陸偉 張占卿 閻儷 黃丹 林維佳 周新蘭 丁榮蓉 王雁冰 李秀芬

作者單位：201508 上海市公共衛(wèi)生臨床中心肝膽內(nèi)科

根據(jù)血清HBeAg是否陽性、ALT是否正常、HBV DNA水平及肝臟組織學表現(xiàn)，慢性HBV感染通常經(jīng)歷4個連續(xù)但可往復的自然史分期[1-4]：HBeAg陽性非顯著肝炎活動期、HBeAg陽性顯著肝炎活動期、HBeAg陰性非顯著肝炎活動期和HBeAg陰性顯著肝炎活動期。但是，ALT的正常參考值上限(upper limit of normal, ULN)仍存爭議[1-5]；基于傳統(tǒng)的ULN，ALT對HBeAg陽性和陰性顯著肝炎活動及顯著肝纖維化的預測能力已面臨挑戰(zhàn)[6-9]。用于預測HBeAg陽性顯著肝炎活動的HBV DNA水平的劃分界限尚未定論[1-4]；HBV DNA對HBeAg陽性顯著肝纖維化的預測價值已遭到質(zhì)疑[1-4, 10-11]。

血清HBsAg已被推廣應用[2-4]。但是，用于區(qū)分自然史分期的HBsAg量化標準尚未形成[1-4]。HBsAg有兩個來源：HBV共價閉合環(huán)狀DNA和與宿主基因組整合的HBV DNA[12-14]。HBeAg陽性慢性HBV感染，雖然處于非顯著和顯著肝炎活動期患者的HBsAg與HBV DNA均呈顯著正相關[15-17]；但與HBV高復制相關的高水平HBsAg可能限制宿主針對HBV的免疫應答[11, 18]。因此，參照涵蓋與HBsAg產(chǎn)生有關的HBV DNA的常規(guī)自然史分期標準的研究難以獲得HBsAg預測HBeAg陽性顯著肝炎活動的合理數(shù)據(jù)信息，參照常規(guī)標準的研究事先已將HBV DNA預測顯著肝炎活動的性能設為“最佳”；基于涵蓋HBV低復制患者的總體人群的評價也不能準確、有效地反映HBsAg預測HBeAg陽性顯著肝炎活動的性能，HBsAg預測顯著肝炎活動的合理截斷值應在不涵蓋HBV低復制患者的HBV高-中復制人群中確定和評價。

本研究在劃分涵蓋部分HBV中復制的疑似HBV高復制與疑似HBV低復制人群的基礎上，基于疑似HBV高復制人群，參照ALT和肝臟病理學標準，對比評價HBsAg和HBV DNA預測HBeAg陽性顯著肝炎活動的性能。

資料與方法

一、研究對象

選取2017年1月—2020年9月上海市公共衛(wèi)生臨床中心住院并行肝活檢的505例慢性HBV感染患者作為研究人群；其中男性309例，女性196例；年齡10～68歲，中位值(四分位間距)34(29～40)歲。入選標準：①HBsAg和HBeAg均陽性并且均超過6個月；②有完整的住院病史記錄、詳細的肝臟病理學描述及配套的血清實驗室數(shù)據(jù)。排除標準：①合并其他病毒性肝炎、EB病毒/巨細胞病毒感染、血吸蟲肝病、脂肪性肝病(肝細胞脂肪變>5%)、藥物性肝損傷、過量飲酒(折合乙醇量：男性>30 g/d，女性>20 g/d)、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌與代謝疾病、膽管及膽囊結石、肝臟腫瘤及失代償肝病；②6個月內(nèi)曾接受干擾素類或核苷(酸)類抗病毒治療、或曾接受甘草酸類或苦參堿(素)或雙環(huán)醇/聯(lián)苯雙酯護肝治療以及傳統(tǒng)中藥方劑(含中成藥)治療；③肝臟標本長度<1.0 cm或匯管區(qū)<6個。

