徐天，左遨勛，林偉澤，劉平懷

（海南大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，海南 海口 570228）

天然微藻多糖具有一定的生物活性，據(jù)報(bào)道，天然微藻多糖具有抗腫瘤[1]、抗輻射[2]、抗氧化[3]、抑菌[4]、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)[5]、抗糖尿病和抗炎[6]等的作用，加之微藻具有生長速度快、良好的環(huán)境適應(yīng)性、和不占用耕地[7-8]等的特點(diǎn)，因此研究微藻多糖的提取純化及生物活性對微藻資源的進(jìn)一步開發(fā)利用具有一定意義。

膠網(wǎng)藻屬于綠藻門綠藻綱綠球藻目膠網(wǎng)藻科膠網(wǎng)藻屬，其對環(huán)境表現(xiàn)出良好的耐受能力，且蛋白質(zhì)含量較高，在污水處理及規(guī)模化培養(yǎng)這兩個(gè)方面具有發(fā)展前景[9]。除此之外，Kumar等[10]發(fā)現(xiàn)膠網(wǎng)藻Dictyosphaerium chlorelloides具有良好的在極端環(huán)境下的適應(yīng)能力，具有作為胞外多糖來源的潛力。

本文采用超聲提取法對膠網(wǎng)藻（Dictyosphaerium sp.1A10）多糖進(jìn)行提取，并用DEAE-52纖維素柱層析和Sepharose CL-6B凝膠柱層析對粗多糖進(jìn)行純化，測定膠網(wǎng)藻粗多糖和純化后的多糖組分的體外抗氧化能力，通過紫外光譜、紅外光譜、高效液相色譜、高效凝膠色譜等技術(shù)分析了膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4的基本結(jié)構(gòu)，以期為膠網(wǎng)藻多糖的進(jìn)一步研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠網(wǎng)藻（Dictyosphaerium sp.1A10）：海南大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院藻種庫。

硫酸、氫氧化鈉、三氯甲烷、無水葡萄糖、氯化鈉、無水乙醇、甲醇、正丁醇、蒽酮：山東西亞化學(xué)科技有限公司；甘露糖、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸：上海麥克林生化有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪[2，4，6-tri（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]、DEAE-52 纖維素、瓊脂糖凝膠CL-6B、羥自由基清除率檢測試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒：上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

多用途恒溫超聲提取機(jī)（SY-1000E）：北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；冷凍離心機(jī)（3H12RI）：湖南赫西儀器裝備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（TU-18010PC）：北京普析通用儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀（TENSOR27）：德國Bruker公司；數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10PLUS）：德國艾卡儀器設(shè)備有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-10N）：寧波新芝生物股份有限公司；全波長酶標(biāo)儀（XMARKTM）：美國BIO-RAD公司；高效液相色譜儀（Waters 2695）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 膠網(wǎng)藻多糖的提取與純化

1.3.1.1 多糖含量測定

以無水葡萄糖為對照品，用蒽酮硫酸法進(jìn)行多糖含量的測定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：無水葡萄糖用超 純 水 配 制 成 0.005、0.010、0.025、0.050、0.075、0.100 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。再用80%的濃硫酸溶解配制0.2%蒽酮硫酸溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。吸取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和4 mL蒽酮硫酸溶液于10 mL試管中，搖勻后沸水浴10 min，取出后冰浴5 min，在紫外分光光度計(jì)620 nm波長下測定吸光度（A620nm），以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.2 膠網(wǎng)藻粗多糖提取

稱取一定量的膠網(wǎng)藻藻粉，按1:25（g/mL）的料液比加超純水混合，在50℃、超聲功率200W條件下超聲提取40min，冷凍離心收集上層液，沉淀再次按1:25（g/mL）的料液比加超純水混合，重復(fù)超聲提取1次，冷凍離心收集上層液，合并兩次提取的上層液，70℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮。將濃縮液和Sevage試劑[氯仿-正丁醇=4:1（mL/mL）]按 4:1（mL/mL）混合，渦旋振蕩 10 min，8 000 r/min 冷凍離心10 min，分層取上層液，重復(fù)此步驟除3次蛋白得到粗多糖溶液。粗多糖溶液再次70℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，加入無水乙醇至乙醇終濃度為80%以沉淀多糖，4℃過夜，8 000 r/min冷凍離心10 min得到沉淀，將沉淀冷凍干燥得到膠網(wǎng)藻粗多糖。

