余 鵬，孟祥軒，余義和，楊英軍

（河南科技大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，河南 洛陽 471023）

葡萄（Vitis viniferaL.）果實汁多味美，含有大量對人體有益物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值[1]。隨著人們對水果保健功能的逐漸重視，對葡萄的需求量也日益增加。然而葡萄果實采后活性氧（reactive oxygen species，ROS）代謝旺盛，極易在貯藏期間發(fā)生腐爛變質(zhì)，嚴(yán)重影響葡萄的營養(yǎng)和商業(yè)價值。據(jù)統(tǒng)計，我國每年葡萄在貯藏期的損失量高達葡萄總產(chǎn)量的27%以上，造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。

目前，應(yīng)用在葡萄上的保鮮方法主要有低溫、高壓靜電處理、熱處理、輻照等物理保鮮方法，具有操作簡單方便等優(yōu)點，但其投入成本和技術(shù)設(shè)備要求高，無法大面積推廣；生物保鮮包括涂膜和天然提取物保鮮等方法，此方法雖然有一定的保鮮效果，但具有處理后果實品質(zhì)不穩(wěn)定、成本高等缺點；化學(xué)保鮮包括臭氧、二氧化氯、二氧化硫、1-甲基環(huán)丙烯等處理方法，化學(xué)保鮮效果不錯，但完全無毒、經(jīng)濟實用且廣譜抑菌的理想防腐保鮮劑尚未發(fā)現(xiàn)；氣調(diào)貯藏的保鮮效果較好，但成本和維護費用高，只適用于大型企業(yè)，適用面小[3-4]。因此，有必要對葡萄的新型保鮮技術(shù)進行深入研究。

ROS是‘巨峰’葡萄（Vitis viniferaL.hVitis labruscaL.‘Kyoho’）有氧代謝過程中產(chǎn)生的一類氧化能力強、化學(xué)性質(zhì)較活潑的含氧物質(zhì)，包括g、丙二醛（missile defense agency，MDA）等，主要在線粒體內(nèi)產(chǎn)生，是植物在有氧代謝過程中電子傳遞至氧分子時產(chǎn)生的活躍并具毒害作用的含氧物質(zhì)的總稱[5]。ROS清除酶和內(nèi)源抗氧化物質(zhì)共同組成ROS清除系統(tǒng)。ROS清除酶主要有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽還原酶（gluathione reductase，GR）等；內(nèi)源抗氧化物質(zhì)有還原型抗壞血酸（reduced ascorbic acid，AsA）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）[6-8]。正常情況下，通過及時清除葡萄內(nèi)產(chǎn)生的ROS，使ROS的產(chǎn)生與清除處于平衡，從而保證果實品質(zhì)；但采后葡萄體內(nèi)ROS清除能力下降，ROS的產(chǎn)生與清除失去平衡，導(dǎo)致葡萄體內(nèi)積累過多的ROS，加速其衰老和變質(zhì)。

胺鮮酯（diethyl aminoethyl hexanoate，DA-6）是一種新型無毒的植物調(diào)節(jié)劑，化學(xué)式為C12H25NO2，可提高植物過氧化物等活性，具有容易調(diào)配、操作方便的優(yōu)點，同時具有改善果實品質(zhì)的功能[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，采前噴施DA-6可以保持龍眼果實果皮細胞膜完整性，提高采后龍眼果實的耐貯性及采后果皮的ROS清除能力[11-12]。此外，在葡萄著色初期噴施30% DA-6和乙烯利復(fù)配劑可促進葡萄著色，增加可溶性固形物和VC含量，提高果實品質(zhì)[13]。目前，通過采前噴施DA-6探索其對采后‘巨峰’葡萄品質(zhì)和ROS代謝影響的研究尚鮮見報道。

