鄧 玲，龍 嵐，楊 陽，靳嬋嬋，李蘇云，豐 娜，賀 靜*

1.昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院&附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032； 2.云南省第一人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)遺傳科，云南 昆明 650032

β-地中海貧血(β-thalassemia，β-地貧) 是由于β-珠蛋白基因(hemoglobin subunit beta, HBB)突變導(dǎo)致的遺傳溶血性疾病[1]。云南是地貧的高發(fā)區(qū)，珠蛋白基因突變類型與國內(nèi)其他省市不同、不同民族之間的差異也較大，“罕見突變”不少見[2]。對于重型β-地貧患者來說，增加胎兒血紅蛋白(fetal hemoglobin, HbF)含量會緩解β-地貧患者的貧血程度。Gγ-珠蛋白基因(hemoglobin subunit gamma 2, HBG2)的rs7482144(C>T)多態(tài)性位點(diǎn)和Aγ-珠蛋白基因(subunit gamma 1, HBG1)的rs368698783(G>A)多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性能有效增加γ-珠蛋白的表達(dá)[3-4]，但這兩個位點(diǎn)對HbF含量的表達(dá)調(diào)控在不同地區(qū)和人群中各不相同[5-9]。近年來有研究報道rs368698783位點(diǎn)的遺傳修飾效應(yīng)強(qiáng)于rs7482144位點(diǎn)，而rs368698783位點(diǎn)對云南地區(qū)β-地貧患者HbF含量的調(diào)控數(shù)據(jù)未見報道。本研究通過對云南β-地貧患者rs368698783和rs7482144位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，提高對云南地貧的全面認(rèn)識，為完善地貧的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷技術(shù)規(guī)范提供依據(jù)，并對云南β-地貧患者的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選取2020至2021年在云南省第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳科進(jìn)行地貧基因檢測的β-地貧患者樣本51例，其中輸血依賴性β-地中海貧血(transfusion-dependent β-thalassemia, TDT)樣本21例，非輸血依賴性β-地中海貧血(non-transfusion-dependent β-thalassemia, NTDT)樣本30例，血紅蛋白E(haemoglobin E, HbE)純合樣本40例；選取血紅蛋白電泳篩查結(jié)果為HbF>5%的樣本，其中HbF>5%且β珠蛋白基因檢測結(jié)果正常(βN/βN)樣本113例，HbF>5%且存在β珠蛋白基因突變(βM/βN)樣本113例；選取血紅蛋白電泳結(jié)果和地貧基因檢測結(jié)果均為正常的無親緣關(guān)系樣本262例作為對照組。本研究經(jīng)云南省第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號：2018GJ179)。研究參與者均知情同意。

1.1.2 試劑(盒)：血紅蛋白測定試劑盒(Sebia公司)；核酸提取或純化試劑(西安天隆科技有限公司)；地中海貧血基因檢測試劑盒、測序反應(yīng)通用試劑盒、核酸染料(華大生物科技有限公司)；2×TSINGKE Master Mix、Maker(100 bp DNA Ladder)(北京擎科生物科技有限公司)；瓊脂糖(v900510-100G)(Sigma-Aldrich公司)；紅細(xì)胞裂解液(Biosharp公司)；Trizol、Thermo ScientificTMRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific 公司)；異丙醇(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)；三氯甲烷(上海申博化工有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 血紅蛋白(haemoglobin, Hb)分析：抽取研究對象外周靜脈血2 mL于EDTA-K2抗凝管中,應(yīng)用毛細(xì)管電泳儀對成人血紅蛋白(adult hemoglobin, HbA)、成人血紅蛋白次要成分(minor fraction of adult hemoglobin, HbA2)、HbF等進(jìn)行定量檢測分析。

1.2.2 基因組DNA的提取：應(yīng)用西安天隆科技有限公司的核酸提取儀NP968及相應(yīng)試劑盒提取樣本DNA，超微量分光光度計進(jìn)行DNA濃度和純度的測定。

1.2.3 地中海貧血基因檢測：通過高通量測序技術(shù)對人外周血樣本中α-珠蛋白基因(hemoglobin subunit alpha 1, HBA1；hemoglobin subunit alpha 2, HBA2)和HBB基因上的非缺失突變以及7種地中海貧血缺失型突變進(jìn)行檢測。地中海貧血基因檢測實(shí)驗(yàn)步驟主要由以下幾步組成：PCR擴(kuò)增、PCR-pooling產(chǎn)物純化、超聲打斷、末端修復(fù)、加“A”、接頭連接、片段篩選、測序反應(yīng)、數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 DNA測序：采用PCR技術(shù)擴(kuò)增HBG1和HBG2啟動子區(qū)，HBG1基因 rs368698783位點(diǎn)擴(kuò)增上游引物為5′-TACTGCGCTGAAACTGTGG-3′，下游引物為5′-TACCTTCCCAGGGTTTCTCC-3′，PCR產(chǎn)物大小為773 bp；HBG2基因 rs7482144位點(diǎn)擴(kuò)增上游引物為5′-GGCCTAAAACCACAGAGAGT-3′，下游引物為5′-CCAGAAGCGAGTGTGTGGAA-3′,PCR產(chǎn)物大小為577 bp。rs368698783位點(diǎn)PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)后72 ℃延伸7 min；rs7482144位點(diǎn)PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上檢測是否擴(kuò)增成功，成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測序，測序結(jié)果采用Chromas、DNAStar軟件與正常HBG1和HBG2基因序列進(jìn)行對比分析。