1.3.1.3 膠網(wǎng)藻粗多糖純化

稱取適量膠網(wǎng)藻粗多糖，用超純水溶解配制成30 mg/mL的粗多糖溶液。對DEAE-52纖維素進(jìn)行預(yù)處理：取100 g DEAE-52纖維素，用超純水浸泡抽濾兩次后，再加超純水溶脹12 h后抽濾。接著用0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡1 h，抽濾并用超純水沖洗至中性，最后用0.5 mol/L的HCl溶液浸泡1 h，抽濾并用超純水沖洗至中性，保存在20%乙醇溶液中，置于4℃冰箱保存待用。用DEAE-52纖維素裝柱（30cm×1.5cm），將粗多糖溶液上樣，依次用 0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，洗脫速度為1.5 mL/min，每個(gè)管收集3 mL洗脫液，每個(gè)梯度收集30管，用蒽酮硫酸法測定A620nm，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，A620nm為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，將分離的各個(gè)峰對應(yīng)的洗脫液合并，透析濃縮，冷凍干燥即得不同多糖組分。

比較不同多糖組分的抗氧化活性，選擇抗氧化活性較高的組分進(jìn)行第二次純化，取適量該多糖組分溶于超純水，上樣交聯(lián)瓊脂糖凝膠CL-6B層析柱（30 cm×1.5 cm），以超純水為洗脫液，洗脫速度為0.4 mL/min，每個(gè)收集管收集3 mL洗脫液，每個(gè)梯度收集30管，用蒽酮硫酸法測定A620nm，繪制洗脫曲線。合并分離峰對應(yīng)的洗脫液，透析濃縮，冷凍干燥。

1.3.2 膠網(wǎng)藻多糖組分化學(xué)性質(zhì)測定

1.3.2.1 總糖含量測定

參照1.3.1的蒽酮硫酸法測定總糖含量。

1.3.2.2 蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定多糖中蛋白質(zhì)含量，測定方法參照考馬斯亮藍(lán)G250說明書的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

1.3.2.3 糖醛酸含量測定

采用咔唑硫酸法測定多糖中糖醛酸含量，測定方法參考文獻(xiàn)[11]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

1.3.2.4 三氯化鐵反應(yīng)

參照文獻(xiàn)[12]的方法檢測多糖中有無酚類物質(zhì)。

1.3.3 膠網(wǎng)藻多糖體外抗氧化能力

1.3.3.1 ABTS+自由基清除能力

參考周新宇等[13]的方法，配制7 mmol/L的ABTS溶液和5 mmol/L過硫酸鉀溶液，ABTS溶液和過硫酸鉀溶液按1:1（mL/mL）混合，室溫避光12 h即得ABTS母液。測定之前，用80%乙醇稀釋ABTS母液即得ABTS工作液。在96孔酶標(biāo)板上，取10 μL不同濃度的樣品，加200 μL ABTS工作液作為測定組；空白組用10 μL 80%乙醇替代樣品，陽性對照組用VC替代樣品。輕搖酶標(biāo)板混合均勻，室溫避光5 min，于酶標(biāo)儀上測定734 nm處的吸光度（A734nm）。

ABTS+自由基清除率/%=（A1-A2）/A1×100

式中：A1為空白組80%乙醇與ABTS工作液的A734nm；A2為測定組樣品與ABTS工作液的A734nm。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力

參考文獻(xiàn) [14]報(bào)道方法，配制得0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液。在96孔酶標(biāo)板上，取100 μL不同濃度的樣品，加100 μL 0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液作為測定組；空白組用100 μL超純水替代測定組的樣品，對照組用100 μL甲醇替代測定組的DPPH-甲醇溶液，陽性對照組用VC替代測定組的樣品。輕搖酶標(biāo)板混合均勻，室溫避光30 min，于酶標(biāo)儀上測定517 nm波長處的吸光度（A517nm）。

