譚美，張靖旋，潘靖茹，孟梓怡，胡清心，林芷伊，王超，段翰英

（暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東廣州 510632）

草莓屬薔薇科植物，色澤鮮艷、口感鮮美，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中葉酸作為人體所必需的微量元素在草莓中含量尤其豐富[1]。葉酸是B族維生素中的一種，由于人體不能自我合成葉酸，因此食物是葉酸的唯一來源[2]。

葉酸穩(wěn)定性較差，在室溫中很容易氧化降解[3,4,5]。即使在4 ℃的貯藏環(huán)境中，草莓中的總?cè)~酸含量也會(huì)出現(xiàn)持續(xù)降低的情況[6]。葉酸在食物中主要以 5-甲基四氫葉酸形態(tài)存在，在食品體系中較為穩(wěn)定，并可以直接參與一碳代謝。除此之外還有5,10-亞甲基四氫葉酸、四氫葉酸以及降解產(chǎn)物或合成產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲酸[2]。其中四氫葉酸作為多谷氨?；淖钸m底物，是葉酸種類中最活潑的形式，在儲(chǔ)藏過程中極易發(fā)生降解，但研究發(fā)現(xiàn)四氫葉酸在人體中作用重大，可以減輕和改善慢性酒精病引起的肝損傷[7]。對(duì)氨基苯甲酸被稱為葉酸的合成前體和降解產(chǎn)物，分支酸在氨基脫氧分支酸合成酶的轉(zhuǎn)化下和氨基酸脫氧核苷酸的裂解酶的介導(dǎo)下生成對(duì)氨基苯甲酸，對(duì)氨基苯甲酸經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中進(jìn)行葉酸的生物合成。另外，葉酸降解，四氫葉酸和二氫葉酸可轉(zhuǎn)化成四氫蝶呤-6-醛、二氫蝶呤-6-醛以及對(duì)氨基苯甲酰谷氨酸片段[8]。

考慮到葉酸的損失大多數(shù)是因?yàn)樘烊蝗~酸本身發(fā)生了氧化反應(yīng)，相關(guān)研究已在食品系統(tǒng)中驗(yàn)證了抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）對(duì)5-甲基四氫葉酸的保護(hù)效果[9]。AsA是植物、動(dòng)物在正常生長(zhǎng)活動(dòng)中不可缺少的一種抗氧化劑。AsA不僅對(duì)機(jī)體內(nèi)的組織修補(bǔ)、脂肪與蛋白質(zhì)的合成等方面有所作用，還影響葉酸的吸收與代謝[10]。研究結(jié)果表明，在胡蘿卜汁中添加0.5 mg/g的AsA可以顯著降低葉酸在高溫和高壓條件下的降解[9]。草莓雖然富含AsA，可達(dá)0.447 mg/g[1]，但前期研究發(fā)現(xiàn)，草莓中的葉酸在儲(chǔ)存過程中也會(huì)逐漸降解，推測(cè)可能是草莓中的AsA含量不足以保護(hù)草莓中的葉酸，因此提高草莓中AsA的含量可能有助于葉酸穩(wěn)定性。

浸漬技術(shù)是擴(kuò)散和滲透相結(jié)合的過程，在食品中應(yīng)用可以增加食品的風(fēng)味、保護(hù)成色、增加食品的營(yíng)養(yǎng)成分等[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)0.1%的AsA浸漬可以有效保護(hù)花椰菜的新鮮度，延長(zhǎng)其貨架期[13]。經(jīng)過AsA浸漬處理的桃能夠在貯藏期間有效抑制病害的發(fā)生率[14]。Hironaka等[15]也報(bào)道稱真空浸漬可以提高馬鈴薯的 AsA含量。因此，采用浸漬是可以提高草莓中AsA含量的并對(duì)草莓的保鮮是有益的。

因此。本文采用真空浸漬和常壓浸漬的方法提高草莓中AsA的含量，探討兩種方法浸漬AsA的效果，以及真空浸漬 AsA對(duì)草莓中不同天然葉酸的穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)影響，為草莓保鮮及果蔬中葉酸穩(wěn)定性研究提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹東紅顏草莓購(gòu)自暨南大學(xué)興安超市；AsA、草酸、碘酸鉀、鹽酸、四氯化碳、醋酸銨、甲苯，天津市大茂化學(xué)試劑廠；大鼠血清，天津康源生物技術(shù)有限公司。

JJ5500型電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；UV-9600紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞麗分析儀器有限公司；封口機(jī)，得力集團(tuán)有限公司；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Eppendorf58048心機(jī)，德國(guó)Eppendorf艾本德公司；KDC-1044低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；勻漿機(jī)，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電磁爐，美的集團(tuán)股份有限公司；質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)博勒飛公司；超高效液相色譜儀-質(zhì)譜儀（Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS)、1290 Infinity Ⅱ-G6460C/SG，安捷倫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草莓浸漬處理