1.2.5Gγ/Aγ相對表達(dá)量的分析：使用Trizol提取外周血中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時擴(kuò)增出Gγ和Aγ-珠蛋白轉(zhuǎn)錄本，上游引物為5′-ACTCGCTTCTGGAACGTCT-3′，下游引物為5′-TA AAGCCTATCCTTGAAAGCTCT-3′,PCR產(chǎn)物大小為536 bp[8]。PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后72 ℃延伸7 min；將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳上檢測是否擴(kuò)增成功，成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行Sanger測序，Sanger測序峰圖使用Bioedit軟件進(jìn)行分析得到Gγ/Aγ mRNA表達(dá)的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血液學(xué)相關(guān)參數(shù)分析

各組的血液學(xué)相關(guān)參數(shù)如表1。存在β-珠蛋白基因突變樣本表現(xiàn)出明顯的小細(xì)胞低色素血液學(xué)表型[HbA2>3.5%，紅細(xì)胞平均容積(mean corpuscular volume, MCV)<80 fl，紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(mean corpsular hemoglobin, MCH)<27 pg]，β-地貧攜帶者一般表現(xiàn)為輕度貧血，而β-地貧患者一般表現(xiàn)為中度或重度貧血；HbE純合樣本HbE含量均大于70%，HbF含量輕度升高。

2.2 rs368698783與rs7482144基因分型結(jié)果

在579例研究樣本中，rs368698783位點(diǎn)檢出GG、GA、AA 3種基因型(圖1)，rs7482144位點(diǎn)檢出CC、CT、TT 3種基因型(圖2)。兩個位點(diǎn)的等位基因分布經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，均P>0.05，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。在579例樣本中檢出17例rs368698783與rs7482144位點(diǎn)不連鎖樣本，經(jīng)HaploView分析，HBG1基因上的rs368698783和HBG2基因上的rs7482144存在較強(qiáng)的連鎖不平衡性(D’=0.964,R2=0.898)(圖3)。

表1 血液學(xué)參數(shù)變化Table 1 Changes in hematological

A.homozygous GG; B.heterozygous GA; C.homozygous AA圖1 rs368698783位點(diǎn)Sanger測序結(jié)果Fig 1 Sanger sequencing result of the rs368698783

A.homozygous CC; B.heterozygous CT; C.homozygous TT圖2 rs7482144位點(diǎn)Sanger測序結(jié)果Fig 2 Sanger sequencing result of the rs7482144

圖3 rs368698783位點(diǎn)和rs7482144位點(diǎn)的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)圖Fig 3 Structure of the linkage disequilibrium at the rs368698783 and the rs7482144

2.3 β-地貧患者rs368698783與rs7482144位點(diǎn)基因多態(tài)性的檢測

NTDT患者的rs368698783與rs7482144位點(diǎn)的突變基因型檢出率顯著高于對照組(P<0.001)，TDT患者檢出率與對照組無差異(圖4)；rs368698783和rs7482144多態(tài)性位點(diǎn)最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)在NTDT組中顯著高于對照組(P<0.05)，TDT組中與對照組無差異(表2)；HbE純合樣本rs368698783與rs7482144位點(diǎn)的突變基因型檢出率均為95.0%，rs368698783和rs7482144多態(tài)性位點(diǎn)MAF在HbE純合組中均顯著高于對照組(P<0.001)(表3)。

2.4 rs368698783與rs7482144多態(tài)性位點(diǎn)與HbF水平的相關(guān)性研究

TDT組和NTDT組rs368698783位點(diǎn)突變等位基因與HbF水平的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如下(圖5)。NTDT組HbF水平高于TDT組(P<0.05)，在TDT組和NTDT組中rs368698783和rs7482144位點(diǎn)不同基因型的HbF水平均無差別。在NTDT組中攜帶rs368698783和rs7482144位點(diǎn)突變等位基因的樣本相較野生型而言HbF水平升高了14.07%，而在TDT組中HbF水平升高了5.22%。

A.detection rate of rs368698783 polymorphic loci; B.detection rate of rs7482144 polymorphic loci; *P<0.001 compared with control

表2 對照組與TDT組、NTDT組rs368698783與rs7482144位點(diǎn)MAF比較

表3 HbE純合組與對照組rs368698783與rs7482144位點(diǎn)MAF比較Table 3 Comparison of the MAF of rs368698783 and rs7482144 polymorphic loci between control and HbE groups

A.HbF expression levels in the TDT and NTDT groups; B.HbF expression levels of GA+AA and GG genotypes at rs368698783; C.HbF expression levels of CT+TT and CC genotypes at rs7482144

