米銳，周遵春，孟楠

（遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧大連 116023）

海參是一種食藥用價(jià)值較高的海洋資源，富含多種生物活性物質(zhì)，包括海參蛋白質(zhì)及多肽、海參多糖、海參皂苷、脂類等，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)這些物質(zhì)的藥理作用展開研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗疲勞、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、延緩衰老和抗血栓等生理活性[1]。同時(shí)，在功效性護(hù)膚品開發(fā)方面，也有研究表明海參多肽具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗氧化、美白、保濕等功效[2]；海參多糖具有抗衰老、促進(jìn)傷口愈合等功效[3]；海參皂苷類物質(zhì)具有抗真菌、抑制氧化損傷及美白等功效[4]。

海參的深加工主要是針對(duì)海參體壁的應(yīng)用，加工過程中會(huì)產(chǎn)生許多副產(chǎn)物，包括海參內(nèi)臟和海參水煮液。海參內(nèi)臟就是加工體壁后剩余的消化、呼吸、水管和生殖系統(tǒng)等部分，其中主要組成成分是消化和生殖系統(tǒng)[5]；海參加工水煮液就是用沸水滅酶處理新鮮海參防止其自溶而產(chǎn)生的含有大量水溶性海參溶出物的液體[6]。此前在海參內(nèi)臟的利用方面，除一小部分加工成食品外，大部分作為海參加工的廢棄物被丟棄，海參水煮液也同樣作為廢水排放，這些都造成了資源的極大浪費(fèi)。研究表明這些副產(chǎn)物含有與體壁相似的功能性活性物質(zhì)，如果能夠有效合理利用，既能提高海參應(yīng)用的附加值，又能緩解資源浪費(fèi)及環(huán)境污染等問題。而目前已有大量研究致力于海參加工副產(chǎn)物的開發(fā)利用，有研究將海參內(nèi)臟加工成調(diào)味料、酶解粉、生物活性肽等產(chǎn)品[7-9]，也有將海參水煮液制成脫脂粉、營(yíng)養(yǎng)飲料，或提取多糖、皂苷等活性成分的相關(guān)研究[4,6,10,11]。但是關(guān)于海參加工副產(chǎn)物在護(hù)膚應(yīng)用領(lǐng)域的報(bào)道還是相對(duì)較少。

本研究以海參體壁酶解物為參考，對(duì)海參體壁溶出物和海參內(nèi)臟酶解物的基本成分進(jìn)行了對(duì)照分析，并對(duì)保濕、防曬、美白、抗氧化、抗衰老功能指標(biāo)進(jìn)行考察，旨在對(duì)海參加工副產(chǎn)物的護(hù)膚功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。目前相關(guān)國產(chǎn)非特殊用途化妝品的研究多集中在海參體壁膠原多肽，而海參體壁成本相對(duì)較高，因此本研究選擇體壁酶解物作為對(duì)照，旨在對(duì)低值的副產(chǎn)物進(jìn)行開發(fā)。副產(chǎn)物的應(yīng)用可以緩解海參體壁作為原材料的成本投入，為副產(chǎn)物加工提供更多的應(yīng)用方向，也為合理開發(fā)海參副產(chǎn)物資源變廢為寶提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

試驗(yàn)用海參體壁酶解物、體壁溶出物及內(nèi)臟酶解物由本實(shí)驗(yàn)室制備，其中體壁及內(nèi)臟酶解物是通過蛋白酶水解后凍干獲得，體壁溶出物是將海參體壁水煮浸泡后的液體經(jīng)凍干獲得。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），左旋多巴（L-DOPA）、酪氨酸酶、彈性蛋白酶、分析純，上海麥克林生化科技有限公司；N-甲氧基琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-纈氨酸對(duì)硝基酰苯胺，分析純，美國Sigma公司；碳酸鉀及硫酸銨等試劑，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞Balb/c3T3購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

Infinite M200 PRO NanoQuant酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；SP-756型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；BSA224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基本成分檢測(cè)

水分含量的測(cè)定：直接干燥法GB/T 5009.3-2016；粗脂肪含量的測(cè)定：酸水解法GB/T 5009.6-2016；灰分含量的測(cè)定：高溫灼燒法GB/T 5009.4-2016；蛋白及多肽含量的測(cè)定：凱氏定氮法GB/T 5009.5-2016；總糖含量的測(cè)定：高效液相色譜法GB/T 5009.8-2016。

