徐國棟，安玥琦,2，熊善柏,2，尹濤,2，覃鳳陽，陳萍，尤娟,2*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北武漢 430070）（2.長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，湖北武漢 430070）

當前，居民飲食消費不斷升級，新零售、新餐飲經(jīng)濟模式迅猛發(fā)展，我國預制調(diào)理食品行業(yè)處于快速增長階段[1]。由于疫情期間“到家經(jīng)濟”的助推，消費者主動購買預制食品的意愿大幅提高，更進一步推動行業(yè)發(fā)展。我國水產(chǎn)資源豐富[2]，將水產(chǎn)魚類等經(jīng)過簡單預處理做成調(diào)理水產(chǎn)品，對于水產(chǎn)品行業(yè)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。但是由于大部分的調(diào)理水產(chǎn)品為半成品，采用傳統(tǒng)的熱處理使產(chǎn)品達到商業(yè)無菌要求，無法保證其感官與營養(yǎng)品質(zhì)[3]，且處理后常在低溫下進行貯藏、銷售以保持產(chǎn)品新鮮口感和質(zhì)地，因此特別容易受到微生物污染[4]，造成產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)。這將給調(diào)理水產(chǎn)品的品質(zhì)保持、質(zhì)量安全、貯藏穩(wěn)定性帶來挑戰(zhàn)。

臭氧是一種環(huán)境友好型的非熱殺菌技術(shù)。臭氧及其分解產(chǎn)物（超氧自由基、羥基自由基等）氧化破壞微生物細胞膜組分（蛋白、呼吸酶、不飽和脂肪酸）、細胞壁（肽聚糖）、細胞質(zhì)（酶、核酸）、孢子外殼和病毒衣殼，從而對各類微生物均具有殺滅作用[5]，且適量的臭氧處理對產(chǎn)品的品質(zhì)影響小[3]，特別適用于調(diào)理水產(chǎn)品的殺菌保鮮。目前，臭氧水在水產(chǎn)品應(yīng)用方面的研究主要集中在兩個方面，一方面是研究臭氧水處理條件對水產(chǎn)品殺菌效果的影響，方敏等[6]研究臭氧水處理方式對鯽魚體表殺菌效果的影響，結(jié)果顯示臭氧水沖洗方式殺菌效果最好，其次是流水浸漬，靜水浸漬最差。Silva等[7]研究臭氧水濃度和時間對羅非魚減菌效果的影響，結(jié)果表明1.5 mg/L的臭氧水處理羅非魚片15 min，減菌率達88.25%。臭氧對微生物滅活的同時，亦可能會造成蛋白變性[8]、脂肪氧化[9]等問題，因此另一個方面是研究臭氧水處理條件對產(chǎn)品品質(zhì)的影響。張紅杰等[10]研究臭氧水處理對羅非魚片品質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)臭氧水處理提高了羅非魚片亮度，改善了羅非魚片的硬度和咀嚼性，但促進了貯藏過程中蛋白質(zhì)的變性和脂肪氧化。Zhang等[11]研究臭氧水處理對鳙魚中土腥素去除及理化品質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)臭氧水處理可有效去除鳙魚中土腥素，提高鹽溶性蛋白，Ca2+-ATPase酶活性，且對過氧化值、TBA值改變不大。調(diào)理食品不同于傳統(tǒng)包裝加工食品，在穩(wěn)定貯藏環(huán)境下貨架期是恒定的[12]。不同來源的水產(chǎn)品加工成的調(diào)理水產(chǎn)品會由于初始菌相不同，導致在貯藏期間微生物的消長以及品質(zhì)變化存在差異，最終致使貯藏時貨架期終點不一致，給調(diào)理水產(chǎn)品的貯藏銷售帶來困難。目前研究表明，臭氧水處理可顯著降低食品中微生物的種類和數(shù)量，從而可能將不同來源水產(chǎn)品菌相變得相似。因此研究臭氧水處理對水產(chǎn)品菌相影響尤為重要，但是目前研究較少。