DPPH 自由基清除率/%=（A1-A2+A3）/A1×100

式中：A1為空白組的 A517nm；A2為測定組的A517nm；A3為對照組的A517nm。

1.3.3.3 羥自由基清除能力

按照羥自由基清除率檢測試劑盒說明書操作，設(shè)置空白組、未損傷組、損傷組、對照組和測定組共5組，按表1分別向2.0 mL離心管中加入不同量的0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.3）、0.75 mmol/L FeSO4溶液、超純水、樣品溶液和0.01%過氧化氫溶液，共計(jì)1.0 mL，混勻置于37℃水浴1 h，每組各取300 μL到96孔酶標(biāo)板上，于酶標(biāo)儀上測定536 nm波長處的吸光度（A536nm）。

表1 羥自由基測定試驗(yàn)試劑用量Table 1 Reagent dosage of hydroxyl radical assay mL

羥自由基清除率/%=[（A5-A4）-（A3-A1）]/（A2-A3）×100

式中：A1為空白組的A536nm；A2為未損傷組的A536nm；A3為損傷組的 A536nm；A4為對照組的 A536nm；A5為測定組的A536nm。

1.3.3.4 鐵離子還原能力

采用鐵離子還原法（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定鐵離子還原能力，按照總抗氧化能力試劑盒說明書操作，以0.3 mol/L醋酸緩沖液（pH3.6）:TPTZ溶液:FeCl3溶液=10:1:1（體積比）配制成FRAP工作液，將10 mmol/L FeSO4溶液用超純水分別稀釋至 0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5 mmol/L，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在96孔酶標(biāo)板上，取30 μL不同濃度的樣品，加265 μL的0.3 mol/L醋酸緩沖液（pH3.6）作為測定組；標(biāo)準(zhǔn)曲線組用不同濃度的FeSO4溶液替代樣品；空白組用超純水替代樣品。輕搖酶標(biāo)板混合均勻，37℃水浴30 min，于酶標(biāo)儀上測定593 nm波長處的吸光度（A536nm），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出對應(yīng)FeSO4濃度。

1.3.4 膠網(wǎng)藻純化多糖光譜掃描

1.3.4.1 紫外光譜掃描

配制1 mg/mL的膠網(wǎng)藻純化多糖組分水溶液，用紫外分光光度計(jì)在波長200 nm～800 nm進(jìn)行掃描，得到紫外光譜，觀察在260 nm和280 nm處有無峰出現(xiàn)。

1.3.4.2 紅外光譜掃描

取少量膠網(wǎng)藻純化多糖組分，和適量干燥的KBr粉末混勻，置于瑪瑙研缽中，在鎢燈照射下順時(shí)針研磨至無明顯顆粒，進(jìn)行壓片處理得到薄片，在傅里葉變換紅外光譜儀上以波數(shù)4 000 cm-1～400 cm-1進(jìn)行掃描。

1.3.5 分子量測定

分子量采用高效凝膠色譜法測定，測定方法參考曹猛[15]的方法，測定其出峰時(shí)間、重均分子量（weight average molecular weight，Mw）、數(shù)均分子量（number average molecular weight，Mn）、峰值分子量（peak average molecular weight，Mp）。

1.3.6 膠網(wǎng)藻純化多糖的單糖組成測定

膠網(wǎng)藻多糖酸水解：向裝有5 mg樣品的10 mL具塞試管中加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，充氮?dú)饷芊?，置?20℃烘箱中水解5 h。取出放置冷卻至室溫，將三氟乙酸旋干，加入2 mL無水甲醇溶解并旋干（重復(fù)2次）以除去三氟乙酸。用超純水溶解后即得膠網(wǎng)藻純化多糖水解液。

衍生化：配制0.3 mol/L NaOH溶液、0.5 mol/L PMP-甲醇溶液和0.3 mol/L HCl溶液，取300 μL多糖水解液，先加 300 μL NaOH 溶液，再加 300 μL PMP-甲醇溶液混勻，置于70℃水浴50 min，取出冷卻至室溫，加300μLHCl溶液中和。加2mL三氯甲烷振蕩2 min，8 000 r/min離心，取上層水相，重復(fù)此步驟3次得上層水相，過0.22 μL濾膜即可上樣[16]。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品的配制：分別配制4 mmol/L的甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖，按照上述衍生法進(jìn)行衍生，過0.22 μL濾膜即可上樣。

色譜條件：色譜柱為Welch Ultimate AQC18（4.6mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相為0.02 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）:乙腈=83:17（體積比）；流速 1 mL/min；檢測波長 254 nm，柱溫 30℃，進(jìn)樣量 10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)均做3次平行，使用SPSS 23軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并采用SPSS 23軟件中的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，使用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