1.3.2 MTT法對(duì)Balb/c3T3細(xì)胞活性測(cè)定

將Balb/c3T3細(xì)胞以每毫升1×105個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔190 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，加入10 μL不同濃度樣品進(jìn)行處理，設(shè)置滅菌雙蒸水作為對(duì)照組及無細(xì)胞調(diào)零組，每組3個(gè)孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h，加入20 μL MTT，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶解，室溫震蕩10 min，于490 nm處測(cè)定OD值，按照公式（1）計(jì)算細(xì)胞活力（記為E，%）。

1.3.3 吸濕和保濕性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]中的方法，略有改變，對(duì)3種海參樣品的吸濕性和保濕性進(jìn)行試驗(yàn)。

吸濕性：分別在兩個(gè)干燥器底部用飽和碳酸鉀溶液（RH為43%）和飽和硫酸銨溶液（RH為81%）來維持內(nèi)部相對(duì)恒定的濕度條件，然后稱取l g凍干后的粉末樣品于平皿中，將平皿放入干燥器內(nèi)，設(shè)置重復(fù)試驗(yàn)組，在12 h內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)，取出平皿精確稱量，由公式（2）計(jì)算樣品的吸濕率（記為F，%）。

式中：

Wo——吸濕性試驗(yàn)前樣品質(zhì)量，g；

Wn——吸濕性試驗(yàn)后樣品質(zhì)量，g。

保濕性：將完成吸濕性試驗(yàn)的樣品放入干燥器中進(jìn)行保濕性試驗(yàn)，干燥器底部放有200 g經(jīng)過干燥處理的變色硅膠，在12 h內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)，取出平皿精確稱量，由公式（3）計(jì)算樣品的保濕率（記為G，%）。

式中：

Ho——保濕性試驗(yàn)前的樣品質(zhì)量，g。

Hn——保濕性試驗(yàn)后的樣品質(zhì)量，g

1.3.4 防曬性測(cè)定

采用文獻(xiàn)[13]中方法，通過計(jì)算紫外吸收率來評(píng)價(jià)3種海參樣品的防曬性能。將樣品溶液的質(zhì)量濃度定為1 g/L，測(cè)定樣品在紫外波長(zhǎng)230~400 nm范圍的透過率（I），并按照下式計(jì)算紫外吸收率（記為J，%）。

1.3.5 DPPH自由基清除活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]的方法，取各試驗(yàn)濃度的樣品溶液分別加入離心管中，再加入用無水乙醇配制的濃度0.2 mmol/L的DPPH工作液，混合均勻，待反應(yīng)30 min后，于517 nm處測(cè)定其吸光度。DPPH自由基清除率（K，%）按下式計(jì)算。

式中：

A1——2 mL樣品液+2 mL DPPH工作液的吸光度；

A2——2 mL樣品液+2 mL無水乙醇的吸光度；

A0——2 mL蒸餾水+2 mL DPPH工作液的吸光度。

1.3.6 ABTS法總抗氧化活性測(cè)定

按照說明書要求配制ABTS工作溶液，氧化劑作用下促使ABTS生成ABTS+，在抗氧化性樣品存在下，ABTS+的生成受到抑制，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光度，并調(diào)整樣品到適宜的工作濃度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。

1.3.7 FRAP法總抗氧化活性測(cè)定

按照說明書要求配制FRAP工作溶液，在酸性條件下抗氧化性樣品能夠還原Fe3+，于593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光度，并調(diào)整樣品到適宜的工作濃度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。

1.3.8 美白性能測(cè)定

通過測(cè)定反應(yīng)生成的多巴醌的吸光度[15]，計(jì)算酪氨酸酶抑制率來評(píng)價(jià)美白性能。用PBS磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.8）配制檢測(cè)試劑和系列濃度梯度的樣品溶液，將檢測(cè)試劑和樣品溶液依次加入到酶標(biāo)板中，在加入200 U/mL的酪氨酸酶溶液后，把酶標(biāo)板放入37 ℃溫育10 min，再加入底物L(fēng)-DOPA反應(yīng)10 min，測(cè)定其在475 nm處的吸光度。酪氨酸酶抑制率（M，%）按下式計(jì)算。

