李麗 何宇 劉鍇 王萍

肝臟是體內(nèi)具有較強(qiáng)再生修復(fù)能力的器官，既可通過成熟肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞直接進(jìn)入細(xì)胞周期完成肝臟的再生修復(fù)，也可以通過肝臟干/前體細(xì)胞成熟分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞完成再生修復(fù)[1]。在慢性肝臟疾病中，反復(fù)的肝細(xì)胞損傷修復(fù)過程導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖能力耗竭，起源于終末膽管的肝臟干/前體細(xì)胞被活化，并成為主導(dǎo)肝臟再生修復(fù)的主要細(xì)胞類型[2-4]。因此，探討肝細(xì)胞增殖能力被抑制的情況下肝臟干/前體細(xì)胞主導(dǎo)的再生修復(fù)過程，有助于進(jìn)一步揭示慢性肝病情況下肝臟的損傷修復(fù)的細(xì)胞分子機(jī)制。

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid-induced TNF receptor, GITR)主要表達(dá)于活化的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，GITR是效應(yīng)T淋巴細(xì)胞活化的一個(gè)標(biāo)志物，GITR與其配體(GITR ligand, GITRL)結(jié)合可作為協(xié)同刺激信號促進(jìn)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌[5-7]。在CB17/Icr+/+ Jcl小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞卒中模型中，GITR活化后通過提高促炎性細(xì)胞因子的水平，加重腦卒中后缺血性損傷程度，抑制GITR的表達(dá)可以提高腦卒中后神經(jīng)前體細(xì)胞的存活[8]。此外，GITR在C57BL/6小鼠單純皰疹病毒1型感染以及Sv129小鼠卡拉膠致急性肺炎模型中的表達(dá)也上調(diào)[9,10]。而關(guān)于GITR/GITRL在肝臟中的研究主要集中在肝移植術(shù)后、基因治療后的患者免疫耐受與肝臟腫瘤的免疫治療方面[11-13]，在肝臟再生修復(fù)過程中表達(dá)GITR的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的變化情況尚不清楚。本研究采用經(jīng)典的肝臟前體細(xì)胞活化模型——2-乙酰氨基芴聯(lián)合部分肝切除(2-acetylaminofluorene and partial hepatectomy, AAF/PH)模型，利用AAF有效阻斷肝細(xì)胞增殖進(jìn)而活化肝臟前體細(xì)胞，觀察前體細(xì)胞主導(dǎo)的肝臟再生修復(fù)過程中效應(yīng)T淋巴細(xì)胞比例的變化情況和GITR陽性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞比例的變化情況。

材料和方法

一、主要材料

6～8周齡雄性無特殊病原體(SPF)級的C57BL/6J小鼠20只，體質(zhì)量(22.0±2.0)g，購自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，AAF購自美國Sigma公司。免疫熒光所用抗原封閉液購自美國Agilient Technologies公司，免疫熒光和免疫印跡用Sox9抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗兔IgG抗體購自美國Invitrogen公司，化學(xué)發(fā)光液購自德國Millipore公司。組織細(xì)胞分離所用的膠原酶D、DNaseI購自瑞士羅氏公司，Percoll、4%多聚甲醛購自北京索萊寶科技有限公司，紅細(xì)胞裂解液、TruStain fcXTM、BV421標(biāo)記CD45抗體、PE-CY7標(biāo)記CD3抗體、PerCP5.5標(biāo)記CD4抗體、APC-Cy7標(biāo)記CD8抗體、APC標(biāo)記GITR抗體購自美國BioLegend公司。

二、小鼠AAF/PH動(dòng)物模型制備

將AAF溶解于含10%乙醇的玉米油中，濃度為3 mg/mL，實(shí)驗(yàn)組小鼠連續(xù)5 d按30 mg/kg的劑量灌胃，對照組小鼠用相同體積玉米油灌胃。第6天實(shí)施肝部分切除術(shù)，1%的戊巴比妥鈉按50 mg/kg的劑量對小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后取腹部正中切口，在距離肝門2～3 mm處結(jié)扎并切除肝左外側(cè)葉，保留中間葉、尾狀葉和右側(cè)葉，做1/3部分肝切除。術(shù)后繼續(xù)用30 mg/kg的AAF灌胃，分別于術(shù)后7 d、14 d處死小鼠，收取肝組織。

HE染色：將肝組織石蠟切片依次放入二甲苯和梯度酒精中脫蠟至水后，依次用蘇木素、伊紅進(jìn)行細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色，將切片依次放入梯度酒精和二甲苯中脫水透明，中性樹膠封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

天狼星紅染色：將肝組織石蠟切片依次放入二甲苯和梯度酒精中脫蠟至水后，放入天狼猩紅染液中染色8 min。將切片依次放入梯度酒精和二甲苯中脫水透明，中性樹膠封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

