王 燕，俞春英，周建華，楊燕燕，謝金東，鐘秋明，王訓立

（福建中醫(yī)藥大學，福州 350122）

0 引言

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)是1957年合成的烷化劑，是一種較廣譜的抗腫瘤藥物[1]。CTX進入體內后，經肝臟的酶催化和烷化等作用下，分解產生的磷酰胺氮芥對腫瘤細胞有抑制功能，對治療多種類型的腫瘤效果顯著，特別是對惡性淋巴瘤效果明顯，其次是慢性粒細胞白血病，還有對急性淋巴細胞白血病、多發(fā)性骨髓病、肺癌、卵巢癌等也有理想的療效[2]。目前，在臨床上，環(huán)磷酰胺作為治療腫瘤的常用化療藥物[3]。

近年來，CTX作為免疫抑制劑在治療免疫性疾病方面應用受到廣泛關注[4]，CTX通過活化烷化的基團與機體細胞的蛋白質和核酸中氨基、羧基、巰基、磷酸基等親核基團相互作用，烷基取代親核基團中的氫原子，再與DNA的雙鏈交叉連接，烷化作用的結果，造成DNA的結構和功能損傷[5]，為此，環(huán)磷酰胺對機體免疫功能也有顯著抑制作用，主要表現(xiàn)在對機體的器官造成損傷，特別是對肝臟和腎臟的功能有嚴重的影響[6]，因此，環(huán)磷酰胺也是制備免疫抑制動物模型的藥物。

CTX作為烷化劑的免疫抑制劑，具有作用力強、持續(xù)時間長等特點，在臨床上主要在移植和治療免疫性疾病等方面應用，但是，CTX對免疫系統(tǒng)的作用機制尚未有比較全面和系統(tǒng)的了解[7]。制備免疫抑制動物模型，對CTX進一步深入研究，使其發(fā)揮更好的臨床效果，具有重要的意義。

福建黃兔是福建省古老特有的家兔品種之一，篩選福建黃兔作為新型的實驗動物，具有獨特的地方資源優(yōu)勢[8]，近幾年已有一些相關的報道[9]。本實驗通過不同劑量的環(huán)磷酰胺對福建黃兔外周血中電解質、肌酶、血糖、血脂、肝功能、腎功能的指標分析，為探索環(huán)磷酰胺制備福建黃兔免疫抑制動物模型，提供實驗參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

福建黃兔18只，體重為(2.2±0.2)kg，4月齡，來源于福建省連江玉華山自然生態(tài)農業(yè)試驗場提供。在福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物實驗室適應性飼養(yǎng)5天（實驗動物使用許可證SYXK[閩]2020-0003），隨機分組進行實驗。

1.2 試劑與儀器

環(huán)磷酰胺(25 g)，購自上海源葉生物有限公司（批號：X13J11Y115691）；生化指標檢測采用日立診斷產品（上海）有限公司生產的日立7180全自動生化分析儀。

1.3 給藥劑量

模型組：每日上午，腹腔注射環(huán)磷酰胺（生理鹽水溶解），劑量分別為20、40、60、80、100 mg/kg，連續(xù)7天；對照組：腹腔注射生理鹽水。

1.4 采集樣品

實驗結束后次日（第8天），采用腹腔注射30%烏拉坦注射液（3.5 mL/kg體重）麻醉動物，通過耳緣靜脈取血約2 mL，常溫靜置10 min后，3000 rpm，離心20 min，收集血清樣品于Eppendorf管中，-20℃冰箱保存，待測。

1.5 生化指標檢測

應用日立7180全自動生化分析儀，測定福建黃兔外周血的生化指標。

1.6 數(shù)據處理

實驗所得數(shù)據用x±s表示，使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析。

2 結果與分析

2.1 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔電解質的影響

隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加，外周血的Na、Cl、Ca、碳酸氫根、陰離子間隙、滲透壓等水平顯著低于對照組(P＜0.01)；而外周血的K、Mg、P水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著高于對照組(P＜0.01)，見表1。

表1 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔電解質的影響 mmol/L

2.2 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔肌酶的影響

不同劑量的環(huán)磷酰胺對黃兔外周血的乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)水平有明顯差異(P＜0.05)，見表2。

表2 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔肌酶的影響 U/L

2.3 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔血糖的影響

不同劑量的環(huán)磷酰胺對黃兔外周血的葡萄糖(GLU)水平有顯著差異(P＜0.01)，見表3。

表3 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔血糖的影響 mmol/L

2.4 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔血脂的影響

隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加，外周血的CHOL、TG水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著高于對照組(P＜0.05)；外周血的HDLC、LDLC、A1APOA1、BAPOB等水平顯著低于對照組(P＜0.01)；而不同劑量的環(huán)磷酰胺對黃兔外周血的B/A1水平沒有顯著差異(P＞0.05)，見表4。

表4 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔血脂的影響 mmol/L

2.5 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔肝功能的影響

隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加，外周血的TP、ALB、GLB等水平顯著低于對照組(P＜0.01)；外周血的總膽紅素(TBIL)、直接總膽紅素(DBIL)、間接總膽紅素(IBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、AST/ALT、堿性磷酸酶(ALP)水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著高于對照組(P＜0.05)；而不同劑量的環(huán)磷酰胺對黃兔外周血的A/G水平沒有顯著差異(P＞0.05)，見表5。

