楊娟，張厚芬，吳松，陳瑩，羅華榮

糖尿病腎?。―KD）是一種嚴(yán)重的慢性糖尿病并發(fā)癥［1］。腎小管細(xì)胞損傷是DKD的主要特征之一［2］。研究表明，高血糖可產(chǎn)生過(guò)量活性氧（ROS），促進(jìn)腎細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加，腎小管損傷［3-4］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）Opa相互作用蛋白5-反義轉(zhuǎn)錄物1（OIP5-AS1）是腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［5-6］。研究顯示，lncRNA OIP5-AS1與糖尿病相關(guān)疾病如妊娠期糖尿?。?］、糖尿病心肌?。?］、糖尿病性視網(wǎng)膜病變［9］的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。在DKD小鼠腎組織和高糖刺激的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮HK-2細(xì)胞中，lncRNA OIP5-AS1表達(dá)增加，可誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎纖維化［10］。然而，其在DKD中的作用機(jī)制仍未闡明。lncRNA可作為miRNA的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA充當(dāng)miRNA海綿來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究證實(shí)lncRNA OIP5-AS1可靶向調(diào)節(jié)miR-25-3p［11］。miR-25-3p在DKD中下調(diào)，可作為DKD的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［12］。性別決定區(qū)Y框蛋白4（SOX4）是一種糖尿病易感基因，也是miR-25-3p的下游靶標(biāo)［13］，其高表達(dá)與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)［14-15］。然而，lncRNA OIP5-AS1、miR-25-3p和SOX4在DKD進(jìn)展中的關(guān)系尚不明確。本研究旨在探討lncRNA OIP5-AS1能否通過(guò)miR-25-3p/SOX4軸調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich；miR-25-3p模擬物（miR-25-3p mimic）、miR-25-3p抑制劑（miR-25-3p inhibitor）、陰性對(duì)照（miR-NC、inhibitor-NC），lncRNA OIP5-AS1小干擾RNA（si-OIP5-AS1）及其陰性對(duì)照（si-NC）均由上海GenePharma合成；胎牛血清（FBS）、CCK-8試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol、PrimeScript RT試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；ROS檢測(cè)試劑盒（DCFH-DA熒光探針?lè)ǎ┵?gòu)自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔源胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、裂解的Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔源B細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、SOX4和GAPDH一抗購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。HERAcell 240i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；iMark680多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；DeNovix DS-11分光光度計(jì)（美國(guó)DeNovix公司）；Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）儀（美國(guó)Stratagene公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HK-2細(xì)胞用含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合后，將HK-2細(xì)胞暴露于含有5.5 mmol/L葡萄糖（正常葡萄糖組，NG組）或30 mmol/L葡萄糖（高糖組，HG組）的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中處理48 h［16］。預(yù)實(shí)驗(yàn)采用綠色熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)染試劑對(duì)HK-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示各組轉(zhuǎn)染效率為70%~80%。將HK-2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到6孔板中，并在含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分為NG組、HG組、HG+si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、HG+si-OIP5-AS1組（轉(zhuǎn)染si-OIP5-AS1）、HG+miR-NC組（用miR-NC轉(zhuǎn)染）、HG+miR-25-3p組（用miR-25-3p mimic轉(zhuǎn)染）、HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組（轉(zhuǎn)染si-OIP5-AS1和inhibitor-NC）、HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組（轉(zhuǎn)染si-OIP5-AS1和miR-25-3p inhibitor）。使用Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，收集細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2 qPCR檢測(cè)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA OIP5-AS1、miR-25-3p和SOX4 mRNA 使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并通過(guò)SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒在Mx3005P RT-qPCR儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系（20μL）：cDNA 2μL，SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10μL，上、下游引物各0.4μL，ddH2O 7.2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。使用GAPDH（lncRNA OIP5-AS1和SOX4）和U6（miR-25-3p）作為內(nèi)部參考，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物及序列見(jiàn)表1。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組HK-2細(xì)胞以2×104個(gè)/mL的密度接種在96孔板中，每孔100μL。將細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8溶液10μL，并在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 LDH活性測(cè)定 收集10μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過(guò)LDH細(xì)胞毒性測(cè)定試劑盒檢測(cè)LDH釋放，使用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)量吸光度，計(jì)算LDH活性。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR的引物序列