免疫熒光染色：石蠟包埋切片于70℃烤箱中1 h后，依次置于二甲苯、無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、PBS中脫蠟水化。加入檸檬酸抗原修復(fù)液(pH=6.0)于高壓鍋中進(jìn)行抗原熱修復(fù)。待冷卻后用PBS洗去抗原修復(fù)液，滴加抗原封閉液室溫封閉20 min，滴加Sox9抗體(用抗體稀釋液按1∶200倍配制)后于4℃孵育過夜。0.1%PBST洗次切片3后，加入Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗兔IgG抗體(用抗體稀釋液按1∶600倍配制)室溫孵育20 min，0.1%PBST洗去抗體后滴加含DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

三、蛋白印跡檢測Sox9蛋白的表達(dá)

Sox9蛋白是肝臟前體細(xì)胞特異性標(biāo)志物[14]。取小鼠肝組織稱重后剪碎，按10 mg/mL加入適量蛋白裂解液，勻漿器勻漿以提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按每孔7 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后用390 mA恒流電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜經(jīng)含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，兔抗Sox9抗體(1∶2000倍稀釋)或小鼠抗GAPDH抗體(1∶2000倍稀釋)4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次后，對應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶3000倍稀釋)室溫孵育1 h后，TBST洗膜3次，加入顯色液顯影，應(yīng)用伯樂分子成像儀ChemiDoc XRS+(美國)的Image Lab軟件(版本3.0)拍照。

四、流式細(xì)胞術(shù)檢測肝臟組織浸潤炎癥細(xì)胞

GITR是效應(yīng)T淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)志[15]。小鼠處死后，0.9%氯化鈉原位灌注至肝臟呈暗黃色以去除血液細(xì)胞，將肝組織剪成小塊重懸于含0.01%膠原酶D和0.001% DNase I的消化液中，勻漿器勻漿后于37℃水浴中消化35 min，80 目濾網(wǎng)過濾后加入含2%胎牛血清的PBS終止酶的消化作用。50×g離心5 min去除肝細(xì)胞沉淀后，上清液經(jīng)2000 r/min離心5 min，將細(xì)胞沉淀重懸于30% Percoll密度梯度離心液中，2000 r/min離心5 min獲得非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。加入紅細(xì)胞裂解液冰浴裂解紅細(xì)胞，再加入PBS終止反應(yīng)，2000 r/min離心5 min后棄上清，將細(xì)胞沉淀打散加入小鼠TruStain fcXTM防止非特異性染色后，再加入BV421標(biāo)記CD45抗體、PE-CY7標(biāo)記CD3抗體、PerCP5.5標(biāo)記CD4抗體、APC-Cy7標(biāo)記CD8抗體、APC標(biāo)記GITR抗體于4℃中染色30 min，使用MACS Buffer洗細(xì)胞一次后加入1%多聚甲醛固定細(xì)胞，應(yīng)用BD FACS AriaII流式細(xì)胞儀(美國)檢測，F(xiàn)lowJo流式分析軟件分析。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、AAF/PH損傷后肝組織的病理變化

C57BL/6J小鼠在AAF/PH造模后，隨著術(shù)后恢復(fù)時(shí)間增加，肝中間葉體積顯著增大，肝右葉以及尾狀葉體積輕度增大。對照組小鼠(n=3)肝臟重量為(0.95±0.08)g，實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后7 d(n=4)肝臟重量為(0.90±0.08)g，術(shù)后14 d(n=5)肝臟重量為(0.96±0.05)g，與對照組小鼠相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與此同時(shí)，對照組小鼠肝臟與體重比為(4.20±0.40)%，術(shù)后7 d、14 d分別為(4.29±0.46)%、(4.37±0.17)%，與對照組小鼠相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。HE染色結(jié)果顯示，AAF/PH術(shù)后7 d肝組織內(nèi)未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，術(shù)后14 d，匯管區(qū)出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。天狼星紅染色結(jié)果顯示術(shù)后7 d肝組織中無明顯細(xì)胞外基質(zhì)沉積，而術(shù)后14 d匯管區(qū)周圍出現(xiàn)明顯的細(xì)胞外基質(zhì)沉積。見圖1。

圖1 小鼠AAF/PH模型肝組織的病理變化 A：對照組小鼠(HE)；B：實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后7 d(HE)；C：實(shí)驗(yàn)組小鼠術(shù)后14 d；D：對照組小鼠(PSR)；E：實(shí)驗(yàn)組小鼠(PSR)；F：實(shí)驗(yàn)組小鼠(PSR)

二、AAF/PH模型活化肝臟前體細(xì)胞

肝組織免疫熒光染色顯示與對照組小鼠(n=3)相比，PH術(shù)后7 d(n=4)、14 d(n=5)時(shí)，Sox9+細(xì)胞數(shù)量呈明顯的時(shí)間依賴性增加(圖2A)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果也顯示PH術(shù)后7 d、14 d時(shí)，Sox9表達(dá)亦顯著增加(圖2B)，表明AAF/PH模型活化了肝臟前體細(xì)胞。

圖2 小鼠AAF/PH模型活化肝臟前體細(xì)胞 A. 肝組織免疫熒光染色示Sox9+細(xì)胞數(shù)量呈時(shí)間依賴性增加；B. 蛋白印跡示Sox9表達(dá)量在術(shù)后14 d明顯增加