（1）常壓浸漬將草莓兩兩一組放入真空袋中，各加入150 mL的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的AsA溶液，用封口機(jī)將袋子封口。室溫、常壓下分別放置10、20、30、40、50、60 min，共6組草莓。浸漬后將草莓取出，蒸餾水清洗，待草莓表面水漬自然風(fēng)干后測(cè)定草莓的AsA含量。

（2）真空浸漬室溫下，在500 mL抽濾瓶中放入草莓，加入1%（m/m）的AsA溶液。使用循環(huán)水真空泵將瓶中空氣抽出，真空度達(dá)至0.09 MPa，草莓在此環(huán)境中浸泡10、20、30、40、50、60 min，共6組。浸漬后將草莓取出，蒸餾水清洗，待草莓表面水漬自然風(fēng)干后。測(cè)定AsA含量及質(zhì)構(gòu)。

（3）浸漬草莓冷藏將批量草莓分兩份，其中一份在真空度為0.09 MPa的環(huán)境中浸漬1%（m/m）的AsA溶液30 min，另一份不做任何處理作為對(duì)照組。將兩組草莓按照冷藏天數(shù)分裝在保鮮盒里，然后存放在4 ℃的冷庫(kù)中，存放時(shí)間為0、2、4、6、8 d，每隔兩天取出兩組草莓，測(cè)定質(zhì)構(gòu)并提取葉酸。

1.2.2 AsA含量的測(cè)定

參照李向榮等[16]的碘酸鉀萃取分光光度測(cè)定方法。稱取5 g草莓，加入等質(zhì)量2%的草酸，勻漿。使用 1%的草酸將勻漿液稀釋至 25 mL，離心 10 min（5 500 r/min）。取1 mL上清液于10 mL離心管中。在每支離心管中再加入 0.1 mol/L的碘酸鉀溶液和0.01 mol/L的鹽酸溶液各1 mL，最后加入5 mL的四氯化碳，震蕩 2 min，隨后靜置，分層。取上清液，以四氯化碳為空白對(duì)照，于520 nm處測(cè)定下層吸光度（可用紗布過濾絮狀沉淀）并記錄。

1.2.3 葉酸含量的測(cè)定

葉酸提取真空浸漬組和對(duì)照組稱取3份樣品，每份樣品20 g，切碎放入玻璃錐形瓶，加入50 mL醋酸銨緩沖溶液（0.05 mol/L），勻漿，沸水浴10 min，冰浴至室溫，加入3~4滴甲苯溶液，離心。取上清液5 mL加入200 μL的大鼠血清，37 ℃下酶解12 h。酶解后的溶液沸水浴 5 min，冷卻至室溫后離心 15 min（10 000 r/min，4 ℃）[17]。過0.22 μm水相濾膜加入進(jìn)樣小瓶。

葉酸測(cè)定方法參照Zou等[18]的方法，色譜條件：UHPLC分離使用配備二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和帶有Thermo Accucore AQ色譜柱（100×2.1 mm）的脫氣機(jī)在40 ℃下進(jìn)行。流動(dòng)相是0.1%甲酸（A）和乙腈（B）。其流速為0.3 mL/min。梯度如下：0~2 min，5%~20% B；2~4 min，20%~95% B；4~5 min，95% B；5~5.5 min，95%~5% B；5.5~7.5 min，5% B。自動(dòng)進(jìn)樣器保持在4 ℃。

將UHPLC洗脫液引入Agilent 6460三重四極桿質(zhì)譜儀。MS/MS儀器在ESI正離子模式中操作。設(shè)置如下：毛細(xì)管電壓+3.5 kV，噴嘴電壓+1 kV。電池加速器電壓：+4 V。使用氮?dú)庾鳛殪F化氣體，壓力為0.31 MPa，干燥氣體流速為10 L/min，溫度為320 ℃，鞘氣流量為11 L/min，溫度為380 ℃，霧化器壓力為45 psi，停留時(shí)間為25 ms。Agilent Mass Hunter工作站用于控制設(shè)備以及數(shù)據(jù)采集和分析。四極桿分析儀以單位質(zhì)量分辨率（0.7 u）以及寬（1.2 u）和最寬質(zhì)量分辨率（2.5 u）運(yùn)行。采集是通過選定的反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行的，其中每個(gè)葉酸種類的相應(yīng)假分子陽離子通過碰撞誘導(dǎo)解離而破碎。