由圖1可知，回歸方程為Y=0.011X+0.003 9，R2=0.997 3。

圖1 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose content

2.2 膠網(wǎng)藻粗多糖純化與抗氧化活性比較

2.2.1 膠網(wǎng)藻粗多糖DEAE-52柱層析結(jié)果及理化性質(zhì)

膠網(wǎng)藻粗多糖DEAE-52柱層析結(jié)果及理化性質(zhì)見圖2和表2。

圖2 膠網(wǎng)藻粗多糖DEAE-52纖維素柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curves of crude Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharides by DEAE-52 cellulose column chromatography

表2 膠網(wǎng)藻Dictyosphaerium sp.1A10的4個(gè)純化組分的化學(xué)組成Table 2 Chemical composition of the polysaccharides from Dictyosphaerium sp.1A10

從圖2可以看出，膠網(wǎng)藻粗多糖經(jīng)過纖維素柱層析，得到5個(gè)洗脫峰，其中在NaCl溶液濃度為0.1 mol/L時(shí)，有2個(gè)洗脫峰，考慮到0.1 mol/L洗脫濃度下的第1個(gè)洗脫峰的A620nm值過低，難以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，因此舍棄這個(gè)洗脫峰。膠網(wǎng)藻粗多糖經(jīng)過纖維素柱層析總共得到4個(gè)多糖組分。由表2可知，這4個(gè)組分中，總糖含量和糖醛酸含量均有差異，其中PC-1的糖醛酸含量最低，符合其用超純水洗脫出來的情況，可以認(rèn)為PC-1是中性多糖。而PC-4的糖醛酸含量最高，可能是因?yàn)槠鋵?yīng)的洗脫液的鹽濃度較高，使得酸性多糖被洗脫出來[17]。而4種多糖組分的三氯化鐵反應(yīng)均呈陰性，表明4種多糖組分均不含酚類物質(zhì)。最后4種多糖組分的蛋白質(zhì)含量極低，可以認(rèn)為經(jīng)過3次Sevage法除蛋白操作后，多糖組分中的蛋白質(zhì)去除得較干凈。

2.2.2 膠網(wǎng)藻多糖4種組分抗氧化活性比較

膠網(wǎng)藻多糖4種組分抗氧化活性測定結(jié)果見圖3。

圖3 多糖組分抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activities of polysaccharides

由圖3a可以看出，在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，不同多糖組分對DPPH自由基清除率均較低，粗多糖和PC-4的DPPH自由基清除率高于PC-1、PC-2和PC-3，低于VC。在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，PC-1的清除率超過粗多糖，達(dá)到（73.95±2.23）%，僅次于 PC-4，PC-4的清除率最好，達(dá)到（87.94±1.26%），基本上接近陽性對照組VC，表明PC-4對DPPH自由基具有較好的清除能力。Xiao等[19]研究毛竹葉水溶性多糖在濃度為4.0 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到85.9%，與濃度為2.0 mg/mL膠網(wǎng)藻多糖組分PC-4的DPPH自由基清除率接近。

從圖3b可以看出，不同的多糖組分對ABTS+自由基的清除率隨著多糖濃度的上升而上升，當(dāng)濃度為1.0 mg/mL～2.0 mg/mL時(shí)，多糖組分PC-4和粗多糖對ABTS+自由基的清除率明顯比其他多糖組分更高，而PC-1、PC-2和PC-3對ABTS+自由基的清除率較低。當(dāng)濃度為2.0 mg/mL時(shí)，PC-4對ABTS+自由基的清除率達(dá)到（37.45±4.50）%，雖遠(yuǎn)不及同濃度下陽性對照組VC對ABTS+自由基的清除率，但是膠網(wǎng)藻多糖組分PC-4對ABTS+自由基具有一定的清除能力。徐韌博[18]研究松塔多糖組分PKP清除ABTS+自由基的能力，發(fā)現(xiàn)其在濃度為5.0 mg/mL時(shí)，ABTS+自由基清除率接近40%，相比之下，濃度為2.0 mg/mL的膠網(wǎng)藻多糖組分PC-4，其ABTS+自由基清除能力與濃度為5.0 mg/mL的松塔多糖組分PKP清除ABTS+自由基的能力接近。

