孫 慧，吳中能，苗婷婷，劉俊龍，蘇曉華，丁昌俊，曹志華，閆彩霞，王 濤

（1安徽省林業(yè)科學(xué)研究院，合肥 230088；2中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；3亳州市林業(yè)科學(xué)研究所，安徽亳州 233600）

0 引言

長(zhǎng)期栽植楊樹純林會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的地力衰退，會(huì)使土壤氮、磷及有機(jī)質(zhì)含量降低，林地生產(chǎn)力急劇下降[1-3]。姜嘯虹等[4]指出合理輪作、適當(dāng)混交、農(nóng)林復(fù)合、科學(xué)施肥等均能改善楊樹林地土壤退化。其中，施肥是提高林地生產(chǎn)力的重要措施之一[5-6]。不同種類的肥料，如：無機(jī)肥、有機(jī)肥、生物炭及生物菌肥等，對(duì)于改善土壤肥力、酶活性及微生物群落組成的作用不同[7-10]。土壤細(xì)菌和真菌是生態(tài)系統(tǒng)中重要的消費(fèi)者和分解者，與土壤相互作用形成動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，不僅在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，還與土壤質(zhì)量息息相關(guān)[11-14]。有研究指出，使用不同的施肥處理均不同程度地影響楊樹林地土壤微生物的組成[15-18]。盧偉偉等[19]得出300℃和500℃制備生物炭對(duì)土壤微生物影響的方向一致同時(shí)制備溫度越高影響程度越大。也有研究表明，施用有機(jī)肥會(huì)增加土壤微生物功能多樣性，比施用無機(jī)肥更能促進(jìn)微生物的繁殖，同時(shí)能提高土壤微生物生物量和碳源利用率，促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)的吸收[20-23]。王國(guó)兵等[24]指出施用有機(jī)肥+生物炭最有利于提高楊樹人工林土壤微生物碳氮磷的含量。但是，針對(duì)施用不同配比的氮肥、磷肥、鉀肥、有機(jī)肥和土壤改良生物菌肥對(duì)楊樹林地的影響還未有相關(guān)的研究，故筆者以安徽北方5年生楊樹二代林為研究對(duì)象，探討不同施肥處理對(duì)楊樹林地土壤微生物群落組成及多樣性的影響，旨在找出合適的肥料配比方案，為提高土壤質(zhì)量及微生物多樣性和土壤可持續(xù)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于渦陽縣曹市鎮(zhèn)徐樓村(33°20′—33°47′N，115°53′—116°33′E)，屬暖溫帶半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候。該區(qū)域氣候溫和，雨量適中，年平均氣溫15.1℃，歷年平均日照時(shí)數(shù)為2015.7 h，年平均降雨量為809.8 mm。

1.2 樣品采集

2016年選取品種、立地及生長(zhǎng)狀況基本一致的楊樹二代林（2025楊）作為試驗(yàn)地。按正交試驗(yàn)法設(shè)計(jì)，采用L16(45)正交設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每個(gè)處理小區(qū)為15株，株行距為3 m×4 m。肥料種類為氮肥（尿素）、磷肥（過磷酸鈣）、鉀肥（硫酸鉀）、有機(jī)肥和土壤改良生物菌肥，每種肥料采用4個(gè)水平，同時(shí)設(shè)3個(gè)對(duì)照，分別為：間作不施肥、只施復(fù)合肥和只施土壤改良生物菌肥，共計(jì)57個(gè)小區(qū)，19種處理及對(duì)照。通過連續(xù)4年的施肥試驗(yàn)，于2019年10月，根據(jù)林木長(zhǎng)勢(shì)情況，選取正交試驗(yàn)中部分代表性處理號(hào)開展了土壤理化性質(zhì)和微生物檢測(cè)，處理號(hào)共有7個(gè)，分別為：1號(hào)（對(duì)照），13號(hào)（年均胸徑增長(zhǎng)量最高），8號(hào)、11號(hào)、7號(hào)（位列2～4位），14號(hào)（超出年均胸徑生長(zhǎng)量平均值、位列第9），12號(hào)（年均胸徑增長(zhǎng)量最低）（施肥處理詳見表1）。分別在小區(qū)內(nèi)劃分對(duì)角線，于對(duì)角線0、兩邊各1/2處，共3個(gè)采樣點(diǎn)采集土樣，分0～20、20～40、40～60 cm土層采取土樣。采集的土樣一部分置于泡沫箱保存，里面放上干冰，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱保存，用于分析土壤微生物細(xì)菌及真菌群落組成；另一部經(jīng)風(fēng)干后研磨過篩，用于土壤酶活性及土壤理化性質(zhì)的測(cè)定。