本研究以‘巨峰’葡萄為實驗材料，通過采前噴施不同濃度DA-6，分析了不同質(zhì)量濃度DA-6對‘巨峰’葡萄果實采后品質(zhì)和ROS代謝的影響，旨在為提高葡萄采后品質(zhì)及貯運保鮮提供有效的技術(shù)方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘巨峰’葡萄采摘于河南科技大學(xué)葡萄試驗基地。挑選大小、顏色、成熟程度相似的葡萄果實。葡萄采收后立即送至實驗室，清水洗凈并晾干后，將葡萄于（0f 1）℃、相對濕度65%～70%條件下貯藏[14]。

氮藍四唑、甲硫氨酸、核黃素、對氨基苯磺酸二硫代硝基苯甲酸、硫代巴比妥酸、鄰菲羅啉、α-萘胺鄭州慧耕達生物科技有限公司；過氧化氫、抗壞血酸、三氯乙酸、鹽酸羥胺、三氯化鐵、乙醇、磷酸、乙二胺四乙酸、磷酸二氫鈉、石英沙、碳酸鈣 河南寶格生物技術(shù)有限公司；硫酸 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FHM-5果實硬度計、PAL-1型數(shù)顯糖度計 點將（上海）科技股份有限公司；PAL-ACID1數(shù)顯酸度計ATAGO（愛拓）中國分公司；VELOCITY 18R高速離心機 天美儀拓實驗室設(shè)備（上海）有限公司；UV-4802紫外分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Cubis II電子天平 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

本實驗分別使用質(zhì)量濃度0（對照）、10、30、50、70 mg/L DA-6在葡萄轉(zhuǎn)色期噴施于果實表面，每種處理選取6 穗，一共30 穗。采集貯藏0、20、30、40、50、60 d的葡萄果實進行實驗。每個處理設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3.2 品質(zhì)指標(biāo)的測定

在各個階段實驗前對果實稱質(zhì)量并記錄，按公式（1）計算質(zhì)量損失率。

果實硬度測定：使用FHM-5果實硬度計測定果實赤道線3 個點的硬度，單位為N。

總可溶性固形物（total soluble solids，TSS）質(zhì)量分數(shù)測定：參照田雪婷[15]的方法，采用PAL-1型數(shù)顯糖度計測定果汁中TSS質(zhì)量分數(shù)。

可滴定酸（titratable acid，TA）質(zhì)量分數(shù)測定：參考陳楚英等[16]的方法，采用數(shù)顯酸度計測定TA質(zhì)量分數(shù)。

1.3.3 ROS清除酶活力的測定

選取質(zhì)量濃度0 mg/L DA-6處理的果實作為對照組，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實為處理組。

酶液提?。簝蓚€處理組中各取一顆果實，去皮、梗、籽后，液氮研磨后轉(zhuǎn)移到研缽中，加入適量磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L、pH 7.0）并在冰浴中研磨，充分混勻后定容，在4 ℃、15000hg下離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液并用磷酸鹽緩沖液定容至20 mL，取上清液作為活性氧清除酶提取液。

參照Han Cong等[17]的方法測定SOD活力，單位為U/gmf；參照Shadmani等[18]的方法測定CAT活力，單位為U/gmf；參照曹建康等[19]的方法測定APX活力，單位為U/gmf；根據(jù)Solarbio試劑盒（BC1160）說明書測定GR活力。

1.3.4 內(nèi)源抗氧化物含量測定

選取質(zhì)量濃度0 mg/L DA-6處理的果實作為對照組，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實為處理組。稱取1 g葡萄鮮果樣品，參考Arakawa等[20]的方法進行AsA含量測定，單位為nmol/gmf，計算如公式（2）所示；稱取5 g葡萄凍果樣品，參考曹建康等[19]的方法進行GSH含量測定，單位為nmol/gmf，計算如公式（3）所示。

式中：V1為樣品總體積/mL；n為A s A 物質(zhì)的量/nmol；V2為吸取樣品體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

式中：n為GSH物質(zhì)的量/nmol；V1為提取液總體積/mL；V2為吸取樣品體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

選取質(zhì)量濃度0 mg/L DA-6處理的果實作為對照組，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實為處理組。稱取5 g葡萄鮮果樣品，參考曹建康等[19]的方法測定·產(chǎn)生速率，單位為nmol/（ming gmf），計算如公式（4）所示。

