分析可能是激素濃度還未達(dá)到導(dǎo)致其胚胎出現(xiàn)畸形的閾值所致。

4 結(jié)論

研究表明，用HCG定量為100 IU、PMSG為50～90 IU濃度范圍的超排方案處理家兔時(shí)，對其輸卵管的長和寬無顯著作用；PMSG+HCG組合可以有效促進(jìn)家兔超排，特別是70 IU PMSG+100 IU HCG的組合可取得較好的超排效果；當(dāng)PMSG濃度為90 IU時(shí)，會誘導(dǎo)胚胎畸形率增高，影響胚胎質(zhì)量，故建議在生產(chǎn)中謹(jǐn)慎使用。