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況 將HK-2細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，并與200μL 1×binding buffer（包含5μL Annexin V-FITC和5μL PI）在黑暗中孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 MDA水平和SOD、CAT活性檢測(cè) 使用細(xì)胞裂解液裂解HK-2細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)用于硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA水平，水溶性四唑鹽-1（WST-1）法檢測(cè)SOD，紫外吸收法檢測(cè)CAT活性。MDA、SOD和CAT分別用酶標(biāo)儀在532、520和240 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。

1.2.7 DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 將HK-2細(xì)胞用含有終濃度為10μmol/L DCFH-DA熒光探針的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。將細(xì)胞在4℃下用4%多聚甲醛固定10 min，熒光顯微鏡下觀察染色細(xì)胞，并于485 nm激發(fā)和538 nm發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量熒光強(qiáng)度。每組平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組的比值代表ROS水平。

1.2.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中SOX4、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3和Caspase-3蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液裂解細(xì)胞以提取蛋白質(zhì)，然后通過(guò)二辛可寧酸測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將總蛋白（每泳道50μg）加載到10%SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分析，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后與兔抗人SOX4（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、Caspase-3（1∶500）、Cleaved-Caspase-3（1∶500）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶2 000）在4℃下孵育過(guò)夜。隨后，將膜與HRP偶聯(lián)的山羊抗兔lgG二抗（1∶2 000）在室溫下孵育1 h。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）系統(tǒng)觀察膜上的蛋白質(zhì)條帶，并使用Image J軟件進(jìn)行分析。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，通過(guò)與內(nèi)參的灰度比，得出目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用StarBase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù)測(cè)miR-25-3p與lncRNA OIP5-AS1和SOX4的結(jié)合位點(diǎn)；進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定確認(rèn)lncRNA OIP5-AS1和miR-25-3p之間的結(jié)合，以及miR-25-3p和SOX4之間的結(jié)合。將含有miR-25-3p結(jié)合序列的lncRNA OIP5-AS1或SOX4的野生型（WT）和突變型（MUT）片段擴(kuò)增并亞克隆到pGL4.10熒光素酶報(bào)告載體中，以構(gòu)建新的熒光素酶載體（WT-OIP5-AS1、MUTOIP5-AS1、WT-SOX4和MUT-SOX4）。取HK-2細(xì)胞接種于24孔板（1×105個(gè)/孔）中，并在轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)至80%匯合。使用Lipofectamine 3000將miR-25-3p mimic或miR-NC和上述重組熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染到HK-2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物中的螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶活性。螢火蟲(chóng)熒光素酶活性被標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA OIP5-AS1、miR-25-3p和SOX4 mRNA水平比較 與NG組相比，HG組lncRNA OIP5-AS1和SOX4 mRNA水平升高，miR-25-3p水平降低（P＜0.05）；與HG組、HG+si-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1組lncRNA OIP5-AS1和SOX4 mRNA水平降低，miR-25-3p水平升高（P＜0.05）；與HG組、HG+miR-NC組相比，HG+miR-25-3p組miR-25-3p水平升高，SOX4 mRNA水平降低（P＜0.05）；與HG+si-OIP5-AS1組、HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組miR-25-3p水平降低，SOX4 mRNA水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of lncRNA OIP5-AS1,miR-25-3p and SOX4 mRNA levels between the eight groups表2各組lncRNA OIP5-AS1、miR-25-3p和SOX4 mRNA水平比較 （n=3，）

Tab.2 Comparison of lncRNA OIP5-AS1,miR-25-3p and SOX4 mRNA levels between the eight groups表2各組lncRNA OIP5-AS1、miR-25-3p和SOX4 mRNA水平比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與NG組相比，b與HG組相比，c與HG+si-NC組相比，d與HG+si-OIP5-AS1組相比，e與HG+miR-NC組相比，f與HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組相比，P＜0.05；表3~6同。

組別NG組HG組HG+si-NC組HG+si-OIP5-AS1組HG+miR-NC組HG+miR-25-3p組HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組F lncRNA OIP5-AS1 1.00±0.00 3.25±0.41a 3.40±0.38 1.56±0.25bc 3.37±0.42 3.12±0.39 1.48±0.23 miR-25-3p 1.00±0.00 0.37±0.06a 0.34±0.05 0.82±0.10bc 0.35±0.06 0.85±0.09be 0.86±0.10 SOX4 mRNA 1.00±0.00 4.05±0.52a 4.11±0.49 2.26±0.30bc 4.08±0.54 2.15±0.28be 2.20±0.36 1.61±0.27b 0.40±0.05df 3.74±0.42df 30.168＊＊47.386＊＊26.692＊＊

