封寶紅，喻業(yè)安，晏 莉，伍 軍，張艷霞，朱戈麗

武漢大學附屬武漢市第三醫(yī)院 腎內科, 湖北 武漢 430014

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)具有多向分化潛能，但在老年期，BM-MSCs更多地向脂肪細胞分化，可引起骨形成減少，進而導致老年性骨質疏松癥[1]。目前關于BM-MSCs成脂分化相關的分子機制尚不明確，因此，探究該機制對于老年性骨質疏松癥的治療具有重要意義。研究表明，H2O2可用于誘導BM-MSCs分化，且多種miRNA參與調控H2O2誘導的BM-MSCs分化，如miR-183-5p在H2O2誘導的BM-MSCs中高表達，過表達miR-183-5p可抑制BM-MSCs成骨分化[2]。過表達miR-210可促進犬BM-MSCs向成骨方向分化[3]。此外，miR-210可參與緩解H2O2誘導產生的氧化應激損傷，改善心肌功能[4]。本研究旨在探討miR-210對H2O2誘導的BM-MSCs成脂分化的影響以及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性SD大鼠[廣州銳格生物科技有限公司，生產許可證號為SCXK(粵)2021-0059]，所有動物實驗均遵循3R原則且得到武漢市第三醫(yī)院動物倫理委員會的批準(ZACUC20210421-14)。

1.1.2 主要試劑：30% H2O2(上海澤葉生物公司)；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferatior-activated receptor，PPARγ)、CCAAT/強子結合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein，C/EBPα)抗體(Santa Cruz公司)；抗CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5、CD90-PE流式抗體、兔源一抗β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、c-Myc、細胞周期蛋白 D1(cyclin D1)、GAPDH及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 BM-MSCs的分離、培養(yǎng)[5]：采用頸椎脫位法處死大鼠，分離股骨并暴露骨髓腔，用DMEM低糖培養(yǎng)基反復吹打骨髓腔，將含有骨髓的培養(yǎng)基加入到離心管中，1 000 r/min心10 min，棄上清，將獲得細胞在37 ℃、含有5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。

1.2.2 流式細胞測量術檢測BM-MSCs表面抗原：取匯合度90%的P3代BM-MSCs，經消化、PBS洗滌后，1 000 r/min離心10min，棄上清，調整細胞為1×106個/mL，分為8個試管，每管加入50 μL細胞懸液，并分別加入5 μL CD29 FITC-A、CD44 FITC-A、CD90 PE-A、CD45 PE-C及對應的同型對照抗體，4 ℃下避光孵育20 min，在常溫下以1 000 r/min離心10 min，棄上清，利用流式細胞儀進行檢測。

1.2.3 細胞的分組及處理：取增殖狀態(tài)良好的P3代BM-MSCs，利用200 μmol/L H2O2誘導1 h以構建BM-MSCs成脂分化模型[6]，命名為模型組。另取正常培養(yǎng)的BM-MSCs為對照組。 H2O2誘導1 h后將模型組BM-MSCs進行轉染，并分為mimic NC組(50 nmol/L)、miR-210 mimic組(50 nmol/L)、inhibitor NC組(100 nmol/L)、miR-210 inhibitor組(100 nmol/L)，轉染24 h后觀察轉染效果。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測細胞中miR-210表達：用Trizol試劑提取總RNA，將RNA反轉錄為cDNA后，進行熒光定量PCR檢測miR-210表達。以U6為內參，通過2-△△Ct法計算miR-210水平。引物序列為：miR-210正向：5′-CATAGATAGCCACTG CCCACA-3′；反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；反向：5′-AACGCT TTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.5 油紅O染色檢測細胞胞質內的脂肪顆粒：將細胞(1.0×105個/孔)接種到24孔板中，孵育24 h后，將細胞在4%多聚甲醛中固定20 min，用PBS洗滌兩次后，在每孔中加入500 μL油紅O染色工作液染色30 min，60%異丙醇洗3次，蒸餾水洗3次，蘇木精染色15 s，水洗3次，封片。觀察胞質內的脂肪顆粒。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達：RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，將總蛋白經定量、電泳、轉膜、封閉，將膜與一抗PPARγ(1∶2 000)、C/EBPα(1∶1 000)、β-catenin(1∶2 000)、c-Myc(1∶1 000)、cyclin D1(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃下孵育過夜，然后在室溫下與二抗(1∶4 000)孵育1 h后，加入ECL試劑觀察蛋白顯影，通過軟件(Image J)分析蛋白質條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 BM-MSCs形態(tài)學觀察及表面抗原鑒定

P0代細胞中混有雜細胞，經多次換液傳代可去除，細胞貼壁較快，大部分呈長梭形。P3代細胞呈長梭形，形態(tài)及排列趨于一致，呈旋渦狀增殖(圖1)。P3代細胞高表達CD29(99.27%)、CD44(98.36%)和CD90(99.87%)， 低表達CD45(5.26%)(圖2)。

