袁陽蕾，袁利杰，郭立凈，石璐

（河南省食品檢驗(yàn)研究院，國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品安全快速檢測與智慧監(jiān)管技術(shù)），河南省特殊食品工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450003）

隨著生活節(jié)奏的加快，外賣和快餐食品成為很多上班族的主要飲食來源，隨之而來的是胃腸道消化方面的疾病越來越多，改善胃腸道功能類保健食品[1]備受歡迎。其存在的安全問題不容忽視，尤其是保健食品中非法添加化學(xué)藥物的事件不斷被報(bào)道[2-5]。消費(fèi)者購買服用非法添加藥物的保健食品，會(huì)誤認(rèn)為產(chǎn)品“療效好”、且“安全可靠，對身體無害處”，但是長期服用會(huì)對人的身體健康產(chǎn)生不良影響。

常見的改善胃腸道功能類化合物主要有多巴胺受體阻斷藥、H2受體阻斷藥、緩瀉類藥物、促胃液素受體阻斷藥、胃質(zhì)子泵抑制藥、5-HT4受體激動(dòng)藥[6]。這些治療胃腸道類藥物長期大量服用可能會(huì)產(chǎn)生腹痛、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)[7-11]，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命安全。

目前已報(bào)道的非法添加藥物的檢測手段主要有光譜法[12-15]、色譜法[16-18]、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[7-11,19]、離子遷移譜[20,21]、快檢試劑盒[22]等。四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法具有高分辨率和高質(zhì)量精度的優(yōu)點(diǎn)，質(zhì)量范圍寬，動(dòng)態(tài)范圍廣[23]，突出了高效液相色譜的有效分離能力，同時(shí)又彌補(bǔ)了低分辨率質(zhì)譜可能出現(xiàn)的假陽性問題，可以在沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下，根據(jù)已建立好的數(shù)據(jù)庫對未知樣品進(jìn)行定性分析[22]，節(jié)約時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品安全[24-33]、藥物分析[23,34-37]、代謝組學(xué)[38]等相關(guān)領(lǐng)域。本研究以市面上常見的改善胃腸道功能類保健食品為研究對象，建立了一種超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法，可同時(shí)快速篩查和定量測定22種非法添加化合物，為監(jiān)管部門打擊保健食品非法添加行為提供新的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品來源：48批次改善胃腸道功能類保健食品（25批次片劑和23批次口服液）樣品均采購于本地市場。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：奧美拉唑（批號：100367-201706）、丙谷胺（批號：100176-201104）、法莫替丁（批號：100305-201304）、甲氧氯普胺（批號：100832-201404）、拉呋替?。ㄅ枺?00861-201302）、蘭索拉唑（批號：100709-201705）、雷貝拉唑鈉（批號：100658-201705）、鹽酸雷尼替丁（批號：100163-201607）、鹽酸洛哌丁胺（批號：100300-201102）、枸櫞酸莫沙必利（批號：100656-201903）、尼扎替丁（批號：100853-201502）、泮托拉唑鈉（批號：100575-201505）、馬來酸曲美布?。ㄅ枺?00580-201302）、硫酸天仙子胺（批號：111982-202002）、西咪替?。ㄅ枺?00158-201406）、鹽酸伊托必利（批號：100939-201803）均購于中國食品藥品檢定研究院；比沙可啶（批號：D0015778）購于北京曼哈格生物科技有限公司；多潘立酮（批號：21040678）購于壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；地芬諾酯鹽酸鹽（批號：S086173）、雙醋酚?。ㄅ枺篠066495）、脫乙酰比沙可啶（批號：S079839）、西沙必利（批號：S039819）購于天津阿爾塔科技有限公司。其中天津阿爾塔科技有限公司4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為液體，含量均為100 μg/mL，規(guī)格≥1 mL；其余標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為固體，純度≥94.2%。

主要試劑：甲醇、乙腈（色譜純），Merck德國；甲酸（色譜純），Sigma美國；超純水（電阻率 18.2 MΩ·cm，25 ℃，超純水機(jī)制得）。

主要儀器設(shè)備：Vanquish超高效液相色譜-Q ExactiveTMPlus組合型四極桿/軌道肼高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Fisher，美國）；ME203、XPE205DR電子天平（Mettler Toledo，瑞士）；3-30K高速冷凍離心機(jī)（Sigma德國）；KQ-500 TDB溫控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q IQ 7000超純水機(jī)（Millipore美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

18種固體混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液的配制：精密稱取比沙可啶、多潘立酮、奧美拉唑、丙谷胺、法莫替丁、甲氧氯普胺、拉呋替丁、蘭索拉唑、雷貝拉唑鈉、鹽酸雷尼替丁、鹽酸洛哌丁胺、枸櫞酸莫沙必利、尼扎替丁、泮托拉唑鈉、馬來酸曲美布汀、硫酸天仙子胺、西咪替丁、鹽酸伊托必利18種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用甲醇溶解并稀釋，制成濃度為1 000 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液。