表5 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔肝功能的影響 μmol/L

2.6 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔腎功能的影響

不同劑量的環(huán)磷酰胺對黃兔外周血的尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、尿酸(UA)水平有顯著差異(P＜0.01)，見表6。

表6 不同劑量環(huán)磷酰胺對黃兔腎功能的影響 mg/kg

3 討論

環(huán)磷酰胺又稱環(huán)磷氮芥(Cytoxan，Endoxan，CTX)，是制備免疫抑制動物模型應用最多的藥物之一，其在生物體外無活性，在體內，環(huán)磷酰胺經肝臟細胞色素P450的氧化作用下，產生醛磷酰胺(aldophosphamide)等中間物質，再經過肝微粒體的酶催化作用，形成丙稀醛(Acrolein)、磷酰氮芥(Phosphamide mustard)、去甲氮芥(Normustard)等重要產物，與細胞的脫氧核糖核酸(DNA)發(fā)生烷化作用[10-12]，引起細胞毒性。

環(huán)磷酰胺產生細胞毒性的重要物質是丙烯醛，其主要通過修飾谷胱甘肽巰基組作用，形成巰基尿酸后，經腎臟排出體外。丙烯醛通過誘導細胞中的氧化應激和蛋白質羰基化等作用，對肝臟和腎臟造成明顯的毒性作用[13-14]。實驗結果表明：CTX對肝功能有顯著的變化，TP、ALB、GLB等水平顯著偏低；TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、AST/ALT、ALP水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著升高；A/G水平沒有明顯差異。而BUN、CR、UA水平有顯著升高，說明環(huán)磷酰胺可致腎臟發(fā)生病變。

大劑量液體和高劑量CTX(＞80 mg/kg)同時給予時，容易引起水中毒現(xiàn)象，出現(xiàn)嚴重的低鈉血癥，同時出現(xiàn)血肌酐升高，對腎小球濾過功能造成嚴重的影響[15]。實驗結果發(fā)現(xiàn)：CTX對電解質的影響明顯，Na、Cl、Ca水平顯著低于對照組，環(huán)磷酰胺造成腎障礙、功能減退；K、Mg、P水平隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加顯著高于對照組，說明環(huán)磷酰胺可導致腎功能不全；環(huán)磷酰胺造成機體代謝功能的紊亂，導致營養(yǎng)不良，引起碳酸氫根、陰離子間隙、滲透壓水平偏低。

CTX可引起心血管系統(tǒng)的損害，研究報道大劑量CTX(＞80 mg/kg)造成出血性心肌壞死，甚至引起心力衰竭[16]。實驗結果顯示：不同劑量的CTX對LDH、CK、CKMB水平有明顯影響，由于環(huán)磷酰胺造成機體的肝臟、腎臟受損，代謝功能障礙，形成肌營養(yǎng)不良、心臟功能受損導致LDH、CK、CKMB增高。

由于CTX對腫瘤細胞和正常細胞的選擇性不高，對骨髓、淋巴組織、胃腸粘膜、毛囊等均有抑制，降低機體免疫力，臨床應用中作為免疫抑制劑，主要為治療自身免疫性疾病，及移植手術中用來抑制宿主抗移植的免疫反應[17]。

目前，CTX的免疫抑制機制目前尚不十分清楚，伍維高等[18]認為CTX可以有效抑制B細胞活性和自身抗體的形成，而對T細胞作用則比較復雜。大劑量時產生免疫抑制，如誘導淋巴細胞核損傷，代謝功能受抑，增殖受抑，B細胞比T細胞對CTX更敏感；低劑量時可以增強免疫反應，通過抑制T細胞封閉因子，降低Ts細胞活性使T細胞充分發(fā)揮免疫作用。

CTX作為抗腫瘤藥研究比較深入，但作為免疫調節(jié)劑使用時間不長，其作用機制和臨床應用尚有許多需深入研究的問題。有關CTX對免疫系統(tǒng)的影響有待后續(xù)進一步研究。

4 結論

實驗證實：CTX對福建黃兔外周血生化指標有顯著的影響，不同劑量的環(huán)磷酰胺對外周血的電解質、肌酶、血糖、血脂、肝功能、腎功能等指標與對照組比較有顯著的變化，并呈現(xiàn)劑量依賴關系。隨著環(huán)磷酰胺劑量的升高，提示環(huán)磷酰胺對福建黃兔的肝臟和腎臟可能產生不同程度的毒性作用。而不同劑量的環(huán)磷酰胺可造成福建黃兔不同程度的肝腎組織損傷[19]。

福建黃兔是福建兔黃毛系的優(yōu)質家兔品種，具有適應能力廣、抗病能力強、繁殖能力高等優(yōu)點[20]。本實驗利用福建黃兔的免疫反應優(yōu)勢和體征優(yōu)勢，通過環(huán)磷酰胺對福建黃兔免疫抑制作用的研究，為探索環(huán)磷酰胺制備福建黃兔免疫抑制動物模型提供實驗參考，為開發(fā)一種經濟簡便、具有良好應用性、重復性好的福建黃兔免疫抑制動物模型提供理論依據。