HbF>5%的樣本(包含βN/βN和βM/βN)的rs368698783與rs7482144位點(diǎn)的突變基因型檢出率顯著高于對照組(P<0.001) (圖6)；rs368698783和rs7482144多態(tài)性位點(diǎn)MAF在HbF>5%(βN/βN)組和HbF>5%(βM/βN)組中均顯著高于正常對照組(P<0.001) (表4)；HbF>5%(βN/βN)組兩位點(diǎn)MAF顯著高于HbF>5%(βM/βN)組(P<0.01) (表5)。

A.detection rate of rs368698783 polymorphic loci; B.detection rate of rs7482144 polymorphic loci; *P<0.001 compared with control

表4 對照組與HbF>5%(βN/βN)組、HbF>5%(βM/βN)組rs368698783與rs7482144位點(diǎn)MAF分布比較

表5 HbF>5%(βN/βN)組與HbF>5%(βM/βN)組rs368698783與rs7482144位點(diǎn)MAF分布比較

2.5 Gγ/Aγ珠蛋白基因相對表達(dá)量分析

在對照組(βN/βN)、β-地貧攜帶者(βM/βN)、β-地貧純合/復(fù)合雜合子(βM/βM)樣本中rs368698783突變能引起Gγ/Aγ珠蛋白基因表達(dá)比值升高(圖7)。在βM/βN組中檢測到1例rs368698783與rs7482144不連鎖樣本，rs368698783為野生型而rs7482144為雜合突變型，其Gγ/Aγ珠蛋白基因表達(dá)比值位于rs368698783野生型范圍內(nèi)，說明rs7482144位點(diǎn)單獨(dú)突變無法在mRNA水平改變γ-珠蛋白基因表達(dá)，rs368698783對于HbF水平的調(diào)控強(qiáng)于rs7482144位點(diǎn)。

*P<0.001, #P<0.001 compared with GG圖7 Gγ/Aγ mRNA的表達(dá)比值Fig 7 Ratio of Gγ/Aγ in mRNA levels

3 討論

HbF由HBG基因表達(dá)來調(diào)控，是胎兒期和新生兒時期的主要血紅蛋白。在健康人群中HbF高表達(dá)并無明顯的臨床意義，但是在存在β-珠蛋白基因突變的個體中，高水平的HbF可以補(bǔ)償合成缺少的β-珠蛋白鏈，有效緩解患者貧血癥狀，減輕臨床表現(xiàn)。

本研究對β-地貧患者和正常人群中基因多態(tài)性與HbF表達(dá)水平進(jìn)行比較，研究發(fā)現(xiàn)在NTDT患者中rs368698783與rs7482144位點(diǎn)突變等位基因攜帶率高，rs368698783的A等位基因與rs7482144的T等位基因可以提高HbF表達(dá)水平，這一結(jié)果與報道相似[3,6]。這兩個位點(diǎn)的突變引起HbF水平的升高可能是緩解β-地貧的貧血癥狀，減少輸血頻率的原因之一，rs368698783和rs7482144位點(diǎn)的突變等位基因可以對β-地貧的臨床表型起到一定的改善作用。

云南地區(qū)HbE的發(fā)生率高于全國其他地區(qū)，特別是德宏地區(qū)[10-11]，HbE純合子臨床表型可表現(xiàn)為無貧血到重度貧血[12]。本研究發(fā)現(xiàn)rs368698783的A等位基因和rs7482144的T等位基因與HbE突變的產(chǎn)生具有強(qiáng)相關(guān)性，這一結(jié)果與報道相符[3, 13]。因此在研究HbF水平與SNPs位點(diǎn)相關(guān)性時也需考慮是否存在HbE突變。在HbE/β-地貧患者中大多存在高水平的HbF，而HbE突變攜帶者中部分樣本也表現(xiàn)為HbF輕度升高，因此在對影響HbE/β-地貧患者HbF水平的相關(guān)因素的研究中，除了HBB突變導(dǎo)致的紅系壓力和rs368698783與rs7482144這兩個SNPs位點(diǎn)突變導(dǎo)致HbF表達(dá)水平升高外，可能還有其他調(diào)節(jié)HbF表達(dá)的因素。

rs7482144位點(diǎn)的T等位基因?qū)邮芰u基脲和沙利度胺治療的中間型β-地貧患者的HbF變化表現(xiàn)出良好的反應(yīng)，HbF水平的升高更加明顯[14-15]，攜帶rs7482144位點(diǎn)突變等位基因可以對臨床藥物表現(xiàn)出良好的效果。本研究發(fā)現(xiàn)rs368698783和rs7482144存在較強(qiáng)的連鎖不平衡性，并且rs368698783位點(diǎn)修飾效應(yīng)更強(qiáng)，因此rs368698783多態(tài)性位點(diǎn)可為β-地貧的治療提供理想藥物靶點(diǎn)，對臨床用藥進(jìn)行指導(dǎo)。

綜上所述，本研究通過對云南地區(qū)β-地貧患者HBG基因啟動子區(qū)的rs368698783及rs7482144位點(diǎn)多態(tài)性與HbF水平進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步證實(shí)并豐富了地中海貧血的遺傳修飾位點(diǎn)，為闡明地貧的分子病理機(jī)制、篩選藥物靶點(diǎn)和制定診療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。