已有研究者采用傳統(tǒng)分離鑒定技術(shù)[13]及PCR-DGGE技術(shù)[14]研究臭氧水處理對牡蠣、鱈魚片菌群結(jié)構(gòu)的影響，但是均未采用高通量測序技術(shù)對臭氧水處理水產(chǎn)品的微生物群落結(jié)構(gòu)進行較全面研究。本文以草魚片為研究對象，采用高通量測序技術(shù)研究臭氧水處理方式對草魚片菌群結(jié)構(gòu)的影響及臭氧水處理對冷藏草魚片微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，分析臭氧水處理對草魚片細菌群落組成和多樣性的影響。以期進一步探究臭氧抑菌保鮮的機理，推進臭氧殺菌技術(shù)在生鮮調(diào)理水產(chǎn)品行業(yè)的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活草魚（質(zhì)量2.5~3 kg），購于菜市場，置于冰水中運至實驗室；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、硼酸、氯化鈉、甲基紅、溴甲基綠均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；DNA抽提試劑盒（E.Z.N.A.? Soil DNA Kit型），美國Omega Bio-Tek公司；瓊脂糖（biowest agArose型），西班牙 biowest公司；FastPfu Polymerase，中國TransGen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，美國 Axygen公司；建庫試劑盒（NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit型），美國Bioo Scientific公司；測序試劑盒（MiSeq Reagent Kit v3/NovaSeq Reagent Kits），美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AVANTI J-26XP型高速冷凍離心機，美國Beckman公司；IKA2000型高速分散均質(zhì)機，德國IKA公司；FOSS kjeltec8400型自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司。HD-1360型水平流超凈工作臺，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。GCQJ-1-3型電解式高濃度臭氧氣機，武漢威蒙環(huán)?？萍加邢薰?；SHP-350型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；NanoDrop2000型超微量分光光度計，美國 Thermo Fisher Scientific公司；Quantus?型微型熒光儀，美國Promega公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp?9700型PCR儀，美國ABI公司；Illumina Miseq型測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

草魚擊頭致死，去除鱗片和內(nèi)臟，清水洗凈后置于消毒過的案板上，用無菌刀取其背部兩側(cè)魚肉去皮，用自來水沖洗30 s，轉(zhuǎn)入超凈工作臺切成5 cm×5 cm×2 cm左右的魚片。將魚片隨機分為3組，一組未做處理（CK組），另兩組分別用0.85 mg/L[15]的臭氧水浸泡10 min（CYJP組）和沖淋10 min（CYCL組），各組處理后在超凈工作臺瀝干水分裝于無菌均質(zhì)袋（每組分裝9袋，每袋8個魚片），隨機取各組3袋魚片（3個平行）進行各項指標的測定（每袋中三個魚片用于感官評價，兩個魚片用于菌落總數(shù)測定，兩個魚片用于TVB-N的測定，一個魚片-80 ℃凍藏用于高通量測序），其余置于25 ℃培養(yǎng)箱貯藏。每隔1 d隨機取各組3袋魚片進行指標的檢測。取各組凍存腐敗樣品以及新鮮魚肉樣品進行基于細菌16S rRNA高通量測序。

按上述方法制作魚片?；靹蚝髮Ⅳ~片分成兩組。一組用0.85 mg/L臭氧水沖淋10 min（A組），一組用清水沖淋10 min（B組）做對照，處理后在超凈工作臺瀝干水分。將A組和B組魚片分裝于無菌均質(zhì)袋中（A組60袋、B組60袋，每袋4個魚片）。隨機取A、B組草魚片各36袋置于4 ℃恒溫箱中貯藏，分別為4 ℃-A組、4 ℃-B組；取A、B組草魚片各24袋置于10 ℃的恒溫箱中貯藏，分別為10 ℃-A組、10 ℃-B組。每隔一天隨機取出3袋（三個平行）進行感官評價（每袋三片魚片用于感官評價，一片魚片凍藏用于高通量測序）取臭氧處理后達到感官拒絕點的草魚片進行基于細菌16S rRNA的高通量測序，4 ℃貯藏兩組腐敗草魚片分別為4-9-A、4-9-B組，10 ℃貯藏兩組腐敗草魚片分別為10-5-A組、10-5-B組。