22種混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液的配制：精密移取上述18種固體混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液100 μL和地芬諾酯鹽酸鹽、雙醋酚丁、脫乙酰比沙可啶、西沙必利四種液體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各1.0 mL，用甲醇稀釋制成濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液。置于-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品前處理

片劑樣品：取20片以上的片劑樣品，經(jīng)制樣機(jī)打碎，研磨成粉，混勻，備用；口服液樣品：混勻后備用。

準(zhǔn)確稱取保健食品試樣1.0 g（精確至0.01 g），置于15 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋振蕩10 min，超聲提取10 min，放冷至室溫，8 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后供上機(jī)測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（2.1 mm ×50 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流量：0.3 mL/min；流動(dòng)相：φ=0.1%甲酸水（A）和甲醇（B）；梯度洗脫程序：0.0~1.5 min，10% B；1.5~2.5 min，10%~95% B；2.5~6.0 min，95% B；6.0~6.5 min，95%~10% B；6.5~10.0 min，10% B。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正離子掃描；掃描方式：Full MS/dd-MS2（一級全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級掃描）；噴霧電壓：3.0 kV；S-lensRF電壓：60 V；毛細(xì)管溫度：325 ℃；輔助氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：40 Arb；輔助氣流速：10 Arb。Full MS（一級質(zhì)譜全掃描）分辨率：70 000 FWHM，質(zhì)譜掃描范圍：200~500m/z，AGC target（自動(dòng)增益控制）：1.0 e5，IT（最大注入時(shí)間）：50 ms；dd-MS2（數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描）分辨率：17 500 FWHM，AGC target：5.0 e4，IT：50 ms，Isolation window（分離窗口）：4.0m/z，Intesity threshold（強(qiáng)度閾值）：1.6 e5，同位素排除：on，動(dòng)態(tài)排除：10.0 s。22種化合物的NCE（步進(jìn)歸一化碰撞能量）統(tǒng)一設(shè)為30、50和70 eV。22種化合物的一級質(zhì)譜信息及二級質(zhì)譜信息見表1。

表1 22種化合物質(zhì)譜信息Table 1 Mass parameters for the 22 kinds of compounds

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

通過高效液相色譜分離和質(zhì)譜Full MS/dd-MS2的數(shù)據(jù)采集得到22種化合物的保留時(shí)間、一級母離子和自動(dòng)觸發(fā)采集的二級碎片離子信息，建立數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行高通量定性篩查；以一級母離子進(jìn)行定量分析，用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中化合物對應(yīng)的含量，從而進(jìn)行方法學(xué)的考察。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇、乙腈、甲醇/水（50:50，V/V）和乙腈/水（50:50，V/V）對兩種基質(zhì)（片劑和口服液）的改善胃腸道功能類保健食品中非法添加化合物的提取效率（除提取溶劑外其它步驟同 1.2.2），以加標(biāo)回收的結(jié)果對比不同溶劑的提取效率。結(jié)果表明甲醇/水、乙腈/水作為提取溶劑時(shí)奧美拉唑和雷貝拉唑鈉的回收率明顯低于甲醇或乙腈作為提取溶劑時(shí)的回收率，乙腈作為提取溶劑時(shí)法莫替丁和西咪替丁的回收率明顯低于甲醇作為提取溶劑時(shí)的回收率。而甲醇作為提取溶劑時(shí)，22種化合物在片劑基質(zhì)和口服液基質(zhì)中的回收率分別為81.52%~109.35%和82.13%~114.24%，均能達(dá)到較好的提取效率，因此選用甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 提取體積的確定

本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取體積（5、10、20 mL）對提取效率的影響，以加標(biāo)回收率比較不同提取體積的提取效率（除提取體積外其它步驟同 1.2.2）。結(jié)果表明提取體積為5 mL時(shí)，雷貝拉唑鈉在片劑基質(zhì)和口服液基質(zhì)中回收率分別為46.53%、59.31%，原因可能為基質(zhì)復(fù)雜，干擾雜質(zhì)濃度較高，存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。當(dāng)甲醇提取體積為10 mL時(shí)，雷貝拉唑鈉的回收率明顯升高。其在片劑基質(zhì)和口服液基質(zhì)中回收率分別達(dá)到為81.91%、83.06%，其他21種化合物在片劑基質(zhì)和口服液基質(zhì)中的回收率分別為 81.65%~113.85%、80.31%~ 107.11%。提取體積為20 mL時(shí)，22種化合物的回收率和提取體積為10 mL時(shí)基本一致，考慮到節(jié)約試劑成本，實(shí)驗(yàn)選擇甲醇提取體積為10 mL。