三、AAF/PH肝再生模型中CD8+ T淋巴細(xì)胞比例顯著增加

利用膠原酶消化和Percoll密度梯度離心的方法獲得肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)多色免疫熒光染色與流式分析結(jié)果顯示，與對照組小鼠(n=3)相比，PH術(shù)后7 d(n=4)時(shí)，CD4+T淋巴細(xì)胞(CD45+CD3+CD4+)和CD8+T淋巴細(xì)胞(CD45+CD3+CD8+)占CD3+T淋巴細(xì)胞(CD45+CD3+)的比例均沒有明顯變化，CD8+T淋巴細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞的相對比例也沒有明顯變化(P=0.3541)；術(shù)后14 d(n=5)時(shí)，CD8+T淋巴細(xì)胞占CD3+T淋巴細(xì)胞的比例明顯增加(P=0.0289)，而CD4+T淋巴細(xì)胞占CD3+T淋巴細(xì)胞的比例仍無明顯變化(P=0.1250)，CD8+T淋巴細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞的相對比例亦沒有明顯變化(P=0.0874)，見表1，表明CD8+T淋巴細(xì)胞是參與AAF/PH模型肝臟再生修復(fù)過程的重要淋巴細(xì)胞亞群。

表1 小鼠AAF/PH模型中CD8+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例變化情況(±s)

四、GITR在AAF/PH肝再生中表達(dá)上調(diào)

流式分析結(jié)果顯示，與對照組小鼠(n=3)相比，CD8+T淋巴細(xì)胞中GITR的陽性率在PH術(shù)后7 d(n=4)時(shí)顯著增加(P=0.0098)，在術(shù)后14 d(n=5)時(shí)顯著下降(P= 0.0427)(圖4)；而CD4+T淋巴細(xì)胞中GITR陽性率在PH術(shù)后7 d時(shí)沒有明顯變化(P=0.1037)，術(shù)后14 d時(shí)GITR陽性率顯著下降(P=0.0225)，見表2。

表2 小鼠AAF/PH模型中CD8+、CD4+T淋巴細(xì)胞GITR陽性率變化情況(±s)

討 論

肝臟再生修復(fù)過程是由免疫系統(tǒng)主導(dǎo)的，由多種細(xì)胞因子和生長因子調(diào)控的復(fù)雜過程。本研究利用抑制肝細(xì)胞增殖以活化前體細(xì)胞的AAF/PH小鼠肝臟再生模型研究發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞是參與活化前體細(xì)胞的肝臟再生修復(fù)的重要淋巴細(xì)胞亞群，且其活化標(biāo)志物GITR的表達(dá)隨時(shí)間呈先升高再降低的變化趨勢。盡管前體細(xì)胞主導(dǎo)的肝臟再生修復(fù)過程中CD4+T淋巴細(xì)胞占T淋巴細(xì)胞的比例沒有顯著變化，但是在匯管區(qū)纖維化出現(xiàn)時(shí)GITR陽性、活化CD4+T淋巴細(xì)胞比例顯著下降。

肝臟前體細(xì)胞的活化過程伴隨著肝臟的炎癥細(xì)胞浸潤，肝臟中T淋巴細(xì)胞顯著增加。缺少T淋巴細(xì)胞的Rag(-/-)小鼠經(jīng)部分肝切除后肝臟損傷加重且DNA合成能力下降[16]。用CDE飲食喂飼缺少T淋巴細(xì)胞的CD3epsilon(-/-) and Rag2(-/-)小鼠，與正常對照小鼠相比，前體細(xì)胞的活化被顯著抑制[17]，表明T淋巴細(xì)胞參與了肝臟再生修復(fù)過程，并具有刺激肝臟前體細(xì)胞增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠AAF/PH模型中CD8+T淋巴細(xì)胞占T淋巴細(xì)胞的比例增加最為顯著，提示CD8+T淋巴細(xì)胞可能是參與肝臟再生調(diào)控的重要淋巴細(xì)胞亞群。

效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的活化過程是其增殖和發(fā)揮功能的關(guān)鍵，而GITR是重要的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)志物[5, 15, 18]。本研究在觀察到AAF/PH小鼠模型中CD8+T淋巴細(xì)胞比例變化的基礎(chǔ)上，檢測了GITR陽性的CD8+T淋巴細(xì)胞的比例變化情況，以反映組織浸潤的活化CD8+T淋巴細(xì)胞的變化情況。發(fā)現(xiàn)在前體細(xì)胞主導(dǎo)的肝臟再生的早期階段活化的CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著增加，而在匯管區(qū)形成纖維化的階段，活化的CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞比例均顯著下降，其具體的機(jī)制和與前體細(xì)胞的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

綜上，AAF/PH小鼠肝再生模型中，伴隨著肝臟前體細(xì)胞的活化，CD4和CD8效應(yīng)T淋巴細(xì)胞均參與了小鼠的肝臟再生過程，為后續(xù)進(jìn)一步從T淋巴細(xì)胞的角度探索肝臟前體細(xì)胞調(diào)控的肝臟再生修復(fù)提供了研究思路與線索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。