1.3.2 感官評價

參考GB 2733-2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產(chǎn)品》并結(jié)合黃淵等[16]的方法對草魚片進行感官評價，評定小組由15名食品科學專業(yè)碩士生組成，分別從色澤、氣味、肌肉形態(tài)、肌肉彈性4個方面進行打分，每項總分均為5分，以3分作為可接受度臨界值。評分標準見表1，感官總分=色澤得分+氣味得分+肌肉形態(tài)得分+肌肉彈性得分。感官總分低于 12分時表明樣品不可接受。

表1 草魚片感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of grass carp slices

1.3.3 總揮發(fā)性鹽基氮的測定

參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[17]自動凱氏定氮儀法測定樣品TVB-N含量。稱取打碎的魚肉樣品10 g于蒸餾管內(nèi)，加入75 mL水，振搖，使試樣在樣液中分散均勻，浸漬30 min后加入1 g氧化酶和2 mL消泡劑，立刻連接到蒸餾器上，按照儀器設(shè)定的條件（標準滴定酸濃度0.10 mol/L；加堿、加水體積為0 mL；硼酸＋指示劑接收液30 mL；蒸餾時間180 s）和儀器操作說明書開始測定。

1.3.4 菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[18]進行菌落總數(shù)測定。無菌條件下取魚肉樣品 25 g于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min，制成1:10的樣品勻液，取制得的拍打上清液（1 mL）用生理鹽水連續(xù)10倍梯度稀釋，選擇3個適當?shù)南♂尪龋瑢⑾♂屢海? mL）轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，每個稀釋度做 2個平皿。然后及時將冷卻至適宜溫度的平板計數(shù)培養(yǎng)基（滅菌后，放置于（46±1）℃水浴中保溫）注入培養(yǎng)皿，約15 mL，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿混合均勻，同時培養(yǎng)基傾入加有1 mL稀釋液滅茵培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。待瓊脂凝固后，倒置平板，在 30 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)（72±3）h。選取菌落數(shù)在30 CFU~300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)。

1.3.5 高通量測序

1.3.5.1 DNA抽提和PCR擴增

根據(jù) E.Z.N.A.? soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行微生物群落總DNA抽提，使用m=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度；使用 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s），然后 72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存。PCR反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfuDNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補足至20 μL。每個樣本3個重復。

1.3.5.2 Illumina Miseq測序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus? Fluorometer對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：（1）接頭鏈接；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用 PCR擴增進行文庫模板的富集；（4）磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

理化部分實驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 22.0進行處理，采用OriginLab Origin 9.0進行作圖，實驗結(jié)果顯示為平均值±SD，顯著性差異采用Duncan模型進行比較檢驗分析。高通量測序部分實驗使用fastp（https://github.com/ OpenGene/fastp, version 0.20.0）軟件對原始測序序列進行質(zhì)控；使用FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）軟件進行拼接；使用UPARSE 軟件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1），根據(jù)97%[19,20]的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫（v138），設(shè)置比對閾值為70%。

2 結(jié)果與討論

2.1 臭氧水處理方式對草魚片微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 貨架期終點的判定

圖1顯示的是不同臭氧水處理方式對常溫貯藏草魚片品質(zhì)的影響。由圖1a、1b、1c可以看出，3組草魚片在第0天，感官得分、TVB-N值均無顯著性差異（p＞0.05），但 CYJP組、CYCL組草魚片菌落總數(shù)顯著低于對照組。貯藏1 d后，各處理組菌落總數(shù)均超出食品微生物規(guī)范國際委員會[21]規(guī)定的限量值7.00 lg CFU/g，但此時CYCL、CYJP組草魚片感官得分仍顯著高于CK組草魚片（p＜0.05），TVB-N值顯著低于 CK組草魚片（p＜0.05），微生物指標與感官指標、化學指標之間存在差異的主要原因是魚肉中部分微生物沒有或者僅具有較小的致腐能力[22]，因此盡管魚肉微生物數(shù)量達到7.0 lg CFU/g，但其感官品質(zhì)仍可接受，TVB-N值仍未超標。并且此時CK組草魚片出現(xiàn)明顯的腥臭味，感官上已無法接受，且 TVB-N值達到20.48 mg/100 g，超出我國GB 2733-2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產(chǎn)品》規(guī)定的限值（20 mg/100 g）。貯藏2 d后，雖然CYCL組草魚片感官得分仍顯著高于其它兩組（p＜0.05），TVB-N值顯著低于其它兩組（p＜0.05），但此時各處理組草魚片均肌肉組織松散，色澤暗淡，有強烈的腥臭味，且草魚片 TVB-N值皆超出國標規(guī)定的限值，均已腐敗。綜合各處理組感官得分、TVB-N值的變化以及菌落總數(shù)變化，結(jié)果表明常溫貯藏1 d后3組處理草魚片均已到達貨架期終點。