2.1.3 提取時(shí)間的確定

考慮到部分樣品為片劑，為了保證樣品分散均勻，實(shí)驗(yàn)考察了渦旋振蕩和超聲提取兩種提取方式同時(shí)作用的提取效率，實(shí)驗(yàn)分別以渦旋振蕩10 min與超聲提取10、20、30 min，渦旋振蕩10、20、30 min與超聲提取10 min進(jìn)行兩種提取方式的優(yōu)化（除提取時(shí)間外其它步驟同1.2.2）。結(jié)果表明，渦旋振蕩10 min和超聲提取10 min，22種化合物在片劑基質(zhì)和口服液基質(zhì)中的回收率分別為80.13%~118.08%、82.67%~111.02%，延長渦旋振蕩或超聲提取的時(shí)間，回收率變化不大，實(shí)驗(yàn)最終采用提取時(shí)間為渦旋振蕩10 min，超聲提取10 min的前處理方法。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于質(zhì)譜掃描模式均為正離子模式，所以流動(dòng)相選取0.1%甲酸水作為水相，甲醇和乙腈分別作為有機(jī)相進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇作為有機(jī)相時(shí)得到的峰形更加尖銳，分離度更高，而且能在更短的時(shí)間內(nèi)使22種化合物得到良好的基線分離。因此，實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸水和甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。22種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 ng/mL）的提取離子流色譜圖見圖1。實(shí)驗(yàn)采用常見的C18色譜柱，同時(shí)考察了Agilent XDB C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Waters BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）兩個(gè)不同品牌的C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)二者沒有顯著性差異。

圖1 22種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the mixed standard solution of 22 kinds of compounds

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù) 22種化合物分子量設(shè)定質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍（200m/z~500m/z），使用Full MS/dd-MS2模式，首先進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，發(fā)現(xiàn)母離子后達(dá)到自動(dòng)增益控制強(qiáng)度則自動(dòng)觸發(fā)二級質(zhì)譜掃描，在得到精確的一級母離子質(zhì)量數(shù)的同時(shí)，還可以得到二級子離子的全掃描信息。分辨率和自動(dòng)增益控制設(shè)置越高，得到的質(zhì)量數(shù)精度越高，但同時(shí)會(huì)降低儀器的靈敏度和掃描速度，同樣的時(shí)間采集數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)減少，定量的準(zhǔn)確性會(huì)受到影響，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，最終選擇一級質(zhì)譜掃描分辨率為70 000 FWHM，自動(dòng)增益控制為1.0 e5，二級質(zhì)譜掃描分辨率為17 500 FWHM，自動(dòng)增益控制為5.0 e4，既能滿足實(shí)驗(yàn)所需的靈敏度，也能達(dá)到與高效液相色譜分離相匹配的掃描速度，一個(gè)掃描循環(huán)的時(shí)間約為0.8 s，掃描點(diǎn)數(shù)也能滿足篩查與定量分析要求，實(shí)驗(yàn)得到22種化合物的相對質(zhì)量偏差均小于1.77×10-6（見表1），準(zhǔn)確度也滿足實(shí)驗(yàn)需要。高通量篩查時(shí)，不同化合物的性質(zhì)差異使得它們在分子斷裂時(shí)所需要的碰撞能量不盡相同，設(shè)置不同的歸一化碰撞能量，可以有效的解決由于碰撞能量不合適帶來的二級碎片離子信號低的問題，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一設(shè)為30、50和70 eV，在三個(gè)不同能量下疊加二級碎片離子的信息，靈敏度能夠滿足分析要求，對目標(biāo)化合物的定性更加準(zhǔn)確。

2.4 陰性干擾試驗(yàn)

取陰性樣品，按照 1.2.2制備陰性樣品溶液，在1.2.3和1.2.4的色譜及質(zhì)譜條件下上機(jī)測定，提取離子流色譜圖，22種化合物保留時(shí)間處均沒有出現(xiàn)干擾峰，說明本方法基質(zhì)干擾小，方法專屬性強(qiáng)，考慮到操作方便，在配制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)使用純?nèi)軇┡渲啤?/p>

2.5 方法學(xué)的考察

2.5.1 定量限

高分辨質(zhì)譜使用目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)提取離子流，非目標(biāo)物的干擾小，色譜圖基線噪音很低，信噪比往往非常大，不太適用以 3倍信噪比（S/N）確定目標(biāo)物檢出限，10倍信噪比確定目標(biāo)物定量限的方法。因此，本實(shí)驗(yàn)采用向空白樣品中逐級降低加標(biāo)濃度，按照1.2.2的前處理方式，以22種目標(biāo)化合物的回收率均滿足60%~120%區(qū)間內(nèi)的最低濃度為定量限，22種化合物定量限均為50 μg/kg（見表2）。