1.2.4 草莓質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

將如上1.2.1中（1）、（2）所示處理的樣品，采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行草莓的TPA測(cè)試，平行10次，將草莓沿著中心線切開，切面向下測(cè)定。測(cè)定條件為，置于TA39探頭下做硬度的檢測(cè)，每組樣品測(cè)試10次，并取平均值。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)如下：測(cè)前速率1.0 mm/s；測(cè)試速率1.0 mm/s；測(cè)后速率5.0 mm/s；觸發(fā)值5.0 g；壓縮距離30%；數(shù)據(jù)采集速率400 pps。檢測(cè)指標(biāo)為第一循環(huán)硬度、硬度形變量、硬度形變百分比與壓縮功循環(huán)[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）；采用Excel 2020整理數(shù)據(jù)及繪制圖表。每組數(shù)據(jù)三個(gè)平行樣，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸漬方式對(duì)草莓中AsA含量的影響

浸漬過程中草莓的AsA含量的變化情況見圖1。未處理的草莓AsA含量為0.40 mg/g，1 h后經(jīng)常壓浸漬和真空浸漬的草莓AsA含量分別達(dá)到1.17 mg/g和1.24 mg/g（p=0.03＜0.05），且真空浸漬的速度更快。原因可能是真空浸漬可以壓縮果蔬內(nèi)的氣體與液體[20]，形成了空隙與通道，更有利于浸漬液體的滲入擴(kuò)散過程。相比起常壓浸漬，真空浸漬具有潤(rùn)濕機(jī)理、毛細(xì)現(xiàn)象和吸附作用三方面綜合作用，因此傳質(zhì)速度更快，效率更高，也能夠更好地保護(hù)產(chǎn)品品質(zhì)。由表1可知，真空浸漬30 min過后草莓硬度開始出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，且 1 h后草莓質(zhì)地有明顯軟化（p=0.04＜0.05），所以綜合選擇真空浸漬30 min草莓進(jìn)行葉酸穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)的研究。

圖1 常壓浸漬和真空浸漬下草莓中AsA含量的變化Fig.1 Content of AsA in strawberry impregnated at atmospheric pressure and vacuum environment

表1 草莓在真空浸漬過程中的質(zhì)構(gòu)變化情況Table 1 Texture changes of strawberries during vacuum maceration

2.2 真空浸漬對(duì)葉酸穩(wěn)定性的影響

2.2.1 草莓中的葉酸含量及種類

據(jù)研究，草莓中的總?cè)~酸含量在10~350 μg/100 g不等[18,20,21,23]，草莓中葉酸濃度受各種因素影響，如種植條件（季節(jié)和氣候）、農(nóng)藝條件、地點(diǎn)、品種和收獲年份[23-26]。提取方法和分析方法也可能影響獲得的葉酸總含量。經(jīng)前期測(cè)定本實(shí)驗(yàn)所用草莓的葉酸總含量在100~128 μg/100 g，其主要葉酸種類為5-甲基四氫葉酸，四氫葉酸、5,10-亞甲基四氫葉酸，同時(shí)還含有葉酸的降解產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲酸（圖2）。Vahteristo等[27]報(bào)道草莓中葉酸種類主要為5-甲基四氫葉酸和四氫葉酸，其中5-甲基四氫葉酸占總?cè)~酸的65.00%。Octavia等[7]也證實(shí)草莓中還含有少量的10-甲?；臍淙~酸、5-甲?；臍淙~酸以及5,10-亞甲基四氫葉酸。因此，本文結(jié)果與前期研究發(fā)現(xiàn)基本一致。

圖2 不同天然葉酸質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of different folic acid forms

2.2.2 真空浸漬對(duì)冷藏期間草莓葉酸穩(wěn)定性及對(duì)氨基苯甲酸的影響

真空浸漬組和對(duì)照組草莓經(jīng)4 ℃儲(chǔ)藏8 d對(duì)三種葉酸及對(duì)氨基苯甲酸含量的變化見圖3。對(duì)照組與浸漬組的四氫葉酸含量在儲(chǔ)藏過程中都是處于一個(gè)下降的趨勢(shì)（圖3a），但對(duì)照組在第 2 d就下降了27.25%，第8 d下降了42.51%，而浸漬組在第8 d只損失了7.70%。可見，真空浸漬可以提高四氫葉酸的穩(wěn)定性。

5-甲基四氫葉酸在儲(chǔ)藏前期的時(shí)候含量上升且都在存放的第4 d出現(xiàn)峰值（圖3b），對(duì)照組和浸漬組分別上升了24.47%和12.67%。四氫葉酸可以在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下先生成5,10-亞甲基四氫葉酸，再在亞甲基四氫葉酸還原酶的作用下生成5-甲基四氫葉酸[8]。推測(cè)這可能就是 5-甲基四氫葉酸前期出現(xiàn)上升的原因。對(duì)照組的5-甲基四氫葉酸生成更快，原因可能是對(duì)照組的四氫葉酸降解速度更快（圖3a）且對(duì)照組的合成前體對(duì)氨基苯甲酸含量更高（圖3d）。4 d后5-甲基四氫葉酸開始下降，推測(cè)是因?yàn)楹笃诓葺M織結(jié)構(gòu)變化較大，5-甲基四氫葉酸作為水溶性物質(zhì)隨著汁液一起開始流失。

