曹寧，王文濤

1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院東關(guān)心腦血管?？撇^(qū)神經(jīng)外科，陜西 延安 716000；2.西北大學(xué)附屬醫(yī)院·西安市第三醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710021

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)發(fā)病率高，占兒童癌癥死亡率的15%，大多數(shù)兒童在診斷時(shí)已有轉(zhuǎn)移，且具有異質(zhì)性高、惡性程度高、生長迅速等特點(diǎn)，五年存活率不高，因此探索NB的干預(yù)方法，可提高患者生存率與生活質(zhì)量[1-2]。細(xì)胞遷移和侵襲行為是影響腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲對抑制腫瘤轉(zhuǎn)移有重要作用。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是內(nèi)源性非編碼小RNA，通過調(diào)節(jié)靶miRNA表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)，在多腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮作用，參與疾病發(fā)展進(jìn)程[3]。研究表明，多種miRNA在NB細(xì)胞的增殖遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用，miR-340為一種腫瘤抑制基因，可調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等[4]。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-340在肝癌組織和人肝癌細(xì)胞系中顯著降低，miR-340可降低肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，然而miR-340對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用尚不清楚。S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，SKP2)可特異性識(shí)別磷酸化的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑蛋白，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，研究表明上調(diào)SKP2的表達(dá)，促進(jìn)NB細(xì)胞增殖，并且SKP2是NB潛在的治療靶點(diǎn)[6]。研究顯示，MiR-339可靶向SKP2抑制肺癌系細(xì)胞增殖，而miR-340對SKP2是否有作用尚不明確[7]。因此，本研究旨在探索miR-340對細(xì)胞系神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)增殖、遷移及SKP2的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及癌旁組織標(biāo)本來源于2018年10月至2020年12月在延安大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的23例患者，手術(shù)前未經(jīng)放化療治療，標(biāo)本保存于-80℃保存。本研究所有患者知情并同意，經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；miR-340mimics、miR-340 NC、SKP2過表達(dá)質(zhì)粒(SKP2)及空載質(zhì)粒pcDNA、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000購自大連TaKaRa公司；miR-340、SKP2、U6、GADPH引物序列購自上海生工生物工程有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購于北京Solarbio公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL試劑購自Beyotime生物科技公司；兔抗人MMP9、MMP2單克隆抗體Abcam公司，小鼠抗人SKP2、β-actin單克隆抗體購自Proteintech公司，山羊抗兔lgG和山羊抗小鼠lgG購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 主要儀器 MiniAmp PCR儀購自美國ABI公司，MA100N型倒置顯微購自日本Nikon公司，二氧化碳培養(yǎng)箱、Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀購自美國ThermoFisher公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y與HUVEC在RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔兩天換液，培養(yǎng)至3～5代后，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔板中，待融合至80%左右，按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為對照組、miR-340過表達(dá)(miR-340 mimics)組、miR-340陰性對照組(negative control，NC)組、miR-340 mimics+pcDNA組及miR-340mimics+SKP2組，對照組不做轉(zhuǎn)染處理，其中miR-340 mimics與NC使用濃度為50 nmol/L，SKP2過表達(dá)質(zhì)粒(SKP2)及空載質(zhì)粒pcDNA使用濃度為20 nmol/L，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量(Real-time quantification PCR，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)檢測miR-340和SKP2 mRNA水平 采用RT-qPCR法檢測miR-340和SKP2 mRNA相對表達(dá)量，根據(jù)RNA提取試劑盒，提取總RNA，合成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用2-△△Ct法分別計(jì)算miR-340和SKP2 mRNA相對表達(dá)量。引物見表1。

表1 引物Table 1 Primers

1.3.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 通過CCK-8法檢測1.2.2各組SH-SY5Y細(xì)胞增殖情況，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將各組SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔板，待各組SH-SY5Y細(xì)胞長滿80%后，棄去培養(yǎng)液，用200μL移液器在6孔板中垂直劃痕，記錄劃痕初始狀態(tài)，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀察并計(jì)算遷移率。