式中：

A——100 μL PBS 溶液+50 μL 酪氨酸酶+50 μL 底物；

B——150 μL PBS 溶液+50 μL 酪氨酸酶；

C——50 μL PBS 溶液+50 μL 樣品+50 μL 酪氨酸酶+50 μL底物；

D——100 μL PBS溶液+50 μL 樣品+50 μL 酪氨酸酶。

1.3.9 抗衰老性能測(cè)定

按照文獻(xiàn)[16]方法，通過測(cè)定彈性蛋白酶抑制活性來評(píng)價(jià)抗衰老性能。用0.1 mol/L濃度的Tris-Cl緩沖溶液（pH值8.0）配制濃度為1.015 mmol/L的反應(yīng)底物 N-甲氧基琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-纈氨酸對(duì)硝基酰苯胺溶液。在酶標(biāo)板中加入試驗(yàn)樣品溶液和反應(yīng)底物，于25 ℃反應(yīng)5 min，加入0.5 U/mL的彈性蛋白酶溶液后，再溫育30 min，測(cè)定其在410 nm處的吸光度。彈性蛋白酶抑制率（記為N，%）按下式計(jì)算。

式中：

A3——10 μL 樣品+130 μL 反應(yīng)底物+15 μL 彈性蛋白酶的吸光度；

A4——10 μL 去離子水+130 μL 反應(yīng)底物+15 μL 彈性蛋白酶的吸光度；

A5——10 μL樣品+130 μL反應(yīng)底物+15 μL去離子水的吸光度。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 基本成分檢測(cè)

測(cè)定體壁酶解物對(duì)照及體壁溶出物、內(nèi)臟酶解物中蛋白質(zhì)及多肽、總糖、粗脂肪、灰分和水分的含量，數(shù)據(jù)如表1所示。對(duì)照及樣品中，海參體壁及內(nèi)臟酶解物的主要成分為蛋白質(zhì)及多肽，所占比重分別為50.62%和 49.12%，而體壁溶出物的蛋白相對(duì)含量則較低，與海參體壁及內(nèi)臟酶解物相比差異顯著（p＜0.05）。檢測(cè)到的總糖和粗脂肪含量也相對(duì)較高，樣品之間在成分占比上略有差異。樣品中灰分所占比重很大，其中體壁及內(nèi)臟酶解物中灰分來自于酶解過程中的無機(jī)鹽離子的釋放；而由于水煮加工過程中大量鹽分的溶出，體壁溶出物中灰分所占比重高達(dá)45.52%，與其他樣品相比差異顯著（p＜0.05）。另外，樣品的水分含量也相對(duì)較高，這可能與冷凍干燥程度及營(yíng)養(yǎng)成分的分配比重相關(guān)。

表1 試驗(yàn)樣品成分分析（g/100 g）Table 1 Composition analysis of the samples

2.2 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

從基本成分的檢測(cè)可以看出，海參樣品中富含多肽、多糖、脂類等天然成分，適于作為潛在的化妝品添加劑的應(yīng)用開發(fā)及功效成分的提取研究，因此測(cè)定樣品對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞Balb/c3T3活性的影響，以評(píng)估其安全性。成纖維細(xì)胞是在組織損傷、重建修復(fù)中起重要作用的一類細(xì)胞，能自主地生成和分泌膠原蛋白和其他蛋白質(zhì)，其細(xì)胞活性的變化可以用于評(píng)估樣品對(duì)皮膚細(xì)胞的安全性。如圖1所示，海參內(nèi)臟酶解物濃度小于1.0 mg/mL時(shí)不影響成纖維細(xì)胞的活性，與對(duì)照體壁酶解物有相似的細(xì)胞活性，且具有劑量依賴性；而體壁溶出物在濃度小于0.5 mg/mL時(shí)不影響成纖維細(xì)胞的活性，表明在該添加量范圍內(nèi)對(duì)成纖維細(xì)胞無毒性，也說明了海參副產(chǎn)物樣品具有較好的安全性，可以應(yīng)用于化妝品相關(guān)研究中。