2.5.2 線性范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線

用甲醇稀釋1.2.1配制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液，得到濃度為5、10、20、50、100、200、300、400、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)行上機(jī)測定，以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的一級母離子的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，得到相關(guān)系數(shù)（r2），見表2。結(jié)果表明，22種化合物在5 ng/mL~500 ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2均＞0.995。說明本方法可以在此線性范圍內(nèi)準(zhǔn)確定量各目標(biāo)化合物。

表2 22種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 2 The linear equation, correlation coefficient and limit of quantitation of the 22 kinds of compounds

2.5.3 回收率、準(zhǔn)確度與精密度

取片劑和口服液兩種基質(zhì)改善胃腸道功能類保健食品陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別添加100 μg/kg、500 μg/kg、1 000 μg/kg三個(gè)濃度水平，按照1.2.2前處理方法制備樣品加標(biāo)溶液，每個(gè)添加水平平行制備6份樣品，上機(jī)進(jìn)行測定，得到22種化合物的峰面積，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），回收率用于評價(jià)準(zhǔn)確度，RSD值用于評價(jià)精密度，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，片劑基質(zhì)中 22種化合物的回收率在 82.11%~116.16%之間，RSD在0.60%~8.62%之間。口服液基質(zhì)中22種化合物的回收率在83.64%~117.21%之間，RSD在0.86%~9.36%之間。表明22種化合物在兩種基質(zhì)中的回收率高，準(zhǔn)確度高，精密度好。

表3 22種化合物在片劑和口服液樣品中的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSD) of the 22 kinds of compounds in tablet and liquid form (n=6)

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性

取片劑和口服液兩種基質(zhì)改善胃腸道功能類的保健食品陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。添加水平為1 000 μg/kg，按照1.2.2前處理方法制備樣品加標(biāo)溶液。將基質(zhì)加標(biāo)溶液和相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng/mL）分別進(jìn)樣，得到峰面積，計(jì)算響應(yīng)百分比，即為基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明2種基質(zhì)中22種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均在88.6%~112.5%之間，表明兩種基質(zhì)對22種化合物的基質(zhì)影響較小。

將基質(zhì)加標(biāo)溶液分別在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h的時(shí)間進(jìn)樣，得到22種化合物的峰面積，計(jì)算回收率，考察穩(wěn)定性。結(jié)果表明在24小時(shí)內(nèi)，2種基質(zhì)中22種化合物的添加回收率在90.2%~113.9%之間，隨時(shí)間變化小，表明加標(biāo)提取溶液的穩(wěn)定性良好。

2.6 數(shù)據(jù)庫的建立

按照1.2.3和1.2.4的實(shí)驗(yàn)條件，分別對22種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，得到保留時(shí)間、一級母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和二級碎片離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)，導(dǎo)入TraceFinder軟件，建立22種化合物的定性快速篩查數(shù)據(jù)庫。若樣品中檢測出的某種物質(zhì)保留時(shí)間、一級母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和二級碎片離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)均與已建立的數(shù)據(jù)庫中的化合物信息相匹配，可以初步認(rèn)定樣品中檢出該化合物?？梢赃M(jìn)一步用該化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同條件下得到保留時(shí)間和一級母離子的峰面積確證和定量分析，從而實(shí)現(xiàn)改善胃腸道功能類保健食品中 22種非法添加化合物的快速篩查和定量檢測。

2.7 實(shí)際樣品的測定

按照1.2.2前處理方法和1.2.3與1.2.4的儀器方法對48批次改善胃腸道功能類保健食品（25批片劑和23批口服液）進(jìn)行測定，經(jīng)過與建立的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，篩查出其中3批樣品檢出馬來酸曲美布汀，1批樣品檢出多潘立酮。經(jīng)定量計(jì)算，馬來酸曲美布汀檢出值分別為 3.02×103μg/kg、1.62×103μg/kg 和0.43×103μg/kg；多潘立酮檢出值為 1.59×103μg/kg。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法，可以快速篩查同時(shí)定量分析片劑和口服液兩種基質(zhì)的改善胃腸道功能類保健食品中非法添加化合物。依據(jù)保留時(shí)間、一級母離子精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片離子精確質(zhì)量數(shù)建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行快速定性篩查，一級母離子進(jìn)行定量分析。該方法操作簡單快速，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于改善胃腸道功能類保健食品中非法添加化合物的快速篩查和定量分析，為監(jiān)管部門打擊保健食品非法添加行為提供了新的技術(shù)支撐。