1.3.6 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲 Transwell小室上室鋪好基質(zhì)膠以后，每個(gè)小室接種200μL各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液，下室加入完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，10%甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，隨機(jī)選擇6個(gè)視野顯微鏡觀察并拍照，計(jì)算平均侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3.7 WB檢測SKP2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 收集1.2.2各組SH-SY5Y細(xì)胞，加入2 mL RIPA細(xì)胞裂解液收集總蛋白，電泳后轉(zhuǎn)膜置0.45μm PVDF膜上，加入一抗SKP2、MMP-2、MMP-9和β-actin(按說明書進(jìn)行稀釋)，孵育過夜，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，ECL試劑顯色，分析條帶實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn) 根據(jù)基因預(yù)測軟件，SKP2是miR-340的靶基因，根據(jù)miR-340結(jié)合SKP2-3'UTR序列區(qū)域，構(gòu)建野生型SKP2-3'UTR-WT和突變型SKP2-3'UTR-MUT質(zhì)粒，分別與miR-340 NC、miR-340 mimics共轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞24 h，裂解細(xì)胞，檢測各組熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NB組織中miR-340和SKP2 mRNA的表達(dá)水平比較 與瘤旁組織比較，神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中miR-340表達(dá)水平降低，SKP2 mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和瘤旁組織的miR-340和SKP2表達(dá)水平比較(±s)Table 2 Comparison of miR-340 and SKP2 expression levels in neuroblastoma tissues and adjacent tissues(±s)

表2 神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和瘤旁組織的miR-340和SKP2表達(dá)水平比較(±s)Table 2 Comparison of miR-340 and SKP2 expression levels in neuroblastoma tissues and adjacent tissues(±s)

組別瘤旁組織神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織t值P值miR-340 1.05±0.15 0.55±0.08 14.105 0.001 SKP2 mRNA 1.01±0.11 1.96±0.20 19.960 0.001

2.2 各組細(xì)胞miR-340、SKP2 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 與對照組和miR-340 NC組比較，miR-340 mimics組細(xì)胞miR-340表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功；與miR-340 mimics組和miR-340 mimics+pcDNA組比較，miR-340 mimics+SKP2組SKP2 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)SKP2可逆轉(zhuǎn)miR-340對SKP2的抑制作用，見圖1。

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)驗(yàn)證miR-340與SKP2靶向關(guān)系 經(jīng)TargetScan Human數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，miR-340與SKP2 mRNA 3'UTR區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，與SKP2-3'UTR-WT+miR-340 NC組比較，SKP2-3'UTR-WT+miR-340 mimics組熒光素酶活性降低(P<0.05)，證明miR-340與SKP2存在靶向關(guān)系，見圖3。

圖2 miR-340與SKP2 mRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測Figure2 Prediction of miR-340 and SKP2 mRNA binding sites

圖3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)Figure3 Dual-luciferasereporter assay

2.4 miR-340 mimics轉(zhuǎn)染對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響 與對照組和miR-340 NC組比較，miR-340 mimics組SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明過表達(dá)miR-340明顯抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖；與miR-340 mimics+pcDNA組比較，miR-340 mimics+SKP2組細(xì)胞存活率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)SKP2可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-340對細(xì)胞的增殖抑制作用，見圖4。

圖4 各組細(xì)胞存活率Figure4 Cell survival rateof each group

2.5 各組SH-SY5Y細(xì)胞遷移能力比較 與對照組和miR-340 NC組比較，miR-340 mimics組細(xì)胞遷移率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)miR-340明顯抑制SH-SY5Y細(xì)胞遷移；與miR-340mimics+pcDNA組比較，miR-340 mimics+SKP2組細(xì)胞遷移率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)SKP2可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-340對細(xì)胞的遷移抑制作用，見圖5。

圖5 各組細(xì)胞遷移率Figure 5 Cell migration rateof each group

2.6 各組SH-SY5Y細(xì)胞侵襲能力比較 與對照組和miR-340 NC組比較，miR-340 mimics組SH-SY5Y細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)miR-340明顯抑制SH-SY5Y細(xì)胞遷移；與miR-340 mimics+pcDNA組比較，miR-340mimics+SKP2組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)SKP2可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-340對細(xì)胞的侵襲抑制作用，見圖6、圖7。

圖6 各組細(xì)胞侵襲圖片(100μm，×200)Figure6 Picturesof cell invasion in each group(100μm,×200)