表1 不同處理施肥劑量統(tǒng)計(jì)表

1.3 指標(biāo)測(cè)定

晾干的土壤過篩后測(cè)定土壤過氧化氫酶(CAT)、脲酶(Urease)、堿性磷酸酶(ALP)、pH、有機(jī)質(zhì)(SOM)、全氮(TN)、速效氮(AN)、全磷(TP)、速效磷(AP)、全鉀(TK)及速效鉀(AK)等土壤酶及土壤理化指標(biāo)。

從冰箱中取出土壤樣品解凍，使用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取。對(duì)16S RNA基因的V3～V4高可變區(qū)片段和ITS rDNA基因序列的ITS1～I(xiàn)TS2片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。后續(xù)PCR產(chǎn)物送廣州基迪奧公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2013、SPSS 20.0、R for Window 3.5.1、MEV 2.0、CANOCO 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用聚類分析方法對(duì)微生物物種關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物多樣性特性

2.1.1 不同施肥處理土壤細(xì)菌多樣性 由表2中α多樣性指數(shù)可知，11號(hào)樣地0～20 cm土層細(xì)菌Sobs值最大，為3552.33，表征其檢測(cè)到的OUT個(gè)數(shù)最多；7號(hào)樣地0～20 cm土層細(xì)菌Shannon值較高，為9.88，代表其物種分布較均勻，多樣性較高；11號(hào)樣地0～20 cm土層細(xì)菌Chao1和Ace值均最大，分別為4280.66和4289.15，表示它們預(yù)測(cè)的OTU個(gè)數(shù)最多；13號(hào)樣地40～60 cm土層土壤細(xì)菌Goods_coverage值較高，為0.9885，反映了其測(cè)序飽和度較高。

表2 不同施肥處理土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)

Rank豐度曲線可直觀的反應(yīng)樣品中包含的分類豐富度和均勻度，由圖1可知，11號(hào)樣地20～40 cm土壤細(xì)菌Rank豐度曲線在橫軸上的跨度最大，其分類的豐富度越高；在垂直方向上，13號(hào)樣地40～60 cm土壤細(xì)菌Rank豐度曲線較平緩，反映了樣品中物種分布較均勻。

圖1 不同施肥處理土壤細(xì)菌Rank豐度曲線

2.1.2 不同施肥處理土壤真菌多樣性 根據(jù)不同施肥處理土壤真菌α多樣性指數(shù)可知（見表3），13號(hào)樣地0～20 cm土層真菌Sobs值最大，為685.00，表征其檢測(cè)到的OUT個(gè)數(shù)最多；12號(hào)樣地0～20 cm土層真菌Shannon值較高，為5.56，代表其物種分布較均勻，多樣性較高；13號(hào)樣地40～60 cm土層真菌Chao1值最大，為1029.11，12號(hào)樣地40～60 cm土層真菌Ace值最大，為1065.36，表示它們預(yù)測(cè)的OTU個(gè)數(shù)最多；CK樣地40～60 cm土層土壤真菌Goods_coverage值較高，為0.9882，反映了其測(cè)序飽和度較高。

表3 不同施肥處理土壤真菌α多樣性指數(shù)

根據(jù)圖2可得，13號(hào)樣地0～20 cm土壤真菌Rank豐度曲線在橫軸上的跨度最大，其分類的豐富度越高；在垂直方向上，12號(hào)樣地0～20 cm土壤真菌Rank豐度曲線較平緩，反映了樣品中物種分布較均勻。

圖2 不同施肥處理土壤真菌Rank豐度曲線

2.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 不同施肥處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) 從試驗(yàn)結(jié)果中挑選所有樣本中的豐度均值排名Top10的物種詳細(xì)展現(xiàn)，其他已知物種歸為Others，未知物種標(biāo)記為Unclassified。圖3中不同施肥處理土壤細(xì)菌群落分布前十的菌屬分別為MND1、Gaiella、小梨形菌屬(Pirellula)專性好氧菌、RB41、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、放線菌綱酸微菌目 Iamia、Dongia、Haliangium、溶桿菌屬(Lysobacter)及Subgroup_10。其中MND1在CK樣地20～40 cm土層所占比例最大，為3.28%；Gaiella在7號(hào)樣地20～40 cm土層所占比例最大，為3.34%；小梨形菌屬(Pirellula)在11號(hào)樣地40～60 cm土層所占比例最大，為3.19%。RB41在8號(hào)樣地40～60 cm土層所占比例最大，為3.28%。