圖1 樣品對(duì)成纖維細(xì)胞Balb/c3T3活性的影響Fig.1 The effect of samples on the viability of fibroblast cell

2.3 吸濕保濕性能

吸濕保濕性是衡量化妝品的關(guān)鍵因素，皮膚中保濕因子的缺失會(huì)導(dǎo)致蒸發(fā)失水、干燥粗糙、甚至脆裂等肌膚問題，加速皮膚衰老的程度[17]。因此，化妝品中通常需要添加保濕成分來提高皮膚的含水量，減少干燥引起的皺褶等現(xiàn)象。天然保濕劑具備良好的補(bǔ)水效果和生物親和性，一直是新型保濕產(chǎn)品研發(fā)工作關(guān)注的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)以體壁酶解物作為參考，對(duì)比考察了體壁溶出物和內(nèi)臟酶解物在相對(duì)濕度43%和81%條件下，12 h的吸濕保濕性。

如圖2所示，樣品在43% RH條件下，吸濕性能較弱，體壁酶解物、體壁溶出物和內(nèi)臟酶解物在 7 h吸濕率分別為1.45%、3.54%和2.45%。長(zhǎng)時(shí)間置于該濕度條件下，吸濕率反而呈下降趨勢(shì)。而樣品在81%RH條件下顯示了較好的吸濕性能，內(nèi)臟酶解物表現(xiàn)

圖2 樣品分別在濕度43% RH和81% RH條件下的吸濕性Fig.2 Moisture-absorption ability of samples at relative humidity (RH) 43% and 81%

出與體壁酶解物相似的吸濕率曲線，在12 h吸濕率分別為52.51%和55.75%。陽性對(duì)照甘油在43% RH條件下吸濕性高于樣品，12 h吸濕率為17.23%。甘油在81% RH條件下12 h吸濕率為47.42%。但是就保濕率而言，如圖3所示，樣品都能夠在12 h內(nèi)保持水分含量的穩(wěn)定，沒有呈現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì)，說明樣品均具有良好的保濕性能，內(nèi)臟酶解物與體壁酶解物在81%RH條件下的保濕率分別為95.04%和94.93%。陽性對(duì)照甘油在相對(duì)濕度43%和81%條件下12 h的保濕性分別為98.32%和92.83%。綜合分析，內(nèi)臟酶解物在兩種濕度條件下，均表現(xiàn)出穩(wěn)定的吸濕保濕性能。此前有研究表明海參膠原蛋白在12 h內(nèi)的吸濕性快速升高，6 h以內(nèi)的保濕性相對(duì)穩(wěn)定，與本研究結(jié)果中趨勢(shì)基本一致[18]。因?yàn)楹⒛z原多肽中含有大量的羧基、氨基及羥基等親水基團(tuán)，易于吸收并能夠有效鎖住水分，具有良好的吸濕保濕性能，可作為天然保濕劑應(yīng)用于護(hù)膚產(chǎn)品的研發(fā)[19]。而本研究中驗(yàn)證這兩種副產(chǎn)物，尤其是內(nèi)臟酶解物，也表現(xiàn)出優(yōu)良的吸濕保濕性能，在應(yīng)用中可以作為體壁酶解物的補(bǔ)充與替代品使用。

圖3 樣品分別在濕度43% RH和81% RH條件下的保濕性Fig.3 Moisture-retention ability of samples at relative humidity(RH) 43% and 81%