式中：n為·物質(zhì)的量/nmol；V1為提取液總體積/mL；V2為吸取樣品體積/mL；t為樣品反應(yīng)時間/min；m為樣品質(zhì)量/g。

稱取1 g葡萄鮮果樣品，參考曹建康等[19]的方法測定MDA含量，單位為μmol/gmf，計算如公式（5）所示。

式中：n為MDA物質(zhì)的量/μmol；V1為樣品總體積/mL；V2為測定樣品體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.6 DPPH自由基清除率和總還原能力的測定

選取質(zhì)量濃度0 mg/L DA-6處理的果實作為對照組，以質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實為處理組。參考Floegel等[21]的方法測定DPPH自由基清除率，稱取1 g葡萄鮮果樣品進行實驗，DPPH自由基清除率單位為%，計算如公式（6）所示。參考Chen Chen等[22]的方法測定總還原能力，稱取1 g葡萄鮮果樣品進行實驗，總還原能力單位為g/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上實驗均進行3 次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Excel 2019軟件作圖，采用SPSS 26軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實品質(zhì)的影響

隨著貯藏時間的延長，各個處理組的果實質(zhì)量損失不斷加劇。由表1可知，在貯藏20、30 d時，質(zhì)量濃度30、50、70 mg/L DA-6處理的果實質(zhì)量損失率顯著低于其他處理組（P＜0.05）；貯藏40 d時，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理果實的質(zhì)量損失率顯著低于質(zhì)量濃度0、10、70 mg/L DA-6處理果實（P＜0.05）；貯藏50、60 d時，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理果實的質(zhì)量損失率顯著低于其他處理組（P＜0.05）。貯藏20 d時，各處理組之間果實硬度均無顯著性變化（P＞0.05）；貯藏30 d起，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實硬度明顯高于其他處理組。

表1 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實質(zhì)量損失率、硬度、TSS、TA質(zhì)量分數(shù)的影響Table 1 Effect of preharvest spray of DA-6 on mass loss percentage,hardness,total soluble solid content and titratable acidity of ‘Kyoho’grapes during postharvest storage

貯藏20、30 d時，各處理組間TSS質(zhì)量分數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）；貯藏40 d時，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實TSS質(zhì)量分數(shù)高于其他處理，且與質(zhì)量濃度0、10、30 mg/L DA-6處理組具有顯著性差異（P＜0.05）；貯藏50、60 d時，質(zhì)量濃度10、30、50、70 mg/L DA-6處理的果實TSS質(zhì)量分數(shù)均明顯高于對照組。在整個葡萄貯藏期間，各處理間果實TA質(zhì)量分數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。上述結(jié)果表明采前噴施DA-6可有效維持果實的貯藏品質(zhì)，其中質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理效果最佳，故選擇質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6進行后續(xù)實驗。

2.2 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實抗氧化酶的影響

由圖1A可知，在貯藏期間對照組和處理組的SOD活力均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且貯藏30 d后對照組果實SOD活力顯著低于質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理果實（P＜0.05）；貯藏0～40 d，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實SOD活力呈上升趨勢，在40 d時SOD達到最高值后開始下降。與SOD活力變化趨勢相似，CAT活力在貯藏階段同樣呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢（圖1B）。其中，處理組果實CAT活力在貯藏40 d達到峰值后開始下降，對照組則從貯藏20 d開始持續(xù)下降，且始終低于處理組CAT活力。由圖1C可知，處理組與對照組葡萄的APX活力在葡萄貯藏階段大體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，且質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實APX活力一直高于對照組。由圖1D可知，處理組與對照組GR活力變化趨勢保持一致，均在貯藏40 d前呈上升趨勢，40 d后開始下降；貯藏30 d后質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實GR活力顯著高于對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，采前噴施DA-6可顯著提高采后果實SOD、CAT、APX、GR活力。

圖1 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實SOD（A）、CAT（B）、APX（C）、GR（D）活力的影響Fig.1 Effect of preharvest spray of DA-6 on activities of SOD (A),CAT (B),APX (C) and GR (D) in ‘Kyoho’ grape fruit during postharvest storage