2.2 各組細(xì)胞活力和LDH活性比較 與NG組相比，HG組細(xì)胞活力降低，LDH活性升高（P＜0.05）；與HG組、HG+si-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1組細(xì)胞活力升高，LDH活性降低（P＜0.05）；與HG組、HG+miR-NC組相比，HG+miR-25-3p組細(xì)胞活力升高，LDH活性降低（P＜0.05）；與HG+si-OIP5-AS1組、HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組細(xì)胞活力降低，LDH活性升高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.3 Comparison of cell viability,LDH activity and apoptosis rate between the eight groups表3 各組細(xì)胞活力、LDH活性和凋亡率比較（n=3

Tab.3 Comparison of cell viability,LDH activity and apoptosis rate between the eight groups表3 各組細(xì)胞活力、LDH活性和凋亡率比較（n=3

組別NG組HG組HG+si-NC組HG+si-OIP5-AS1組HG+miR-NC組HG+miR-25-3p組HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組F細(xì)胞活力（%）100.00±0.00 39.32±6.05a 36.81±5.74 71.40±8.62bc 37.65±5.94 74.33±9.15be 72.92±8.76 LDH（U/L）116.25±18.83 304.17±32.50a 312.80±33.26 145.35±20.49bc 308.17±31.36 139.65±19.04be 140.80±22.75凋亡率（%）4.39±0.76 25.08±3.10a 27.12±3.39 14.50±2.08bc 26.45±2.93 12.87±1.86be 13.29±1.92 45.08±6.35df 269.42±30.28df 21.64±2.45df 34.194＊＊32.929＊＊33.303＊＊

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 與NG組相比，HG組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與HG組、HG+si-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與HG組、HG+miR-NC組相比，HG+miR-25-3p組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與HG+si-OIP5-AS1組、HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖1。

2.4 各組MDA水平和SOD、CAT活性比較 與NG組相比，HG組SOD和CAT活性降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與HG組、HG+si-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1組SOD和CAT活性顯著升高，MDA水平降低（P＜0.05）；與HG組、HG+miR-NC組相比，HG+miR-25-3p組SOD和CAT活性顯著升高，MDA水平降低（P＜0.05）；與HG+si-OIP5-AS1組、HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組SOD和CAT活性顯著降低，MDA水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表4。

2.5 各組細(xì)胞中ROS水平比較 與NG組相比，HG組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高（P＜0.05）；與HG組、HG+si-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1組細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低（P＜0.05）；與HG組、HG+miR-NC組相比，HG+miR-25-3p組細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低（P＜0.05）；與HG+si-OIP5-AS1組、HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖2。

Fig.1 Flow cytometry detection of apoptosis levels in each group圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平

Tab.4 Comparison of MDA,ROS,SOD and CAT activities between the eight groups of cells表4各組細(xì)胞中MDA、ROS水平和SOD、CAT活性比較 （n=3

Tab.4 Comparison of MDA,ROS,SOD and CAT activities between the eight groups of cells表4各組細(xì)胞中MDA、ROS水平和SOD、CAT活性比較 （n=3

組別NG組HG組HG+si-NC組HG+si-OIP5-AS1組HG+miR-NC組HG+miR-25-3p組HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組F MDA（μmol/L）5.85±1.02 24.63±2.94a 27.51±3.12 13.28±2.07bc 25.49±3.35 11.60±1.98be 12.32±2.02 21.15±2.36df 31.316＊＊SOD（U/mL）39.26±5.11 13.60±2.24a 12.85±2.13 27.36±3.29bc 13.18±2.30 29.54±4.12be 28.90±3.67 16.35±2.49df 26.829＊＊CAT（U/mL）1.37±0.15 0.45±0.08a 0.39±0.06 0.92±0.13bc 0.42±0.07 1.03±0.14be 0.96±0.11 0.52±0.08df 34.017＊＊ROS（%）100.00±0.00 315.42±38.90a 320.16±35.54 174.25±26.12bc 318.30±39.37 163.24±21.08be 170.81±24.15 285.64±32.90df 26.143＊＊

Fig.2 Cellular ROS levels in each group(DCFH-DA,bar scale=20μm)圖2 各組細(xì)胞ROS水平（DCFH-DA，比例尺=20μm）