在鐵離子還原能力測定試驗(yàn)中，測得FeSO4濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=1.78X+0.15，R2=0.997。由圖3c可以看出，不同的多糖組分的鐵離子還原能力隨著多糖濃度的上升而增強(qiáng)。在整個(gè)濃度范圍內(nèi)，粗多糖和PC-4的鐵離子還原能力相當(dāng)，均明顯高于PC-1、PC-2和PC-3，在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，PC-4的鐵離子還原能力超過粗多糖，達(dá)到（322.89±11.89）μmol/L，對應(yīng)吸光值為0.73±0.02，與國琦等[20]研究的濃度為4.0 mg/mL黑松露多糖組分TSP-3的吸光值（0.56）相近，表明它們的還原能力接近。膠網(wǎng)藻多糖組分PC-4的鐵離子還原能力低于陽性對照組VC。

由圖3d可以看出，在羥自由基清除率方面，粗多糖和4個(gè)多糖組分的清除效果均較低，其中PC-1、PC-2和PC-3的清除率遠(yuǎn)低于PC-4和粗多糖。和陽性對照組VC相比，在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，PC-4清除率達(dá)到（27.94±1.86）%，約為同濃度下VC的清除率的一半，表明PC-4具有一定的羥自由基清除能力。沈巳焱[21]研究的紅松松塔多糖在4 mg/mL的羥自由基清除率為26.9%，與PC-4的羥自由基清除率相近。

綜合上述抗氧化活性試驗(yàn)，確定4種多糖組分中PC-4的抗氧化能力較高，因此選擇PC-4進(jìn)行交聯(lián)瓊脂糖凝膠CL-6B柱層析進(jìn)一步純化。

2.2.3 膠網(wǎng)藻多糖組分瓊脂糖凝膠CL-6B柱層析結(jié)果

膠網(wǎng)藻多糖組分瓊脂糖凝膠CL-6B柱層析結(jié)果見圖4。

圖4 膠網(wǎng)藻多糖瓊脂糖凝膠CL-6B柱層析洗脫曲線Fig.4 Elution curves of Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharide by Sepharose CL-6B column chromatography

從圖4可以看出，PC-4的瓊脂糖凝膠CL-6B柱層析洗脫曲線為單一峰，且峰形較為對稱。測定得到該多糖組分的回收率為81.42%，可以認(rèn)為收集得到的多糖純度較高。洗脫曲線和曹猛[15]及李旭東等[12]的研究結(jié)果相似。合并峰對應(yīng)的洗脫液，冷凍干燥，命名為PCP-4多糖組分，用于基本結(jié)構(gòu)分析。

2.2.4 膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4紫外光譜分析

膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4紫外光譜圖見圖5。

圖5 膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4紫外光譜圖Fig.5 Ultraviolet spectrum of Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharide PCP-4

由圖5可知，多糖組分PCP-4在260 nm和280 nm處沒有明顯的吸收峰，又因?yàn)楹怂岷偷鞍踪|(zhì)的紫外吸收峰分別為260 nm和280 nm，因此可以認(rèn)為PCP-4的核酸和蛋白質(zhì)去除得較干凈。

2.2.5 膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4紅外光譜分析

膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4紅外光譜圖見圖6。

圖6 膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum of Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharide PCP-4

由圖6可知，PCP-4在3 414.06 cm-1處的峰為OH氫鍵的伸縮振動(dòng)引起的[22]，2 937.25 cm-1處的峰是由—CH2—的C—H對稱伸縮振動(dòng)引起的[23]，1 651.32 cm-1和1 639.85 cm-1處的峰為羥基的不對稱伸縮振動(dòng)引起的[24]，1 407.94 cm-1處的峰為羧基的對稱振動(dòng)引起的，這個(gè)峰是多糖的特征峰[25]，表明有糖醛酸存在[26]，1 388.50 cm-1處的峰主要是C—H的變角振動(dòng)引起的[27]，1 242.57 cm-1處的峰屬于S=O伸縮振動(dòng)引起的，表明含有硫酸基[28]，1 052.14 cm-1處的峰為C—O—C的伸縮振動(dòng)引起的，表明含有吡喃糖存在[29]。綜上，紅外光譜表明PCP-4具有糖類化合物的特征峰，可以判斷PCP-4為糖類化合物，且PCP-4含有糖醛酸和硫酸基，可以認(rèn)為PCP-4是酸性多糖。