二、實驗室檢查

肝活檢當日上午，采集空腹靜脈血并分離血清。HBsAg、HBeAg采用微粒子酶免疫法和Abbott Architect I2000全自動免疫分析系統(tǒng)及其配套試劑檢測。其中，HBsAg檢測范圍為0.05～250 IU/mL，如超出檢測上限，被檢血清稀釋500倍重新檢測；HBeAg檢測下限為1.0 SCO。HBV DNA采用PCR探針法和Roche LightCycler 480 qPCR系統(tǒng)檢測，試劑購自圣湘生物科技股份有限公司，檢測范圍為1×102～2×109IU/mL。ALT采用Abbott Architect C16000全自動生化分析系統(tǒng)及其配套試劑檢測；參照相關文獻[1-5]，本研究將ALT的ULN設為3個層級，即20 IU/L、30 IU/L和40 IU/L，將ALT≥ULN定義為生化學顯著肝炎活動。

三、病理學診斷

肝活檢在患者簽署書面知情同意書后進行。采用一秒鐘經(jīng)皮肝穿刺法，穿刺針規(guī)格為16 G。肝臟標本的質(zhì)量評價和病理學診斷由1名資深病理學家獨立完成。肝臟病理學分級和分期參照Scheuer標準[19]：壞死性炎癥活動度分G0～G4五級，纖維化和結構改變程度分S0～S4五期。與評價無創(chuàng)指標預測肝臟病理學狀態(tài)的慣用標準不同(病理學分級≥G2和分期≥S2分別定義為顯著壞死性炎癥和顯著纖維化)，本文將“肝臟病理學分級>G1(含G1～2)或分期>S1(含S1～2)”定義為病理學顯著肝炎活動。

基于ALT 3個層級的ULN標準，本文將生化學/病理學顯著肝炎活動也分為三個層級，依次定義為“ALT≥20 IU/L或(病理學分級>G1或分期>S1)”、“ALT≥30 IU/L或(病理學分級>G1或分期>S1)”和“ALT≥40 IU/L或(病理學分級>G1或分期>S1)”。

四、統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學分析和圖形制作采用MedCalc 15.8軟件。疑似HBV高復制人群的篩選基于ALT與HBsAg、HBeAg和HBV DNA的LOESS(locally weighted scatterplot smoothing)回歸分析。ALT與HBsAg、HBeAg和HBV DNA的Spearman相關系數(shù)之間的差異比較采用Fisher Z非參數(shù)檢驗。生化學顯著與非顯著肝炎活動及病理學顯著與非顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg和HBV DNA之間的差異比較采用獨立樣本Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗。HBsAg、HBeAg和HBV DNA預測生化學/病理學顯著肝炎活動的性能評價采用受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線法，其預測生化學/病理學顯著肝炎活動的ROC曲線下面積(area under ROC curve, AUC)之間的差異比較采用相依樣本Hanley & McNeil非參數(shù)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、疑似HBV高復制人群的篩選

分別以HBsAg、HBeAg和HBV DNA作為自變量，以ALT作為因變量，設擬合跨度為60%，進行LOESS回歸分析。ALT與HBsAg、HBeAg和HBV DNA的LOESS回歸曲線見圖1。根據(jù)LOESS回歸曲線，HBsAg、HBeAg和HBV DNA可分為高水平和中-低水平兩層，即HBsAg>4.250和≤4.250 log10 IU/mL，HBeAg>2.875和≤2.875 log10 SCO，HBV DNA>7.500和≤7.500 log10 IU/mL。

參照HBsAg、HBeAg和HBV DNA的定量分層，疑似HBV高復制人群可界定為“HBsAg>4.250 log10 IU/mL或HBeAg>2.875 log10 SCO或HBV DNA>7.500 log10 IU/mL”。疑似HBV高復制人群中，高水平HBsAg、HBeAg和HBV DNA患者的構成比分別為60.6%(169/279)、82.4%(230/279)和69.5%(194/279)；高水平HBeAg患者的構成比顯著大于高水平HBsAg和HBV DNA患者(χ2=32.476,P<0.0001和χ2=12.686,P=0.0004)，高水平HBV DNA患者的構成比顯著大于高水平HBsAg患者(χ2=4.852,P=0.0276)。

