王 燕，俞春英，周建華，楊燕燕，謝金東，鐘秋明，王訓(xùn)立

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122）

0 引言

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是1957年合成的烷化劑，是一種較廣譜的抗腫瘤藥物[1]。CTX進(jìn)入體內(nèi)后，經(jīng)肝臟的酶催化和烷化等作用下，分解產(chǎn)生的磷酰胺氮芥對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制功能，對(duì)治療多種類(lèi)型的腫瘤效果顯著，特別是對(duì)惡性淋巴瘤效果明顯，其次是慢性粒細(xì)胞白血病，還有對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓病、肺癌、卵巢癌等也有理想的療效[2]。目前，在臨床上，環(huán)磷酰胺作為治療腫瘤的常用化療藥物[3]。

近年來(lái)，CTX作為免疫抑制劑在治療免疫性疾病方面應(yīng)用受到廣泛關(guān)注[4]，CTX通過(guò)活化烷化的基團(tuán)與機(jī)體細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸中氨基、羧基、巰基、磷酸基等親核基團(tuán)相互作用，烷基取代親核基團(tuán)中的氫原子，再與DNA的雙鏈交叉連接，烷化作用的結(jié)果，造成DNA的結(jié)構(gòu)和功能損傷[5]，為此，環(huán)磷酰胺對(duì)機(jī)體免疫功能也有顯著抑制作用，主要表現(xiàn)在對(duì)機(jī)體的器官造成損傷，特別是對(duì)肝臟和腎臟的功能有嚴(yán)重的影響[6]，因此，環(huán)磷酰胺也是制備免疫抑制動(dòng)物模型的藥物。

CTX作為烷化劑的免疫抑制劑，具有作用力強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，在臨床上主要在移植和治療免疫性疾病等方面應(yīng)用，但是，CTX對(duì)免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制尚未有比較全面和系統(tǒng)的了解[7]。制備免疫抑制動(dòng)物模型，對(duì)CTX進(jìn)一步深入研究，使其發(fā)揮更好的臨床效果，具有重要的意義。

福建黃兔是福建省古老特有的家兔品種之一，篩選福建黃兔作為新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有獨(dú)特的地方資源優(yōu)勢(shì)[8]，近幾年已有一些相關(guān)的報(bào)道[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)福建黃兔外周血中電解質(zhì)、肌酶、血糖、血脂、肝功能、腎功能的指標(biāo)分析，為探索環(huán)磷酰胺制備福建黃兔免疫抑制動(dòng)物模型，提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

福建黃兔18只，體重為(2.2±0.2)kg，4月齡，來(lái)源于福建省連江玉華山自然生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)場(chǎng)提供。在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)5天（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK[閩]2020-0003），隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

環(huán)磷酰胺(25 g)，購(gòu)自上海源葉生物有限公司（批號(hào)：X13J11Y115691）；生化指標(biāo)檢測(cè)采用日立診斷產(chǎn)品（上海）有限公司生產(chǎn)的日立7180全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 給藥劑量

模型組：每日上午，腹腔注射環(huán)磷酰胺（生理鹽水溶解），劑量分別為20、40、60、80、100 mg/kg，連續(xù)7天；對(duì)照組：腹腔注射生理鹽水。

1.4 采集樣品

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日（第8天），采用腹腔注射30%烏拉坦注射液（3.5 mL/kg體重）麻醉動(dòng)物，通過(guò)耳緣靜脈取血約2 mL，常溫靜置10 min后，3000 rpm，離心20 min，收集血清樣品于Eppendorf管中，-20℃冰箱保存，待測(cè)。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

應(yīng)用日立7180全自動(dòng)生化分析儀，測(cè)定福建黃兔外周血的生化指標(biāo)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用x±s表示，使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔電解質(zhì)的影響

隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加，外周血的Na、Cl、Ca、碳酸氫根、陰離子間隙、滲透壓等水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；而外周血的K、Mg、P水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔電解質(zhì)的影響 mmol/L

2.2 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔肌酶的影響

不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔外周血的乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)水平有明顯差異(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔肌酶的影響 U/L

2.3 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔血糖的影響

不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔外周血的葡萄糖(GLU)水平有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)表3。

表3 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔血糖的影響 mmol/L

2.4 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔血脂的影響

隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加，外周血的CHOL、TG水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；外周血的HDLC、LDLC、A1APOA1、BAPOB等水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；而不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔外周血的B/A1水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔血脂的影響 mmol/L

2.5 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔肝功能的影響

隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加，外周血的TP、ALB、GLB等水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；外周血的總膽紅素(TBIL)、直接總膽紅素(DBIL)、間接總膽紅素(IBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、AST/ALT、堿性磷酸酶(ALP)水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；而不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔外周血的A/G水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)表5。

表5 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔肝功能的影響 μmol/L

2.6 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔腎功能的影響

不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔外周血的尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、尿酸(UA)水平有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)表6。