2.6 各組中SOX4、Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3和Caspase-3蛋白水平比較 與NG組相比，HG組Bcl-2蛋白水平降低，SOX4、Bax蛋白水平和Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值升高（P＜0.05）；與HG組、HG+si-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1組Bcl-2蛋白水平升高，SOX4、Bax蛋白水平和Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值降低（P＜0.05）；與HG組、HG+miR-NC組相比，HG+miR-25-3p組Bcl-2蛋白水平升高，SOX4、Bax蛋白水平和Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值降低（P＜0.05）；與HG+si-OIP5-AS1組、HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組相比，HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組Bcl-2蛋白水平降低，SOX4、Bax蛋白水平和Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表5。

Fig.3 Expression levels of SOX4,Caspase-3,Cleaved-Caspase-3,Bcl-2 and Bax in each group of cells圖3 各組細(xì)胞中SOX4、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果 使用Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-25-3p包含lncRNA OIP5-AS1的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4A。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC相比，轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimic后，含有WT-OIP5-AS1質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（t=13.362，P＜0.01），而含有MUTOIP5-AS1質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性未受影響（t=0.106，P＞0.05），見(jiàn)圖4B。使用Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-25-3p包含SOX4的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4C。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miRNC相比，轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimic后，含有WT-SOX4質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（t=18.706，P＜0.01），而含有MUT-SOX4質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性未受影響（t=0.350，P＞0.05），見(jiàn)圖4D。

Fig.4 Target gene prediction and luciferase activity in cells圖4 靶基因預(yù)測(cè)和細(xì)胞中的熒光素酶活性

Tab.5 Comparison of protein levels of SOX4,Caspase-3,Cleaved-Caspase-3,Bcl-2 and Bax between the eight groups of cells表5 各組細(xì)胞中SOX4、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平比較 （n=3）

Tab.5 Comparison of protein levels of SOX4,Caspase-3,Cleaved-Caspase-3,Bcl-2 and Bax between the eight groups of cells表5 各組細(xì)胞中SOX4、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平比較 （n=3）

組別NG組HG組HG+si-NC組HG+si-OIP5-AS1組HG+miR-NC組HG+miR-25-3p組HG+si-OIP5-AS1+inhibitor-NC組HG+si-OIP5-AS1+miR-25-3p inhibitor組F SOX4 0.13±0.02 0.50±0.06a 0.54±0.07 0.23±0.04bc 0.52±0.06 0.20±0.03be 0.21±0.04 0.45±0.05df 36.323＊＊Cleaved-Caspase-3/Caspase-3 0.20±0.04 0.72±0.08a 0.75±0.09 0.34±0.05bc 0.73±0.08 0.30±0.05be 0.32±0.04 0.65±0.07df 37.743＊＊Bcl-2 0.48±0.06 0.16±0.03a 0.13±0.02 0.37±0.05bc 0.15±0.02 0.40±0.04be 0.39±0.05 0.21±0.03df 35.622＊＊Bax 0.15±0.02 0.63±0.07a 0.65±0.08 0.28±0.04bc 0.64±0.07 0.25±0.04be 0.27±0.04 0.56±0.06df 42.279＊＊

3 討論

DKD是一種高血糖驅(qū)動(dòng)的以腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡為特征的疾?。?-4］。DKD常導(dǎo)致腎功能衰竭，但目前尚無(wú)有效的治療方法，因此,尋找新的DKD治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡是參與DKD高血糖損傷的重要機(jī)制［17］。持續(xù)的高血糖可導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加，內(nèi)源性抗氧化劑無(wú)法將其完全清除，導(dǎo)致MDA產(chǎn)生和細(xì)胞損傷［3-4］。SOD和CAT作為重要的抗氧化防御系統(tǒng)，在DKD中的表達(dá)降低［18］。此外，Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制因子，Bax不僅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能［19］。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，通常以非活性形式（酶原）存在于細(xì)胞質(zhì)中。Cleaved-Caspase-3是Caspase-3的活化形式，Caspase-3一旦被激活，能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆地走向死亡［20］。Chen等［4］研究證實(shí)，將HK-2細(xì)胞與30 mmol/L葡萄糖孵育，可有效模擬氧化應(yīng)激引起的腎損傷。在本研究中，在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性、細(xì)胞凋亡增加，MDA和Bax蛋白水平、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3比值升高，SOD、CAT活性和Bcl-2蛋白水平降低，表明細(xì)胞活力降低和氧化應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，因此靶向氧化應(yīng)激有望對(duì)抗DKD腎小管上皮損傷。