2.4 防曬性能

長(zhǎng)期的紫外線照射，會(huì)促使真皮層的膠原蛋白和彈性蛋白酶變性，導(dǎo)致皺紋和皮膚的光老化[20]。同時(shí)，三種波長(zhǎng)范圍的紫外線對(duì)皮膚都有不同程度的危害，長(zhǎng)波紫外線UVA（320~400 nm）的穿透能力極強(qiáng)，可輻射至真皮層引發(fā)氧化反應(yīng)而導(dǎo)致組織炎癥，是皮膚曬黑的主因；而中波紫外線UVB（280~320 nm）具有很強(qiáng)的誘變性，可誘發(fā)機(jī)體DNA的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚組織的曬傷[21]；短波紫外線UVC（200~280 nm）通?？梢员怀粞跷眨浅粞鯇訐p耗造成了UVC輻射的潛在威脅，導(dǎo)致皮膚癌變的危險(xiǎn)。本研究中海參樣品的紫外吸收率如圖4所示，體壁酶解物對(duì)照、體壁溶出物和內(nèi)臟酶解物在UVC波長(zhǎng)范圍均發(fā)揮較好的吸收作用，平均紫外吸收率分別為90.84%、94.52%、92.73%，UVC波長(zhǎng)的高吸收率與文獻(xiàn)中海參膠原蛋白檢測(cè)的紫外吸收峰值在236.5 nm范圍的數(shù)據(jù)比較相符[18]；在UVB波長(zhǎng)范圍，體壁酶解物對(duì)照、體壁溶出物和內(nèi)臟酶解物的紫外吸收效果平均可以達(dá)到27.99%、33.89%和30.45%；在UVA波長(zhǎng)范圍，樣品的紫外吸收效果不佳。本試驗(yàn)結(jié)果也說明海參樣品具有一定的紫外吸收的功能，且對(duì)UVC的遮蔽作用優(yōu)于UVB和UVA，因?yàn)榈鞍纂念愒?06~220 nm波長(zhǎng)區(qū)間有紫外吸收作用，如果含有芳香族基團(tuán)，紫外吸收最大值在268~280 nm，都介于UVC波長(zhǎng)范圍內(nèi)，并且多糖等成分在此波長(zhǎng)范圍也有吸收作用，紫外吸收作用進(jìn)而可以緩解皮膚因輻射引起的氧化應(yīng)激壓力，抑制炎癥的發(fā)生及損傷作用。其中體壁溶出物表現(xiàn)出優(yōu)于其他樣品的紫外吸收性能，在護(hù)膚應(yīng)用中可以起到一定的防曬作用。

圖4 樣品在紫外波長(zhǎng)下的紫外吸收率Fig.4 Average UV absorbance of samples in different wavelength ranges

2.5 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除活性檢測(cè)是衡量物質(zhì)抗氧化能力的常用方法。由圖5中曲線可知，樣品的DPPH自由基清除率是隨著樣品濃度的升高而逐漸升高的趨勢(shì)。海參體壁酶解物、體壁溶出物及內(nèi)臟酶解物對(duì) DPPH自由基清除率的IC50分別是3.63、3.00和3.19 mg/mL，IC50值越小則DPPH自由基清除活性越好，表明樣品的DPPH自由基清除活性為：體壁溶出物＞內(nèi)臟酶解物＞體壁酶解物，兩種海參副產(chǎn)物的DPPH自由基清除功能優(yōu)于體壁酶解物，均具有較好的抗氧化能力，在護(hù)膚應(yīng)用中可以作為天然抗氧化成分使用。陽性對(duì)照Vc的DPPH自由基清除率的IC50為0.024 mg/mL。此前已有研究對(duì)海參酶解多肽的抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明1 mg/mL濃度海參多肽的DPPH自由基清除率達(dá)到56.3%[22]。也有對(duì)海參副產(chǎn)物開展抗氧化活性的研究，數(shù)據(jù)顯示刺參腸酶解多肽清除DPPH自由基的IC50為3.31 mg/mL[23]，通過海參水煮液水解制備的海參肽，其清除DPPH自由基的IC50為2.015 mg/mL[24]，以上研究結(jié)果雖然與本試驗(yàn)結(jié)果略有差異，也未將不同樣品進(jìn)行對(duì)比研究，但都驗(yàn)證了海參樣品的抗氧化功能，也說明了海參副產(chǎn)物在提升抗氧化應(yīng)激作用方面的潛力。氧化應(yīng)激會(huì)影響衰老過程的速率，主要就是不斷增加的自由基在氧化過程中破壞了膠原蛋白，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)衰老癥狀[25]。膠原蛋白是真皮結(jié)締組織的細(xì)胞外基質(zhì)中含量最豐富的蛋白質(zhì)，能夠支撐結(jié)締組織的結(jié)構(gòu)和保持細(xì)胞形態(tài)，膠原蛋白的變化會(huì)引發(fā)皮膚松弛和皺紋的產(chǎn)生[26]。因此，有效防止自由基對(duì)膠原蛋白造成的損傷，才能延緩皮膚老化。海參體壁和內(nèi)臟經(jīng)過酶解后，產(chǎn)物中多肽類占比較高，肽類的抗氧化劑具有很強(qiáng)的生物活性，在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激過程中對(duì)機(jī)體具有顯著的保護(hù)作用[27]。而體壁酶解物與兩種副產(chǎn)物在DPPH自由基清除率上的差異，可能來自于多糖等其他活性成分的影響。