表6 不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)黃兔腎功能的影響 mg/kg

3 討論

環(huán)磷酰胺又稱(chēng)環(huán)磷氮芥(Cytoxan，Endoxan，CTX)，是制備免疫抑制動(dòng)物模型應(yīng)用最多的藥物之一，其在生物體外無(wú)活性，在體內(nèi)，環(huán)磷酰胺經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450的氧化作用下，產(chǎn)生醛磷酰胺(aldophosphamide)等中間物質(zhì)，再經(jīng)過(guò)肝微粒體的酶催化作用，形成丙稀醛(Acrolein)、磷酰氮芥(Phosphamide mustard)、去甲氮芥(Normustard)等重要產(chǎn)物，與細(xì)胞的脫氧核糖核酸(DNA)發(fā)生烷化作用[10-12]，引起細(xì)胞毒性。

環(huán)磷酰胺產(chǎn)生細(xì)胞毒性的重要物質(zhì)是丙烯醛，其主要通過(guò)修飾谷胱甘肽巰基組作用，形成巰基尿酸后，經(jīng)腎臟排出體外。丙烯醛通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和蛋白質(zhì)羰基化等作用，對(duì)肝臟和腎臟造成明顯的毒性作用[13-14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CTX對(duì)肝功能有顯著的變化，TP、ALB、GLB等水平顯著偏低；TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、AST/ALT、ALP水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著升高；A/G水平?jīng)]有明顯差異。而B(niǎo)UN、CR、UA水平有顯著升高，說(shuō)明環(huán)磷酰胺可致腎臟發(fā)生病變。

大劑量液體和高劑量CTX(＞80 mg/kg)同時(shí)給予時(shí)，容易引起水中毒現(xiàn)象，出現(xiàn)嚴(yán)重的低鈉血癥，同時(shí)出現(xiàn)血肌酐升高，對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)功能造成嚴(yán)重的影響[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CTX對(duì)電解質(zhì)的影響明顯，Na、Cl、Ca水平顯著低于對(duì)照組，環(huán)磷酰胺造成腎障礙、功能減退；K、Mg、P水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致腎功能不全；環(huán)磷酰胺造成機(jī)體代謝功能的紊亂，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良，引起碳酸氫根、陰離子間隙、滲透壓水平偏低。

CTX可引起心血管系統(tǒng)的損害，研究報(bào)道大劑量CTX(＞80 mg/kg)造成出血性心肌壞死，甚至引起心力衰竭[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同劑量的CTX對(duì)LDH、CK、CKMB水平有明顯影響，由于環(huán)磷酰胺造成機(jī)體的肝臟、腎臟受損，代謝功能障礙，形成肌營(yíng)養(yǎng)不良、心臟功能受損導(dǎo)致LDH、CK、CKMB增高。

由于CTX對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的選擇性不高，對(duì)骨髓、淋巴組織、胃腸粘膜、毛囊等均有抑制，降低機(jī)體免疫力，臨床應(yīng)用中作為免疫抑制劑，主要為治療自身免疫性疾病，及移植手術(shù)中用來(lái)抑制宿主抗移植的免疫反應(yīng)[17]。

目前，CTX的免疫抑制機(jī)制目前尚不十分清楚，伍維高等[18]認(rèn)為CTX可以有效抑制B細(xì)胞活性和自身抗體的形成，而對(duì)T細(xì)胞作用則比較復(fù)雜。大劑量時(shí)產(chǎn)生免疫抑制，如誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞核損傷，代謝功能受抑，增殖受抑，B細(xì)胞比T細(xì)胞對(duì)CTX更敏感；低劑量時(shí)可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)，通過(guò)抑制T細(xì)胞封閉因子，降低Ts細(xì)胞活性使T細(xì)胞充分發(fā)揮免疫作用。

CTX作為抗腫瘤藥研究比較深入，但作為免疫調(diào)節(jié)劑使用時(shí)間不長(zhǎng)，其作用機(jī)制和臨床應(yīng)用尚有許多需深入研究的問(wèn)題。有關(guān)CTX對(duì)免疫系統(tǒng)的影響有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證實(shí)：CTX對(duì)福建黃兔外周血生化指標(biāo)有顯著的影響，不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)外周血的電解質(zhì)、肌酶、血糖、血脂、肝功能、腎功能等指標(biāo)與對(duì)照組比較有顯著的變化，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系。隨著環(huán)磷酰胺劑量的升高，提示環(huán)磷酰胺對(duì)福建黃兔的肝臟和腎臟可能產(chǎn)生不同程度的毒性作用。而不同劑量的環(huán)磷酰胺可造成福建黃兔不同程度的肝腎組織損傷[19]。

福建黃兔是福建兔黃毛系的優(yōu)質(zhì)家兔品種，具有適應(yīng)能力廣、抗病能力強(qiáng)、繁殖能力高等優(yōu)點(diǎn)[20]。本實(shí)驗(yàn)利用福建黃兔的免疫反應(yīng)優(yōu)勢(shì)和體征優(yōu)勢(shì)，通過(guò)環(huán)磷酰胺對(duì)福建黃兔免疫抑制作用的研究，為探索環(huán)磷酰胺制備福建黃兔免疫抑制動(dòng)物模型提供實(shí)驗(yàn)參考，為開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便、具有良好應(yīng)用性、重復(fù)性好的福建黃兔免疫抑制動(dòng)物模型提供理論依據(jù)。