圖1 臭氧水處理方式對常溫貯藏草魚片品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of ozonated water treatment methods on the quality of grass carp slices stored at room temperature

2.1.2 菌群多樣性分析

用于測序的4組樣品共獲得優(yōu)化序列182 930，平均序列長度449 bp。Coverage指數(shù)是樣品的測序深度也表明測序?qū)悠返母采w率。4組樣品的Coverage值均在0.99以上，表明樣品達到足夠的測序深度，且序列未被檢測到的可能性較低，用于后續(xù)的分析結(jié)果可信。α多樣性指數(shù)包括 Shannon、Simpson、Chao1、ACE指數(shù)。其中Shannon指數(shù)越大表明樣品的群落多樣性越高，Simpson指數(shù)越大，表明群落多樣性越低，ACE、Chao1指數(shù)越大表明樣品的群落物種豐富度越高。各處理組α多樣性指數(shù)值的大小由表2所示。綜合各α指數(shù)值大小可知，對照組新鮮草魚片微生物群落多樣性高于各組腐敗草魚片微生物群落多樣性，CYCL組、CYJP組腐敗草魚片群落多樣性低于CK組腐敗草魚片微生物群落多樣性。這可能是由于魚類在貯藏至腐敗過程中，不同菌種之間相互競爭，初始豐度較低的菌種以及競爭能力弱的菌種逐漸消亡，優(yōu)勢菌群最終占據(jù)主導地位，致使腐敗魚類的菌群多樣性減少[23]。而草魚片經(jīng)臭氧處理后，不耐受臭氧的微生物均被殺死，腐敗菌相是臭氧以及貯藏條件共同選擇的結(jié)果，因而菌群構(gòu)成更簡單，多樣性降低。

表2 不同處理組草魚片的測序信息及α多樣性指數(shù)Table 2 Sequencing information and alpha diversity index of grass carp fillets in different treatment groups

2.1.3 菌群構(gòu)成分析

圖2顯示的是門水平（a）和科水平（b）上的不同處理組草魚片細菌相對豐度，統(tǒng)計分析時將相對豐度＜1%的物種歸為others。由圖2a可知，與CK組腐敗草魚片相比，CYCL、CYJP組腐敗草魚片中厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度增大，其它菌門均減少，表明臭氧水處理抑制了常溫貯藏草魚片中除厚壁菌門外其它菌門的生長繁殖。由圖2b可知，CK組新鮮草魚片菌群主要由葡萄球菌科（Staphylococcaceae）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、鏈球菌科（Streptococcaceae）等微生物構(gòu)成。Zhang等[24]在新鮮草魚片中發(fā)現(xiàn)莫拉氏菌科、鏈球菌科是其主要細菌科，藍蔚青等[25]在鯧魚中發(fā)現(xiàn)葡萄球菌科微生物是新鮮鯧魚塊的主要優(yōu)勢菌。與CK_1D組腐敗草魚片相比，CYJP組、CYCL組腐敗草魚片菌群構(gòu)成中葡萄球菌科、莫拉氏菌科和鏈球菌科的微生物相對豐度大于 90%，占有絕對優(yōu)勢，其它類菌群占比少，這與上述菌群α多樣性分析結(jié)果一致，即臭氧水處理降低草魚片菌群多樣性，并且臭氧水處理組中鏈球菌科、氣單胞菌科微生物相對豐度下降明顯，表明臭氧水處理可以有效抑制常溫貯藏草魚片中鏈球菌科、氣單胞菌科微生物的生長繁殖。顧衛(wèi)瑞[26]采用傳統(tǒng)分離鑒定方法，發(fā)現(xiàn)臭氧可以有效殺滅氣單胞菌屬（Aeromonas）的細菌。張清平等[27]在流動殺菌實驗中發(fā)現(xiàn)臭氧水對糞鏈球菌的殺菌率在 99.99%。