5,10-亞甲基四氫葉酸在兩組樣品的冷藏過程中變化不顯著（p＞0.05）（圖3c），浸漬組和對(duì)照組在7 d后分別下降至 21.61 ng/g（p=0.46＞0.05）和18.95 ng/g（p=0.07＞0.05），無明顯差異。Veerle等[28]報(bào)道，5,10亞甲基四氫葉酸主要在pH值為3~9的熱處理不穩(wěn)定，可轉(zhuǎn)化為 5-甲?；臍淙~酸。因此在4 ℃的冷藏環(huán)境下，5,10-亞甲基四氫葉酸表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。

對(duì)氨基苯甲酸在儲(chǔ)存過程中出現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)（圖3d），在第8 d的時(shí)候?qū)φ战M和真空浸漬組分別上升了77.89%和57.13%。這種小幅度的上升趨勢(shì)推測(cè)可能是因?yàn)樗臍淙~酸發(fā)生降解，C9-N10鍵經(jīng)自發(fā)氧化或光氧化斷裂，致使對(duì)氨基苯甲酸在儲(chǔ)存過程中出現(xiàn)小幅度的上升。因此，真空浸漬AsA能提高四氫葉酸穩(wěn)定性，從而減少對(duì)氨基苯甲酸降解產(chǎn)物的產(chǎn)生。

總?cè)~酸的變化趨勢(shì)（圖3e）與5-甲基四氫葉酸的變化趨勢(shì)基本一致。其原因應(yīng)是5-甲基四氫葉酸所占總?cè)~酸比例較大。且可以明顯的觀察到的是與初始含量相比冷藏8 d后的草莓總?cè)~酸的含量是處于一個(gè)比較穩(wěn)定狀態(tài)。

圖3 葉酸在冷藏過程中含量的變化Fig.3 Changes in folic acid content during cold storage

2.3 真空浸漬對(duì)草莓在冷藏期間質(zhì)構(gòu)的影響

草莓在0~6 d的冷藏中（表2），真空浸漬組的硬度都要略大于對(duì)照組，但無明顯差異。在第8 d時(shí)，真空浸漬的草莓硬度（92.60 N）明顯（p=0.02＜0.05）大于對(duì)照組的硬度（57.20 N）。冷藏中草莓仍保持一定果膠酶纖維素酶活性[29]，導(dǎo)致了對(duì)照組草莓質(zhì)地軟化，而浸漬AsA則有一定降低軟化速率的作用，其機(jī)理可能是AsA可以抑制相關(guān)酶的活性，從而降低了果膠水解速度[29]。

表2 草莓在冷藏過程中的質(zhì)構(gòu)變化情況Table 2 Changes in texture of strawberries during cold storage

3 結(jié)論

經(jīng)常壓浸漬、真空浸漬（真空度0.09 MPa）兩種不同的浸漬方法處理草莓，在1 h后AsA含量分別達(dá)到1.17和1.24 mg/g（p=0.03＜0.05），因此真空浸漬AsA的效果更好。經(jīng)測(cè)定，草莓中的總?cè)~酸含量為100至128 μg/100 g，主要葉酸種類為5-甲基四氫葉酸，四氫葉酸以及5,10-亞甲基四氫葉酸，同時(shí)還檢測(cè)到了葉酸降解產(chǎn)物對(duì)氨基苯甲酸。將真空浸漬組與對(duì)照組草莓冷藏8 d，結(jié)果表明，真空浸漬組的四氫葉酸下降了7.70%，對(duì)照組下降了42.51%。兩組對(duì)氨基苯甲酸都出現(xiàn)一定程度的增加。5,10-亞甲基四氫葉酸在草莓的儲(chǔ)藏過程中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。5-甲基四氫葉酸存放的第4 d均出現(xiàn)峰值，對(duì)照組上升了24.47%，浸漬組上升了12.67%，冷藏后期5-甲基四氫葉酸開始下降。因此，草莓的四氫葉酸在冷藏過程中極不穩(wěn)定，但真空浸漬AsA可以有一定抑制降解作用。質(zhì)構(gòu)結(jié)果顯示在第8 d時(shí)真空浸漬組的草莓硬度明顯高于對(duì)照組。因此，經(jīng)真空浸漬AsA對(duì)草莓有一定的硬化作用。目前未有研究清楚表明 AsA浸漬可以提高四氫葉酸的穩(wěn)定性，因此本研究為草莓等生鮮水果的保鮮以及為提高果蔬中不同種類葉酸的穩(wěn)定性提供了理論依據(jù)和參考。