二、ALT與HBsAg、HBeAg和HBV DNA的相關性

總體人群，ALT≥20 IU/L、≥30 IU/L和≥40 IU/L患者的構成比分別為93.7%(473/505)、83.6%(422/505)和73.9%(373/505)；ALT與HBsAg、HBeAg和HBV DNA的Spearman相關系數(shù)分別為-0.026、0.113和0.185(P=0.5679,P=0.0109和P<0.0001)。ALT與HBeAg和ALT與HBV DNA的Spearman相關系數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.167,P=0.2431)，ALT與HBeAg和ALT與HBV DNA的Spearman相關系數(shù)均顯著大于ALT與HBsAg的Spearman相關系數(shù)(Z=1.167,P=0.0271和Z=3.377,P=0.0007)。

高水平HBsAg人群，ALT≥20 IU/L、≥30 IU/L和≥40 IU/L患者的構成比分別為91.7%(155/169)、78.7%(133/169)和69.8%(118/169)，ALT與HBsAg的Spearman相關系數(shù)為-0.238(P=0.0018)；高水平HBeAg人群，ALT≥20 IU/L、≥30 IU/L和≥40 IU/L患者的構成比分別為93.5%(215/230)、84.3%(194/230)和76.5%(176/230)，ALT與HBeAg的Spearman相關系數(shù)為-0.283(P<0.0001)；高水平HBV DNA人群，ALT≥20 IU/L、≥30 IU/L和≥40 IU/L患者的構成比分別為94.3%(183/194)、85.1%(165/194)和77.3%(150/194)，ALT與HBV DNA的Spearman相關系數(shù)為-0.052(P=0.4739)。ALT與HBsAg和ALT與HBeAg的Spearman相關系數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.473,P=0.6363)，ALT與HBsAg和ALT與HBeAg的Spearman相關系數(shù)大于或顯著大于ALT與HBV DNA的Spearman相關系數(shù)(Z=1.796,P=0.0724和Z=2.433,P=0.0150)。

疑似HBV高復制人群，ALT≥20 IU/L、≥30 IU/L和≥40 IU/L患者的構成比分別為94.3%(263/279)、85.7%(239/279)和78.5%(219/279)；ALT與HBsAg、HBeAg和HBV DNA的Spearman相關系數(shù)分別為-0.302、-0.259和-0.078(P<0.0001,P<0.0001和P=0.1927)。ALT與HBsAg和ALT與HBeAg的Spearman相關系數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.548,P=0.5834)，ALT與HBsAg和ALT與HBeAg的Spearman相關系數(shù)均顯著大于ALT與HBV DNA的Spearman相關系數(shù)(Z=2.744,P=0.0061和Z=2.195,P=0.0281)。

三、生化學顯著與非顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg和HBV DNA之間的差異

總體、疑似HBV高復制人群生化學顯著與非顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg和HBV DNA之間的差異比較見表1。

SQRT: 平方根；紅色框圈定部分為高水平HBsAg、HBeAg和HBV DNA

表1 生化學顯著與非顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg和HBV DNA之間的差異比較

四、病理學顯著與非顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg和HBV DNA之間的差異

總體、疑似HBV高復制人群病理學顯著與非顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg和HBV DNA之間的差異比較見表2。

表2 病理學顯著與非顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg和HBV DNA之間的差異比較

五、HBsAg、HBeAg和HBV DNA預測生化學/病理學顯著肝炎活動的性能

總體和疑似HBV高復制人群，“生化學/病理學顯著肝炎活動(ALT≥20 IU/L)”、“生化學/病理學顯著肝炎活動(ALT≥30 IU/L)”及“生化學/病理學顯著肝炎活動(ALT≥40 IU/L)”的流行率分別為96.83%(489/505)和96.06%(268/279)、92.08%(465/505)和89.96%(251/279)及86.93%(439/505)和84.59%(236/279)。

HBsAg、HBeAg和HBV DNA預測生化學/病理學顯著肝炎活動的ROC曲線見圖2，預測生化學/病理學顯著肝炎活動的AUC和基于Youden指數(shù)確定的最佳截斷值及對應的診斷參數(shù)見表3。

A、C和E: 總體人群; B、D和F: 疑似HBV高復制人群. A和B: 預測生化學/病理學顯著肝炎活動(ALT≥20 IU/L); C和D: 預測生化學/病理學顯著肝炎活動(ALT≥30 IU/L); E和F: 預測生化學/病理學顯著肝炎活動(ALT≥40 IU/L).