2.2 BM-MSCs轉染效率及各組BM-MSCs 中miR-210表達比較

鏡下均可見較強綠色熒光(圖3)。與對照組比較，模型組BM-MSCs中miR-210水平降低(P<0.05)；與模型組、mimic NC組比較，miR-210 mimic組BM-MSCs中miR-210表達升高(P<0.05)；與模型組、inhibitor NC組比較，miR-210 inhibitor 組BM-MSCs中miR-210表達降低(P<0.05)(圖4)。

圖1 倒置顯微鏡觀察BM-MSCs形態(tài)Fig 1 Inverted microscope to observe the morphology of BM-MSCs

2.3 miR-210對H2O2誘導BM-MSCs成脂分化的影響

與對照組比較，模型組BM-MSCs中脂肪顆粒數目升高(P<0.05)；與模型組、mimic NC組比較，miR-210 mimic組BM-MSCs中脂肪顆粒數目降低(P<0.05)；與模型組、inhibitor NC組比較，miR-210 inhibitor 組BM-MSCs中脂肪顆粒數目升高(P<0.05)(圖5)。

2.4 H2O2誘導BM-MSCs中脂肪細胞標志物PPARγ、C/EBPα 蛋白表達比較

與對照組比較，模型組BM-MSCs中PPARγ、C/EBPα 蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組、mimic NC組比較，miR-210 mimic組BM-MSCs中PPARγ、C/EBPα蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組、inhibitor NC組比較，miR-210 inhibitor組BM-MSCs中PPAR γ、C/EBPα蛋白表達升高(P<0.05)(圖6)。

Green represents marker expression, red represents isotype control IgG expression圖2 流式細胞測量術檢測BM-MSCs表面抗原Fig 2 Detection of BM-MSCs surface antigen by flow cytometry

圖3 細胞轉染結果Fig 3 Results of cell transfection

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group圖4 miR-210在各組細胞中的表達Fig 4 Expression of miR-210 in each group of cells

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group

2.5 H2O2誘導BM-MSCs中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達比較

與對照組比較，模型組BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組、mimic NC組比較，miR-210 mimic組BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組、inhibitor NC組比較，miR-210 inhibitor 組BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達降低(P<0.05)(圖7)。

3 討論

多項研究表明，間充質干細胞對CD29、CD44、CD90呈陽性，而對CD45呈陰性，抗原CD29、CD44、CD45、CD90的表達是評估BM-MSCs純度的重要標準之一[7]。本研究發(fā)現P3代BM-MSCs高表達CD29、CD44和CD90，低表達CD45，符合BM-MSCs的特征。氧化應激使細胞產生大量的自由基，過量自由基會導致細胞衰老，本研究通過H2O2誘導引發(fā)細胞功能異常，促進細胞脂滴形成，以構建BM-MSCs成脂分化模型，結果顯示模型組BM-MSCs中脂肪顆粒數目升高，提示BM-MSCs成脂分化模型構建成功。PPARγ和C/EBPα是細胞成脂分化的關鍵調節(jié)因子，其可通過協(xié)同作用來調節(jié)3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞分化，且PPARγ和C/EBPα表達減弱可緩解H2O2誘導引發(fā)的損傷，抑制內脂滴的形成[8]；本研究顯示，模型組BM-MSCs中PPARγ、C/EBPα蛋白表達升高，再次證明BM-MSCs成脂分化模型構建成功。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; ▲P<0.05 compared with mimic NC group;△P<0.05 compared with inhibitor NC group

miRNA可調節(jié)多種生物學過程，如細胞分化、增殖和凋亡等。據報道，過表達miR-330-5p可抑制H2O2誘導的BM-MSCs成脂分化[9]；miR-210的過表達促進兔BM-MSCs 成骨分化并抑制成脂分化[10]。本研究結果與其一致：miR-210在模型組BM-MSCs中低表達，表明H2O2可引起miR-210水平降低，低水平miR-210可能與H2O2造成活性氧增多、過氧化反應增強進而對細胞造成的損傷有關；過表達miR-210后模型組BM-MSCs中脂肪顆粒數目降低，而抑制miR-210表達后則呈相反趨勢，提示過表達miR-210可抑制H2O2誘導后BM-MSCs的成脂分化。

Wnt/β-catenin是一種在進化上保守的信號通路，其在調節(jié)胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)方面至關重要。有研究發(fā)現，灌服骨碎補水煎液可以抑制去卵巢大鼠BM-MSCs成脂分化，其機制與激活Wnt/β-catenin通路有關[11]；卡馬西平通過抑制Wnt/β-catenin通路增強脂肪生成[12]。本研究顯示，上調miR-210表達后模型組BM-MSCs中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達升高，而抑制miR-210表達后模型組BM-MSCs中相應蛋白表達降低，提示過表達miR-210可抑制H2O2誘導的BM-MSCs成脂分化，該機制可能與激活Wnt/β-catenin 通路有關。