lncRNA OIP5-AS1可調(diào)節(jié)多種生理功能，研究證明其與DKD等糖尿病相關(guān)疾病的進(jìn)展有關(guān)［7-10］。本研究使用高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)lncRNA OIP5-AS1的表達(dá)水平顯著高于正常葡萄糖組，而miR-25-3p水平顯著降低。采用小分子干擾技術(shù)敲低lncRNA OIP5-AS1表達(dá)后，miR-25-3p水平升高，同時(shí)細(xì)胞活力和抗氧化能力增強(qiáng)，且高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)生減少，表明敲低lncRNA OIP5-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用；過(guò)表達(dá)miR-25-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的影響與敲低lncRNA OIP5-AS1的作用一致。Fu等［10］發(fā)現(xiàn)，lncRNA OIP5-AS1在高糖刺激的HK-2細(xì)胞中負(fù)調(diào)控miR-30c-5p的表達(dá)。Gholaminejad等［12］發(fā)現(xiàn)，miR-25-3p在DKD中下調(diào)。這些研究表明lncRNA OIP5-AS1、miR-25-3p可能通過(guò)某種途徑影響DKD的進(jìn)展。

lncRNA與miRNA、mRNA之間的相互調(diào)控已成為近年來(lái)生物信息學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。有研究報(bào)道，miRNA通過(guò)與靶mRNA的特異性堿基配對(duì)可以沉默mRNA的表達(dá)，然后lncRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA與miRNA結(jié)合，進(jìn)一步參與mRNA表達(dá)的調(diào)控［21-22］。本研究中，lncRNA OIP5-AS1在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中呈高表達(dá)，而miR-25-3p的表達(dá)降低，這與既往研究結(jié)果相似［10，12］。因此，推測(cè)lncRNA OIP5-AS1可能通過(guò)特定位點(diǎn)與miR-25-3p結(jié)合來(lái)降低其表達(dá)水平。筆者檢索StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)在lncRNA OIP5-AS1的3′非編碼區(qū)（3′-UTR）存在與miR-25-3p的結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證此推測(cè)，本研究在使用si-OIP5-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲低lncRNA OIP5-AS1表達(dá)的同時(shí)，將miR-25-3p inhibitor也轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，結(jié)果顯示，下調(diào)miR-25-3p可明顯減弱敲低lncRNA OIP5-AS1對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用；且雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果證實(shí)lncRNA OIP5-AS1是靶向miR-25-3p的調(diào)節(jié)分子，提示lncRNA OIP5-AS1可能通過(guò)靶向抑制miR-25-3p的表達(dá)，影響高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡。

為研究miR-25-3p參與調(diào)控高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-25-3p的靶基因進(jìn)行深入分析，結(jié)果表明SOX4的3′-UTR可以與miR-25-3p相互作用。SOX4屬于SOX轉(zhuǎn)錄因子家族。Yang等［23］研究顯示，高糖可上調(diào)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中SOX4水平，下調(diào)其表達(dá)可抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變。本研究結(jié)果顯示，在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷模型中，SOX4 mRNA和蛋白水平均升高，敲低lncRNA OIP5-AS1表達(dá)和上調(diào)miR-25-3p的表達(dá)時(shí)均發(fā)現(xiàn)SOX4表達(dá)降低；而且在敲低lncRNA OIP5-AS1的基礎(chǔ)上，利用miR-25-3p inhibitor下調(diào)miR-25-3p后，SOX4的表達(dá)水平較lncRNA OIP5-AS1敲低組明顯升高。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明，miR-25-3p mimic可以抑制WT-SOX4載體的熒光素酶活性，而對(duì)MUT-SOX4載體的熒光素酶活性沒(méi)有影響，提示miR-25-3p可靶向調(diào)節(jié)SOX4，miR-25-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的調(diào)控作用可能與靶向調(diào)節(jié)SOX4表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，lncRNA OIP5-AS1敲低可抑制高糖處理腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激，增加細(xì)胞活力，lncRNA OIP5-AS1可能通過(guò)miR-25-3p/SOX4軸促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。在未來(lái)的研究中，將分析lncRNA OIP5-AS1在DKD動(dòng)物模型中的功能，進(jìn)一步明確lncRNA OIP5-AS1在DKD中的調(diào)控機(jī)制。此外，lncRNA OIP5-AS1在DKD患者臨床標(biāo)本中的表達(dá)譜也是未來(lái)研究的重點(diǎn)，將有助于闡明lncRNA OIP5-AS1在臨床DKD診斷與治療中的應(yīng)用價(jià)值。