2.3 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實AsA含量和GSH含量的影響

果實內(nèi)AsA含量與GSH含量越高，代表果實遭受ROS侵害越輕，抗氧化效果越好。由圖2A可知，貯藏期間處理組和對照組的AsA含量變化趨勢一致。在貯藏前期（0～20 d），對照組和處理組的AsA含量和GSH含量無顯著性差異（P＞0.05）；貯藏30 d后，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理果實的AsA含量顯著高于對照組（P＜0.05）。同樣，在貯藏30、40、60 d時，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理果實的GSH含量顯著高于對照組（P＜0.05），總體保持下降趨勢（圖2B）。這表明采前噴施DA-6顯著提高了采后葡萄果實AsA含量和GSH含量。

圖2 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實AsA含量（A）和GSH含量（B）的影響Fig.2 Effect of preharvest spray of DA-6 on ASA (A) and GSH (B)contents in ‘Kyoho’ grape fruit during postharvest storage

2.4 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實g產(chǎn)生速率和MDA含量的影響

圖3 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實g 產(chǎn)生速率（A）和MDA含量（B）的影響Fig.3 Effect of preharvest spray of DA-6 on superoxide anion production rate (A) and MDA content (B) of ‘Kyoho’ grape fruits during postharvest storage

2.5 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實DPPH自由基清除率和總還原能力的影響

葡萄果實中DPPH自由基清除率和總還原能力是評估果實的抗氧化能力的重要指標(biāo)，越高表明抗氧化能力越好。由圖4A可知，處理組和對照組的DPPH自由基清除率隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。在貯藏期前期（0～30 d），對照組和處理組之間的DPPH自由基清除率沒有顯著性差異（P＞0.05）；貯藏30 d后，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理組果實DPPH自由基清除率顯著高于對照組（P＜0.05）。由圖4B可知，處理組和對照組的總還原能力變化趨勢大體一致。在貯藏20、30 d時，與對照組相比，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理的果實總還原能力顯著高于對照組（P＜0.05）。結(jié)果表明，采前噴施DA-6可有效提升果實DPPH自由基清除率和總還原能力，提高果實抗氧化能力。

圖4 采前噴施DA-6對貯藏期‘巨峰’葡萄果實DPPH自由基清除率（A）和總還原能力（B）的影響Fig.4 Effect of preharvest spray of DA-6 on DPPH radical scavenging capacity (A) and total reducing power (B) of ‘Kyoho’ grape fruit during postharvest storage

3 討論

采后果實貯藏時間長短與果實ROS代謝相關(guān)[23]。本研究通過在‘巨峰’葡萄轉(zhuǎn)色期噴施不同質(zhì)量濃度的DA-6，測定果實品質(zhì)（ROS代謝強度的生理指標(biāo)），探究DA-6對葡萄貯藏期品質(zhì)和ROS代謝的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噴施不同質(zhì)量濃度DA-6均可有效提高葡萄品質(zhì)，延長葡萄的貯藏期，其中質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理效果最佳，可明顯降低葡萄果實的質(zhì)量損失率，保持果實硬度、TSS質(zhì)量分數(shù)，從而提高了果實的品質(zhì)；此外，通過分析與ROS代謝相關(guān)指標(biāo)變化，包括SOD活力、CAT活力、APX活力、GR活力、AsA含量、GSH含量、·產(chǎn)生速率、MDA含量、DPPH自由基清除率和總還原能力，表明質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理對果實中ROS代謝產(chǎn)生明顯影響。

葡萄果實的耐貯性與果實品質(zhì)有關(guān)，隨著貯藏時間的延長，果實內(nèi)水分和營養(yǎng)物質(zhì)也都發(fā)生了變化。在本研究中，與對照組相比，轉(zhuǎn)色期噴施DA-6的葡萄果實能夠在貯藏期保持較好的品質(zhì)，其中質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理組果實的保鮮效果最佳（表1）。這與林毅雄等[11-12]研究結(jié)果一致，對龍眼果實采前噴施DA-6同樣可得到提高果實貯藏品質(zhì)的效果，增強果實的耐貯性，不同的是質(zhì)量濃度10 mg/L DA-6處理對龍眼采后保鮮效果最佳，而本研究中質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理對‘巨峰’葡萄采后保鮮效果最顯著。