2.2.6 膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4的高效凝膠色譜結(jié)果

膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4的高效凝膠色譜結(jié)果見表3。

表3 膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4的高效凝膠滲透色譜結(jié)果Table 3 High performance gel permeation chromatography（HPGPC）result of Dictyosphaerium sp.1A10 polysaccharide PCP-4

如表3所示，PCP-4多糖組分為單個(gè)峰，其中PCP-4的多分散系數(shù)為1.05，接近1，可以表明PCP-4多糖的分子量分布均勻。

2.2.7 膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4單糖組成結(jié)果

衍生化混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品和膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4的高效液相色譜圖見圖7。

如圖7所示，衍生化混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖出峰效果較好，將其與單個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖進(jìn)行對比，可以得知峰對應(yīng)的單糖成分。

圖7 衍生化混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品和膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4的高效液相色譜圖Fig.7 High performance liquid chromatography（HPLC）chromatograms of standard monosaccharides and PCP-4

經(jīng)過酸水解和衍生化后的膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4與單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行出峰時(shí)間比較，并對峰面積計(jì)算摩爾比值。膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖組成，甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖的摩爾比為9.26:40.62:0.93:5.98:2.01:1.70?？梢娔z網(wǎng)藻多糖組分PCP-4主要由鼠李糖、甘露糖和半乳糖醛酸組成，還有少量的葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖。

2.2.8 膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4的體外抗氧化活性分析

膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4的體外抗氧化活性分析結(jié)果見表4。

如表4所示，多糖組分PCP-4在4種抗氧化活性測定中，均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，PCP-4較多糖組分PC-4的抗氧化活性有一定的提升，但無顯著性差異（P＞0.05）。有報(bào)道表明其它藻類多糖的DPPH自由基清除率表現(xiàn)較好，如小球藻胞外多糖CPEPS-A1在濃度為1.0 mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到（93.89±0.09）%[30]， 柵藻多糖 DAP3在濃度為 5.0 mg/mL時(shí)DPPH 自由基清除率達(dá)到（91.86±1.31）%[26]，相較這兩種藻，膠網(wǎng)藻PCP-4在濃度為2.0 mg/mL下具有較好的DPPH自由基清除率。PCP-4具有一定的ABTS+自由基清除能力，有文獻(xiàn)報(bào)道，葉托馬尾藻多糖在濃度為2.0 mg/mL時(shí)的ABTS+自由基清除率約為30%[31]。PCP-4也具有一定的羥自由基清除能力，和文獻(xiàn)報(bào)道的普通念珠藻相似，清除率隨著PCP-4濃度的增加而增加，但總的清除率很低，普通念珠藻多糖在濃度為2.0 mg/mL時(shí)的羥自由基清除率為20%左右[32]。濃度2.0 mg/mL的PCP-4鐵離子還原力對應(yīng)的吸光度為0.74±0.03，高于5 mg/mL濃度下的褐藻多糖EGPS3-A的吸光度（0.13±0.04）[33]。

表4 多糖組分PCP-4與PC-4的抗氧化活性比較Table 4 Comparison of antioxidant activity between PCP-4 and PC-4

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取法提取膠網(wǎng)藻粗多糖，并對粗多糖進(jìn)行DEAE-52纖維素柱層析分離得到4個(gè)組分PC-1、PC-2、PC-3和PC-4，對抗氧化活性較高的多糖組分PC-4進(jìn)行Sepharose CL-6B凝膠柱層析進(jìn)一步純化得到膠網(wǎng)藻多糖組分PCP-4。其中PCP-4對DPPH自由基清除具有明顯的效果，對ABTS+自由基和羥自由基具有一定的清除效果，且清除率隨濃度的增大而上升，同時(shí)還具有一定的還原能力。PCP-4的Mw為121 762 Da。PCP-4含有吡喃糖、糖醛酸和硫酸基，為酸性多糖。PCP-4主要由鼠李糖、甘露糖和半乳糖醛酸組成，還有少量的葡萄糖醛酸、葡萄糖和半乳糖，其中甘露糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖的摩爾比為9.26:40.62:0.93:5.98:2.01:1.70。