圖2 門水平（a）和科水平（b）上的草魚片細菌相對豐度分析Fig.2 Analysis of relative abundance of bacteria in grass carp fillets at the phylum level (a) and family level (b)

2.1.4 菌群構(gòu)成差異分析

圖3是不同處理組草魚片在分類學屬水平上相對豐度排名前50的物種組成熱圖。群落熱圖可將高豐度和低豐度菌群分塊展示，通過顏色變化來反映不同分組在各分類學水平上群落組成的相似性和差異性。橫向聚類上兩樣本越近，表示兩樣本中各物種變化趨勢越相似。從相對豐度來看，CK_0D組新鮮草魚片各類菌屬在熱圖中顏色的對比沒有各組腐敗草魚片中各類菌屬顏色對比明顯，說明新鮮草魚片的微生物群落構(gòu)成更加均勻。從橫向聚類來看，CYJP組和CYCL組腐敗草魚片微生物群落組成相似度高于其它各組，表明草魚片經(jīng)臭氧處理后，菌群結(jié)構(gòu)相似性提高。吳永祥等[28]采用超高壓技術(shù)處理臭鱖魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超高壓處理對臭鱖魚的菌相組成影響顯著，其能使微生物組成類型明顯減少，漫游球菌屬（Vagococcus）和冷桿菌屬（Psychrobacter）為超高壓處理后的優(yōu)勢腐敗菌。這說明貯藏前采用非熱殺菌技術(shù)對不同來源的水產(chǎn)品進行處理，有可能將水產(chǎn)品的初始菌相變得簡單，以控制不同來源的水產(chǎn)品加工成的調(diào)理水產(chǎn)食品的貯藏穩(wěn)定性。

圖3 屬水平上草魚片的細菌物種組成熱圖Fig.3 Heat map of bacterial species composition of grass carp fillets at the genus level

為進一步比較分析臭氧浸泡處理和臭氧沖淋處理草魚片微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異，對CYJP組和CYCL組腐敗草魚片中細菌相對豐度排名前十的菌屬進行顯著性檢驗。由圖4可知，CYJP組、CYCL組腐敗草魚片在相對豐度排名前十的菌屬中均存在顯著性差異。特別是在主要的優(yōu)勢菌群葡萄球菌屬、乳球菌屬、不動桿菌屬的相對豐度上。表明臭氧水沖淋、浸泡處理對草魚片菌群結(jié)構(gòu)影響不同。這可能是由于臭氧作用過程易分解，臭氧水沖淋處理可連續(xù)提供新鮮臭氧且起到?jīng)_洗減菌作用，而與臭氧水浸泡處理具有不同的殺菌效果，方敏等[6]研究臭氧水處理方式對鯽魚體表殺菌效果的影響，結(jié)果顯示臭氧水沖洗方式殺菌效果最好，其次是流水浸漬。Chawla等[29]研究噴霧處理和浸泡處理對去皮蝦肉的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對其具有不同的殺菌效果。

臭氧水沖淋處理草魚片可達到更高的減菌率，且對草魚片感官品質(zhì)的保持效果好。不同的臭氧水處理方式對草魚片菌群結(jié)構(gòu)具有顯著差異，這種差異可能會對草魚片后續(xù)品質(zhì)保持、貯藏穩(wěn)定性有很大的影響。通過分析不同臭氧處理方式對貯藏草魚片品質(zhì)及菌相的影響，明確后續(xù)采用臭氧水沖淋處理草魚片，研究臭氧水處理對冷藏草魚片腐敗菌相的影響。