圖7 各組細(xì)胞侵襲數(shù)Figure7 Number of cell invasionsin each group

2.7各組SH-SY5Y細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較 與對照組和miR-340 NC組比較，miR-340mimics組SH-SY5Y細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-340 mimics+pcDNA組比較，miR-340 mimics+SKP2組細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步提示過表達(dá)SKP2可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-340對細(xì)胞的遷移、侵襲抑制作用，見圖8。

圖8 各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況Figure8 Expression of MMP-2and MMP-9protein in cellsof each group

3 討論

NB是兒童常見的外周神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約70%患兒確診時(shí)已進(jìn)展到腫瘤轉(zhuǎn)移階段。目前常用的手術(shù)、放療、化療等，但該腫瘤極易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅兒童生命健康[8-9]，因此研究腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的分子機(jī)制，對于治療方法選擇及改善患者預(yù)后有重要意義[10]。

miRNAs可通過結(jié)合靶基因調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與遷移，與多種腫瘤形成和發(fā)展有關(guān)。已有報(bào)道顯示，miR-340在多種腫瘤組織與細(xì)胞中異常表達(dá)[11]。王妹興等[12]研究表明結(jié)腸癌組織中miR-340表達(dá)水平低于癌旁組織，且miR-340表達(dá)與腫瘤直徑、脈管侵犯、Ducks分期、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后有關(guān)。Das等[13]研究表明，miR-340在NB中下調(diào)表達(dá)，其異常表達(dá)在NB中發(fā)揮重要作用。本研究通過RT-qPCR檢測瘤旁組織NB組織中miR-340表達(dá)，結(jié)果顯示，NB組織中miR-340表達(dá)水平降低，與Das等[13]報(bào)道一致。有研究表明，miR-340在鱗狀細(xì)胞癌(SCC)組織及細(xì)胞中明顯低表達(dá)，抑制miR-340可促進(jìn)SCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[14]。另有研究顯示，miR-340-5p在喉癌組織及細(xì)胞中異常低表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-340-5p模擬物可明顯抑制細(xì)胞體外增殖并誘導(dǎo)其凋亡[15]。miR-340對SH-SY5Y細(xì)胞的影響還未見報(bào)道，本研究將miR-340 mimics轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，結(jié)果顯示，miR-340表達(dá)水平升高，提示轉(zhuǎn)染成功，本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-340可顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力，提示miR-340通過影響SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性、遷移及侵襲行為參與NB的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮抑癌基因的作用，然而miR-340在SH-SY5Y細(xì)胞的具體作用機(jī)制尚不清楚。

miRNA通過調(diào)控靶基因而影響機(jī)體生物學(xué)功能，本研究經(jīng)TargetScan Human數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-340與SKP2有靶向結(jié)合位點(diǎn)，且雙熒光素酶基因檢測報(bào)告顯示，miR-340與SKP2存在靶向關(guān)系。SKP2基因被認(rèn)為是一種原癌基因和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑，SKP2可通過降解細(xì)胞球蛋白(Cygb)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[16]。SKP2在甲狀腺癌、乳腺癌中均上調(diào)表達(dá)，發(fā)揮促癌的作用[17-18]。Li等[19]研究表明，SKP2顯著促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡蛋白4(PDCD4)磷酸化、泛素化和降解，SKP2通過抑制PDCD4促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)對DNA損傷的反應(yīng)。He等[20]研究表明，miR-186通過靶向SKP2抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究在SH-SY5Y細(xì)胞中過表達(dá)miR-340可明顯降低SKP2 mRNA及蛋白表達(dá)水平，表明miR-340可能通過下調(diào)SKP2表達(dá)發(fā)揮抗癌作用，而過表達(dá)SKP2可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-340對細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲的抑制作用，提示SKP2發(fā)揮促癌基因的作用，與在其他腫瘤中報(bào)道類似。因此，miR-340可能通過靶向調(diào)控SKP2表達(dá)參與NB的發(fā)生發(fā)展。本研究只選擇一種細(xì)胞系對miR-340的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，其具體作用機(jī)制將選擇多種細(xì)胞系或結(jié)合動(dòng)物模型做更深入研究。

綜上所述，神經(jīng)母細(xì)胞瘤中miR-340低表達(dá)，過表達(dá)miR-340可通過靶向下調(diào)SKP2表達(dá)，抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，為NB的分子靶向治療提供一種思路。