圖5 樣品的DPPH自由基清除活性Fig.5 DPPH free radical scavenging effect of samples

2.6 ABTS法總抗氧化性能

ABTS測(cè)定法是衡量抗氧化劑抗氧化能力的常用方法。體內(nèi)（細(xì)胞內(nèi)）的自由基可以分為兩類：活性氧（ROS）和活性氮（RNS）[28]，自由基的產(chǎn)生和過量堆積會(huì)抑制內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的活性，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)而對(duì)機(jī)體造成損傷，應(yīng)用ABTS方法則可檢測(cè)RNS自由基的清除水平。由圖6可知，海參體壁酶解物、體壁溶出物及內(nèi)臟酶解物的 ABTS法總抗氧化能力分別為2.17、4.48、3.02 mmol/g，其強(qiáng)弱為：體壁溶出物＞內(nèi)臟酶解物＞體壁酶解物，與DPPH自由基清除活性的排序一致，說明這兩種海參副產(chǎn)物在RNS清除水平上也具有很好的抗氧化能力，可以作為多效的天然抗氧化成分應(yīng)用。陽性對(duì)照Vc的總抗氧化能力為30.57 mmol/g。

圖6 樣品的ABTS總抗氧化性能Fig.6 Total anti-oxidation capacity of the samples by ABTS method

2.7 FRAP法總抗氧化性能

FRAP測(cè)定法也是評(píng)價(jià)抗氧化劑抗氧化能力的常用方法。FRAP法的檢測(cè)原理是基于鐵離子還原為亞鐵離子的還原反應(yīng)，反映的是電子的轉(zhuǎn)移能力，而電子轉(zhuǎn)移是自由基清除的一種機(jī)制[29]。所以，結(jié)合DPPH自由基和ABTS自由基清除活性的測(cè)定，考察FRAP法抗氧化能力才有意義。由圖7可知，海參體壁酶解物、體壁溶出物及內(nèi)臟酶解物的FRAP法總抗氧化能力分別為3.34、5.91、4.19 mmol/g，其強(qiáng)弱為：體壁溶出物＞內(nèi)臟酶解物＞體壁酶解物，抗氧化趨勢(shì)與DPPH自由基清除率及ABTS法總抗氧化能力一致，體壁溶出物效果最佳。表明樣品具有抗氧化活性，能有效地清除DPPH自由基和ABTS自由基的同時(shí)，還可以有效還原鐵離子，說明樣品的抗氧化活性可能通過電子轉(zhuǎn)移來實(shí)現(xiàn)。陽性對(duì)照Vc的總抗氧化能力為293.14 mmol/g。

圖7 樣品的FRAP總抗氧化性能Fig.7 Total anti-oxidation capacity of the samples by FRAP method