圖3 不同施肥處理土壤細(xì)菌群落屬水平上的分布特征

2.2.2 不同施肥處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu) 根據(jù)圖4可知，不同施肥處理土壤真菌分布前十的菌屬分別為蠟蚧菌屬(Lecanicillium)、被孢霉屬(Mortierella)、鐮刀菌屬 (Fusarium)、Populus、鏈 格 孢 屬 (Alternaria)、Clonostachys、毛 殼 菌 屬 (Chaetomium)、籃 狀 菌 屬(Talaromyces)、曲 霉 屬 (Aspergillus)及 蕓 苔 屬(Brassica)。其中蠟蚧菌屬(Lecanicillium)、被孢霉屬(Mortierella)及鐮刀菌屬(Fusarium)3種菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，蠟蚧菌屬(Lecanicillium)在14號(hào)樣地0～20 cm土層所占比例最大，為27.09%；被孢霉屬(Mortierella)在14號(hào)樣地20～40 cm土層所占比例最大，為25.92%；鐮刀菌屬(Fusarium)在11號(hào)樣地20～40 cm土層所占比例最大，為28.53%。

圖4 不同施肥處理土壤真菌群落屬水平上的分布特征

2.3 不同施肥處理土壤微生物物種聚類分析

2.3.1 不同施肥處理土壤細(xì)菌聚類分析 微生物物種豐度熱圖可以反映樣品之間的物種組成和差異，也可以對(duì)物種和樣本進(jìn)行聚類分析。由圖5屬水平上的物種豐度熱圖可知，7號(hào)樣地40～60 cm和20～40 cm土層在物種組成上較為相似；11號(hào)樣地和12號(hào)樣地0～20 cm土層在物種組成上較為相似。CK樣地0～20 cm土層與8號(hào)、11號(hào)、12號(hào)及13號(hào)樣地0～20 cm土層物種組成上具有較大的差異，CK樣地0～20 cm土層內(nèi)MND1、Ellin6067及出芽菌屬(Gemmata)菌屬組成比例較大，而8號(hào)、11號(hào)、12號(hào)及13號(hào)樣地0～20 cm土層則較小。

圖5 不同施肥處理土壤細(xì)菌群落屬水平上的物種豐度熱圖

2.3.2 不同施肥處理土壤真菌聚類分析 如圖6所示，在屬的分類水平上，對(duì)總豐度前20的物種進(jìn)行熱圖分析表明，8號(hào)樣地0～20 cm土層和12號(hào)樣地20～40 cm土層在物種組成上較為相似。各樣地各土層的優(yōu)勢(shì)菌屬均有較大的差異，說明真菌群落在土層中分布相關(guān)性較小。

圖6 不同施肥處理土壤真菌群落屬水平上的物種豐度熱圖

2.4 土壤微生物與土壤環(huán)境因子RDA分析

2.4.1 細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子RDA分析 RDA排序圖中，分別以細(xì)菌和真菌菌屬組成作為研究對(duì)象（藍(lán)色小圓點(diǎn)表示），以CAT、Urease、ALP、pH、SOM、TN、AN、TP、AP、TK及AK作為土壤環(huán)境變量（紅色箭頭符號(hào)表示）。由圖7可知，只有pH在第一象限，其他環(huán)境因子集中在第三、四象限內(nèi)。其中脲酶和堿性磷酸酶的射線較長(zhǎng)，說明它們對(duì)細(xì)菌菌屬群落組成影響較大，而過氧化氫酶的射線較短，表明其對(duì)細(xì)菌菌屬群落組成影響較小。細(xì)菌菌屬在RDA排序圖中以散射狀分布在圓點(diǎn)附近，個(gè)別菌屬分布較遠(yuǎn)。

圖7 細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子RDA排序

2.4.2 真菌群落與土壤環(huán)境因子RDA分析 由圖8可知，環(huán)境因子主要分布在第一、二及三象限內(nèi)，脲酶的射線較長(zhǎng)，說明其對(duì)真菌菌屬群落組成影響較大；而堿性磷酸酶、pH和速效鉀的射線較短，表明它們對(duì)真菌菌屬群落組成影響較小。真菌菌屬在RDA排序圖中主要集中在圓點(diǎn)附近，不同施肥處理樣地土層真菌群落分布也較分散，說明它們的組成差異較大。