表3 HBsAg、HBeAg和HBV DNA預測生化學/病理學顯著肝炎活動的AUC、最佳截斷值及對應的診斷參數(shù)

參考HBsAg、HBeAg的系列相同實測值對應的預測“生化學/病理學顯著肝炎活動(ALT≥20 IU/L)”的特異度與預測“生化學/病理學顯著肝炎活動(ALT≥40 IU/L)”的靈敏度之差的最小值，優(yōu)選易于記憶的HBsAg、HBeAg預測生化學/病理學顯著肝炎活動的實用截斷值。HBsAg、HBeAg和HBV DNA預測生化學/病理學顯著肝炎活動的實用截斷值及對應的診斷參數(shù)見表4。

表4 HBsAg和HBeAg預測生化學/病理學顯著肝炎活動的實用截斷值及對應的診斷參數(shù)

六、HBsAg、HBeAg串聯(lián)ALT預測肝臟病理狀態(tài)的可靠性

基于HBsAg和HBeAg的實用截斷值和ALT的三個ULN，HBsAg或HBeAg及其串聯(lián)ALT的患者肝臟不同病理學分級和分期的構成比見表5。

表5 HBsAg或HBeAg及其串聯(lián)ALT的患者肝臟不同病理學分級和分期的構成比

討 論

慢性HBV感染持續(xù)和發(fā)病的病毒學機制尚未闡明。本研究ALT與HBsAg、HBeAg和HBV DNA的散點圖顯示，總體人群、疑似HBV高復制或HBsAg、HBeAg和HBV DNA各自的高水平人群，ALT≥40 IU/L的構成比均超過2/3，提示生化學顯著肝炎活動在HBV高復制人群也廣泛存在。本研究ALT與HBsAg、HBeAg和HBV DNA的相關分析顯示，總體人群，ALT與HBsAg無顯著相關性，與HBeAg和HBV DNA均呈顯著正相關；疑似HBV高復制或HBsAg、HBeAg和HBV DNA各自的高水平人群，ALT與HBsAg和HBeAg均呈顯著負相關，與HBV DNA無顯著相關性。提示高水平HBsAg、HBeAg可能通過限制針對HBV的免疫應答誘導慢性HBV感染的持續(xù)[20-22]，中-低水平HBeAg可能通過激活針對HBV的免疫應答導致慢性HBV感染的發(fā)病。

本文結果也支持實驗研究提出的關于慢性HBV感染持續(xù)和發(fā)病機制的推論：高水平和中-低水平的血清HBsAg可能分別通過誘導免疫耗竭和免疫忽視參與慢性HBV感染的持續(xù)，高水平和中-低水平的血清HBeAg可能分別通過誘導免疫耗竭和免疫激活參與慢性HBV感染的持續(xù)和發(fā)病[23-25]；血清HBV DNA水平可能反映肝細胞內(nèi)HBV轉譯水平，高水平和中-低水平的HBV轉譯所產(chǎn)生的肝細胞HBcAg/HBeAg以及血清中-低水平的HBeAg均為免疫攻擊的主要靶標。HBeAg誘導免疫耗竭和免疫激活的兼性效應可能與其成功的近視進化(short sighted evolution)有關[26]。