當(dāng)果實品質(zhì)下降時，自由基代謝平衡系統(tǒng)被破壞，ROS大量積累，引起膜脂過氧化，ROS主要包括·OH、·、單線態(tài)氧（singlet oxygen，1O2）、H2O2等[24]。MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其含量直接反映了果實的品質(zhì)。植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)包含酶類和非酶類，可通過清除或轉(zhuǎn)化ROS平衡細胞體內(nèi)ROS含量。SOD、CAT、APX和GR是植物體內(nèi)主要的ROS清除酶，其活力與ROS清除效率成正比。SOD將·歧化為H2O2和O2，H2O2再經(jīng)CAT和APX催化生成無害的H2O和O2，隨著·含量增長的減緩，MDA也隨之增長，從而延長葡萄果實的保質(zhì)期。羅楊等[25]研究表明SOD、APX、CAT活力上升，加快ROS清除反應(yīng)，延緩采后新鮮木耳的衰老；Sun Junzheng等[23]研究表明SOD、APX、CAT、GR等ROS清除酶活力與·和MDA含量成反比，影響果實采后品質(zhì)。同樣，本研究表明采前噴施質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6顯著提高了采后‘巨峰’葡萄果實中ROS清除酶活力，遏制了ROS的積累，延緩了果實的衰老，延長了果實的貨架期。

AsA和GSH是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑[26-27]，保障AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的正常運作，加速H2O2分解。已有研究發(fā)現(xiàn)通過提高SOD、CAT、APX活力和GR活力可以促進AsA和GSH的再生，從而延緩獼猴桃果實衰老[28]。本研究中，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理組的葡萄果實AsA含量和GSH含量高于對照組，維持采后果實ROS清除能力，以提高果實的耐貯性。千春錄等[29]的研究表明，較高的AsA含量和GSH含量可以有效減輕獼猴桃果實發(fā)氧化；林藝芬[30]的研究也同樣表明AsA和GSH可以及時清除龍眼果皮中積累的ROS，維持果皮細胞膜結(jié)構(gòu)完整，從而抑制采后品質(zhì)發(fā)生劣變。

DPPH自由基清除率和總還原能力是評估果實抗氧化能力的重要指標(biāo)[31]。已有研究發(fā)現(xiàn)較高的DPPH自由基清除率和總還原能力能有效減少ROS的產(chǎn)生和積累[32]。本研究中質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理組的葡萄果實DPPH自由基清除率和總還原能力均高于對照組，有效緩解了膜脂過氧化，保持了葡萄果實品質(zhì)，提高了葡萄果實的耐貯性。郭欣等[32]研究也同樣表明較高的DPPH自由基清除率和總還原能力可以延緩西番蓮果實衰老；Lin Yifen等[33]研究表明，較高的DPPH自由基清除率和總還原能力可以延緩果皮褐變與病害的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，噴施質(zhì)量濃度10、30、50、70 mg/L的DA-6處理可有效維持貯藏期‘巨峰’葡萄外觀品質(zhì)，其中質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理效果最好；進一步研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度50 mg/L DA-6處理相較于對照組顯著提升采后果實中SOD、CAT、APX、GR活力，維持果實內(nèi)ROS清除能力；提高AsA含量和GSH含量，增強果實的抗氧化效果；提升DPPH自由基清除率和總還原能力，增強果實的抗氧化能力；降低·產(chǎn)生速率和MDA含量，控制果實的氧化速率。以此平衡‘巨峰’葡萄果實中ROS代謝，增強果實抗氧化能力，降低果實氧化速率，提高果實耐貯性，延緩果實衰老。本研究為葡萄貯藏保鮮提供了一種易操作且高效的方法。