2.8 美白性能

在護(hù)膚應(yīng)用領(lǐng)域，美白性能一直是大家關(guān)注的熱點(diǎn)，美白性能研究也側(cè)重在抑制酪氨酸酶活性上。酪氨酸酶在黑色素生成的第一步中是起到限速調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶，可將酪氨酸氧化成多巴醌，然后生成多巴色素，最終氧化生成黑色素[30]，形成黑色素的反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生活性氧又加速了皮膚色素的沉著。因此，通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑色素的生成可以作為皮膚美白的一個(gè)方法。海洋源提取的天然活性物質(zhì)在美白劑應(yīng)用上也具有較高的生物相容性及安全性。圖8則反映了海參樣品對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用，體壁酶解物、體壁溶出物及內(nèi)臟酶解物對(duì)酪氨酸酶活性抑制率的IC50分別為16.82、49.43、40.00 mg/mL，所以酪氨酸酶活性抑制作用為：體壁酶解物＞內(nèi)臟酶解物＞體壁溶出物，對(duì)照體壁酶解物具有更好的酪氨酸蛋白酶抑制活性。陽性對(duì)照熊果苷對(duì)酪氨酸酶抑制率的IC50為1.12 mg/mL。已有研究表明海洋活性膠原肽對(duì)酪氨酸酶活性抑制率的 IC50為17.06 mg/mL[31]，與本研究結(jié)果類似。而海參體壁酶解物主要成分也是膠原蛋白肽類，是其具有較好的美白功效的主要原因，膠原蛋白可以通過螯合銅離子來抑制酪氨酸酶活性，也可以通過降低細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷的含量，來抑制酪氨酸酶的表達(dá)[32]。而兩種副產(chǎn)物的抑制活性雖然低于體壁酶解物，但也都能夠發(fā)揮較好的酪氨酸酶抑制劑的作用。副產(chǎn)物中膠原蛋白含量低于體壁，但仍含有多糖等活性物質(zhì)，其酪氨酸酶抑制活性可能源自蛋白肽類、多糖、皂苷等的協(xié)同作用，已有研究表明海參中提取的皂苷等活性物質(zhì)也能發(fā)揮美白功效，從海參水煮液中提取的皂苷組分在質(zhì)量濃度為50~70 g/L時(shí)，對(duì)酪氨酸酶抑制率穩(wěn)定在30.4%[4]。

圖8 樣品的酪氨酸酶抑制率Fig.8 Tyrosinase inhibition rate of samples

2.9 抗衰老性能

皮膚的衰老包括內(nèi)源性和外源性的老化，內(nèi)源性老化可分為自然衰老和由于皮膚彈性的變化引發(fā)的衰老，而外源性皮膚衰老是由紫外線輻射導(dǎo)致的光老化[33]。在衰老的過程中彈性蛋白酶發(fā)揮了重要的作用，它是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中主要負(fù)責(zé)分解彈性蛋白的一種酶，也能降解膠原蛋白、纖連蛋白等，造成皮膚彈性的變化，皮膚組織結(jié)構(gòu)完整性的喪失，引發(fā)衰老[34]。因此，彈性蛋白酶抑制劑可以作為潛在的化妝品成分用于對(duì)抗皮膚老化，有效預(yù)防皮膚彈性的喪失和下垂等問題。圖9是海參體壁酶解物、體壁溶出物及內(nèi)臟酶解物抑制彈性蛋白酶活性的曲線，可以看到樣品在一定程度上具有彈性蛋白酶抑制活性，其中體壁酶解物與體壁溶出物的曲線呈曲折上升趨勢(shì)，而內(nèi)臟酶解物的抑制活性波動(dòng)幅度較大，在80 mg/mL和100 mg/mL的高濃度區(qū)間表現(xiàn)出較好的抑制作用，對(duì)彈性蛋白酶的抑制率可以達(dá)到26.34%。有研究對(duì)海參蒸煮液中提取的糖蛋白進(jìn)行抗皺功能分析，10 mg/mL高分子量糖蛋白的抑制率可達(dá)28.78%[35]，也驗(yàn)證了海參副產(chǎn)物活性成分具有抗衰老作用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以海參體壁酶解物為參照，驗(yàn)證了體壁溶出物及內(nèi)臟酶解物的吸濕保濕、防曬、抗氧化、美白及抗衰老功能。結(jié)果顯示，這兩種海參副產(chǎn)物均具備護(hù)膚保健的功能，其中體壁溶出物的防曬、抗氧化功能表現(xiàn)最佳，內(nèi)臟酶解物的吸濕保濕、抗衰老功能最佳?？梢杂行Ю脙煞N副產(chǎn)物在護(hù)膚功效上的作用優(yōu)勢(shì)，將二者結(jié)合應(yīng)用或者作為體壁酶解物的補(bǔ)充及替代品應(yīng)用在護(hù)膚產(chǎn)品上，以達(dá)到更好的護(hù)膚效果。這兩種海參副產(chǎn)物與體壁酶解物之間在多種護(hù)膚功效中存在一定的差異性，這可能是由于它們?cè)诠πС煞旨敖M成配比上的不同引起的，這也為未來副產(chǎn)物功效成分深度開發(fā)及配比應(yīng)用研究提供思路，以期使海參副產(chǎn)物在護(hù)膚應(yīng)用領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)功能優(yōu)化及協(xié)同增效。