圖8 真菌群落與土壤環(huán)境因子RDA排序

3 討論與結(jié)論

楊樹人工林土壤退化的原因主要是多代連作、不科學(xué)的施肥方式、泛濫的使用農(nóng)藥及不合理的集材方式等，其中科學(xué)施肥是有效改善土壤退化的方式之一[4]。本研究旨在通過對(duì)連續(xù)施用不同肥料的楊樹二代林土壤理化性質(zhì)、酶活性及微生物群落變化地分析，找出適宜改善林地土壤狀況的科學(xué)施肥配比。任嘉紅等[25]指出微生物群落結(jié)構(gòu)的變化會(huì)直接影響土壤的質(zhì)量和健康狀況，土壤微生物細(xì)菌及真菌多樣性指數(shù)越高，其微生物多樣性越豐富，土壤微生態(tài)系統(tǒng)越復(fù)雜，功能就越穩(wěn)定。本研究表明：11號(hào)樣地施用了250N、500P、500有機(jī)肥及200土壤改良生物菌肥，其0～20 cm土層細(xì)菌Sobs、Chao1及Ace值均最大；同時(shí)7號(hào)樣地施用了125N、500P、75K及100土壤改良生物菌肥，其0～20 cm土層細(xì)菌Shannon值較高，表層土壤的細(xì)菌分布較均勻且多樣性較高，這兩種施肥方案適合改善林地表層土壤細(xì)菌群落多樣性。13號(hào)樣地施用了500N、75K、500有機(jī)肥及150土壤改良生物菌肥，其40～60 cm土層真菌Chao1值最大，表征其檢測(cè)到的OUT個(gè)數(shù)最多；12號(hào)樣地施用了250N、750P、25K、150土壤改良生物菌肥，其0～20 cm土層真菌Shannon值最大且40～60 cm土層真菌Ace值最大，反映了此樣地真菌的物種分布較均勻且多樣性較高，這2種施肥方案適合改善林地深層土壤真菌群落多樣性。因此，今后可考慮這些配方復(fù)合菌肥的開發(fā)與推廣應(yīng)用，以達(dá)到有效地解決楊樹林地力衰退問題。

土壤中的溶桿菌屬(Lysobacter)不僅在多種植物根際周圍具有較好的定殖能力，還能夠分泌多種抗生素、生物表面活性物質(zhì)和胞外水解酶來抑制病菌的生長(zhǎng)，控制植物病害的發(fā)生[26]。其中，12號(hào)樣地20～40 cm土層中溶桿菌屬(Lysobacter)所占比例最高，為1.69%，說明溶桿菌屬(Lysobacter)在此土層中定殖的活性較大。鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)憑借自身的高代謝能力、多功能的生理特性、無污染等特點(diǎn)，可在高度貧氧和惡劣條件下生長(zhǎng)，能夠用于芳香化合物的生物降解，其在環(huán)境保護(hù)和工業(yè)生產(chǎn)方面具有很大的應(yīng)用潛力[27]。其中，7號(hào)樣地0～20 cm土層鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)所占比例最高，為2.75%，說明鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在此土層中分布較活躍。

真菌參與土壤中動(dòng)植物殘?bào)w的分解，其在植物有機(jī)體分解的早期階段比細(xì)菌和放線菌更加活躍[20]。其中，蠟蚧菌屬(Lecanicillium)、被孢霉屬(Mortierella)及鐮刀菌屬(Fusarium)3種菌屬為真菌優(yōu)勢(shì)菌屬。蠟蚧菌屬(Lecanicillium)真菌寄主范圍廣泛，即可以寄生蚜蟲、蚧、害螨等多種害蟲，還能寄生線蟲及銹病、白粉病菌等多種植物病原真菌[28]。所以，其是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中重要的生防真菌之一。14號(hào)樣地0～20 cm土層蠟蚧菌屬(Lecanicillium)所占比例最高，為27.09%，說明其在此土層中分布最多。

通過土壤微生物與土壤環(huán)境因子RDA分析表明，脲酶和堿性磷酸酶對(duì)細(xì)菌菌屬群落組成影響較大，而過氧化氫酶對(duì)細(xì)菌菌屬群落組成影響較小。脲酶對(duì)真菌菌屬群落組成影響較大；而堿性磷酸酶、pH和速效鉀對(duì)真菌菌屬群落組成影響較小。綜上所述，脲酶對(duì)土壤細(xì)菌及真菌菌屬群落組成影響均較大，是楊樹林地重要的土壤環(huán)境因子。