預測慢性HBV感染顯著肝炎活動的ALT水平尚未達成共識[1-4]。在參考相關文獻[1-5]的基礎上，我們預設了三3個層級的ULN，即ALT≥20 IU/L、≥30 IU/L和≥40 IU/L，作為生化學顯著肝炎活動的標準?；?個層級ULN標準的比較分析顯示，總體人群，僅HBV DNA顯示了一致結果：生化學顯著肝炎活動患者HBV DNA水平顯著高于非顯著肝炎活動患者；疑似HBV高復制人群，HBsAg、HBeAg和HBV DNA均顯示了相似結果：生化學顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg水平均顯著低于非顯著肝炎活動患者，而生化學顯著與非顯著肝炎活動患者HBV DNA水平之間的差異均無統(tǒng)計學意義。

目前被廣泛使用的Scheuer、Ludwig、Ishak和METAVIR肝臟組織學評分系統(tǒng)，對慢性肝炎肝臟病理學分級和分期的判別標準高度一致[27]。本文采用Scheuer標準，將病理學分級>G1或分期>S1作為病理學顯著肝炎活動的標準；參照該標準的比較分析顯示，無論總體人群或疑似HBV高復制人群，病理學顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平均顯著低于非顯著病理學肝炎活動患者。提示采用病理學與采用生化學標準的顯著肝炎活動患者HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平的分布不完全一致：ALT水平和病理學分級或分期分別是反映HBsAg、HBeAg和HBV DNA動態(tài)變化的相對靈敏和相對特異的指標。

為此，我們采用生化學與病理學標準相結合的方式，即以“ALT≥三個層級的ULN或(病理學分級>G1或分期>S1)”作為生化學/病理學顯著肝炎活動的標準，評價了HBsAg、HBeAg和HBV DNA預測三個層級生化學/病理學顯著肝炎活動的性能。本文ROC曲線分析顯示，總體人群，HBsAg和HBeAg預測三個層級生化學/病理學顯著肝炎活動的AUC分別均小于0.75和均小于0.70；疑似HBV高復制人群，HBsAg和HBeAg預測三個層級生化學/病理學顯著肝炎活動的AUC分別均大于0.75和均大于0.70；無論總體人群或疑似HBV高復制人群，HBV DNA預測三個層級生化學/病理學顯著肝炎活動的AUC與對角參考線下面積之間的差異均無統(tǒng)計學意義。提示HBsAg和HBeAg對HBeAg陽性顯著肝炎活動有良好預測意義，而HBV DNA對HBeAg陽性顯著肝炎活動沒有預測價值。

基于ROC曲線分析，我們優(yōu)選了HBsAg和HBeAg預測生化學/病理學顯著肝炎活動的實用截斷值。其中，HBsAg預測生化學/病理學顯著肝炎活動的實用截斷值與我們前期參照歐洲肝病學會指南(2017)標準的研究結果相一致[18]?；诒疚馁Y料，ALT≥20 IU/L、≥30 IU/L和≥40 IU/L的患者，其病理學分期≤S2的構成比分別為90.6%、83.2%和79.6%，≥S4的構成比分別為9.4%、10.8%和12.1%；HBsAg>4.699 log10 IU/mL(>5×104IU/mL)和HBeAg>3.156 log10 SCO(1.45×103SCO)的患者，其病理學分期≤S2的構成比分別為98.6%和94.4%，≥S4的構成比分別為0.0%和3.3%?！癏BsAg>4.699 log10 IU/mL且ALT<40 IU/L”或“HBeAg>3.156 log10 SCO且ALT<40 IU/L”的患者，病理學分期≤S2的構成比均為100%。提示ALT預測廣泛肝纖維化(病理學分期≥S3)和肝硬化(病理學分期≥S4)的能力非常有限；但是，HBsAg或HBeAg單獨或串聯(lián)ALT預測廣泛肝纖維化和肝硬化的性能近乎超卓。

概言之，HBeAg陽性疑似HBV高復制人群，ALT與HBsAg和HBeAg均呈顯著負相關，與HBV DNA無顯著相關性；HBsAg和HBeAg對顯著肝炎活動有顯著預測價值，HBV DNA對顯著肝炎活動無預測意義。以HBsAg>5×104IU/mL或HBeAg>1.45×103SCO且ALT<40 IU/L為標準，對排除HBeAg陽性患者廣泛肝纖維化和肝硬化有卓越性能。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。