2.2 臭氧水處理對冷藏草魚片微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 腐敗終點的判定4天，感官得分降低到12分以下，到達感官拒絕點。綜上，臭氧水處理后草魚片4 ℃下貯藏，可延緩感官品質(zhì)劣變3 d。臭氧水處理后草魚片10 ℃下貯藏，可延緩感官品質(zhì)劣變1 d。已有研究者應(yīng)用臭氧水對羅非魚[31]和鱈魚[32]進行處理，均發(fā)現(xiàn)可有效延緩品質(zhì)劣變，延長貨架期。

Gram 等[30]指出雖然微生物在食品腐敗過程中發(fā)揮重要作用，但食品腐敗（即貨架期終點）的界定主要取決于感官評價。不同處理組草魚片在冷藏時引起感官品質(zhì)的變化如圖5所示。由圖5可以看出，隨著冷藏時間的延長，臭氧水未處理組和臭氧水處理組的草魚片感官品質(zhì)均不斷下降，但臭氧水處理組（A組）品質(zhì)下降速度明顯慢于臭氧水未處理組（B組），表明臭氧水處理可以有效延緩草魚片感官品質(zhì)的下降。4 ℃、10 ℃下貯藏的各處理組草魚片在第0天感官得分均無顯著性差異（p＜0.05）。4 ℃下貯藏的A組和B組草魚片在第 3天感官品質(zhì)出現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），且分別在貯藏的第9天和第6天感官得分降低到12分以下，感官上已不可接受。10 ℃下貯藏的兩組草魚片，A組在貯藏第5天，B組在貯藏第

圖5 臭氧水處理對冷藏草魚片感官得分的影響Fig.5 Effect of ozonated water treatment on sensory scores of grass carp fillets during cold storage

2.2.2 菌群多樣性分析

表3是在Illumina Miseq?平臺上進行高通量測序的4組樣品的測序信息及α多樣性指數(shù)。4組樣品共獲得質(zhì)控后序列162 166，平均序列長度427 bp。在97%的序列相似度下，共獲得1067個OTU。4組樣品的Coverage指數(shù)值均在0.99以上，可用于后續(xù)分析。由表3可知，4 ℃、10 ℃下貯藏臭氧處理組腐敗草魚片Shannon指數(shù)均低于4 ℃、10 ℃下貯藏臭氧未處理組腐敗草魚片，Simpson指數(shù)大于4 ℃、10 ℃下貯藏臭氧未處理組腐敗草魚片，ACE、Chao1指數(shù)均大于4 ℃下和10 ℃下貯藏臭氧未處理組腐敗草魚片。綜合α多樣性分析結(jié)果，臭氧水處理降低草魚片微生物群落多樣性，而又保持其微生物群落物種豐富度，使冷藏草魚片中微生物群落結(jié)構(gòu)變得具有高豐富度而低均勻性。

表3 草魚片的測序信息及α多樣性指數(shù)Table 3 Sequencing information and application of grass carp fillets with different treatments α diversity index

2.2.3 菌群構(gòu)成分析

圖6顯示的是門水平（a）和科水平（b）上的不同處理組草魚片細菌相對豐度。由圖6a可知，4 ℃、10 ℃下貯藏臭氧處理組草魚片與臭氧未處理組草魚片相比，擬桿菌門、放線菌門相對豐度下降，表明臭氧水處理抑制了冷藏草魚片中擬桿菌門、放線菌門的生長繁殖。由圖6b可知。4 ℃、10 ℃下貯藏臭氧處理組和未處理組腐敗草魚片科水平上的菌群均主要由腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、鏈球菌科、李斯特菌科（Listeriaceae）、莫拉氏菌科微生物構(gòu)成，但兩組草魚片在主要菌群的相對豐度上存在較大差異。臭氧水處理對莫拉氏菌科微生物生長的抑制效果最為顯著，在4 ℃下貯藏臭氧處理后腐敗草魚片莫拉氏菌科微生物相對豐度從12.81%下降到3.54%，在10 ℃下貯藏臭氧處理后腐敗草魚片莫拉氏菌科微生物相對豐度從29.88%下降到8.19%。

圖6 門水平（a）和科水平（b）上的草魚片細菌相對豐度分析Fig.6 Analysis of relative abundance of bacteria in grass carp fillets at the phylum level (a) and family level (b)

2.2.4 菌群構(gòu)成差異分析

圖7是不同處理組草魚片在分類學屬水平上相對豐度排名前50的物種組成熱圖。從熱圖橫向聚類來看，不同冷藏溫度下貯藏的臭氧處理組與未處理組腐敗草魚片群落結(jié)構(gòu)更相似，表明相比于臭氧水處理對草魚片菌群結(jié)構(gòu)的改變，后續(xù)貯藏條件的改變對菌群結(jié)構(gòu)的影響更大。4 ℃、10 ℃下貯藏各組腐敗草魚片中主要優(yōu)勢菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）、沙雷氏菌屬（Serratia）、不動桿菌屬、乳球菌屬、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、布丘氏菌屬（Buttiauxella）。假單胞屬屬于假單胞菌科（Pseudomonadaceae），已有大量研究結(jié)果表明耐冷的假單胞菌屬微生物是冷藏水產(chǎn)品常見的特定腐敗菌[33]，布丘氏菌屬、沙雷氏菌屬屬于腸桿菌科，生活在受污染水域的水產(chǎn)品中腸桿菌科微生物檢出率高[34]，沙雷氏菌屬是肉產(chǎn)品的常見腐敗菌，多次在肉制品中被檢測到[35]。乳球菌屬屬于鏈球菌科，不動桿菌屬屬于莫拉氏菌科，環(huán)絲菌屬屬于李斯特菌科，皆是水產(chǎn)品中常見的微生物。

圖7 草魚片屬水平上的微生物群落組成熱圖Fig.7 Heat map of microbial community composition at the level of grass carp

為進一步比較不同冷藏溫度下臭氧處理組和未處理組腐敗草魚片微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異，對4 ℃、10 ℃下貯藏臭氧處理組和未處理組腐敗草魚片中相對豐度排名前 25的菌屬進行顯著性檢驗。結(jié)果如圖8a和圖8b所示，圖中標紅的菌種表示在兩組中具有顯著性差異（p＜0.05）。由圖8a可知，4 ℃貯藏臭氧處理組和未處理組腐敗草魚片在相對豐度占比前 25的菌屬中，22個在相對豐度上存在顯著性差異。臭氧處理后4 ℃貯藏至腐敗草魚片中不動桿菌屬、沙雷氏菌屬等微生物顯著減少，布丘氏菌屬、乳球菌屬、環(huán)絲菌屬等微生物顯著增加。由圖8b可知，10 ℃貯藏臭氧處理組和未處理組腐敗草魚片在相對豐度占比前 25的菌種中，24個存在顯著性差異，臭氧處理后10 ℃貯藏至腐敗草魚片中不動桿菌屬顯著減少（p＜0.05），沙雷氏菌屬、假單胞菌屬顯著等微生物顯著增加。表明臭氧處理顯著改變了貯藏草魚片的微生物群落結(jié)構(gòu)，特別對相對豐度高的優(yōu)勢菌群影響更顯著。

圖8 冷藏草魚片屬水平的菌群差異的顯著性檢驗Fig.8 Significant test of the difference of the bacterial community at the level of genus of chilled grass carp

3 結(jié)論

臭氧水沖淋處理草魚片可達到更高的減菌率，且對草魚片感官品質(zhì)的保持效果好。臭氧水沖淋處理、臭氧水浸泡處理均會改變草魚片菌群結(jié)構(gòu)，降低草魚片菌群多樣性，常溫下可有效抑制鏈球菌科、氣單胞菌科微生物生長繁殖。但不同的臭氧水處理方式對草魚片微生物菌群結(jié)構(gòu)具有顯著性差異，特別是在相對豐度高的優(yōu)勢菌葡萄球菌屬、乳球菌屬、不動桿菌屬相對豐度方面差異更顯著。草魚片經(jīng)臭氧水沖淋處理后在4 ℃、10 ℃下冷藏感官品質(zhì)的劣變均顯著減緩，且在門、科、屬水平上均可抑制部分相同微生物的生長繁殖，特別是不動桿菌屬微生物；但不同冷藏溫度仍會導致菌群結(jié)構(gòu)差異顯著。臭氧水處理對草魚片微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響研究可為臭氧殺菌技術(shù)在生鮮調(diào)理水產(chǎn)品行業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。