孫小虎 王璐 白靜慧 于洪

肝細(xì)胞癌(hepatic cellular cancer, HCC)是第三大癌癥相關(guān)死亡原因，僅次于肺癌和胃癌[1,2]。目前多采用手術(shù)切除和肝移植的方法治療早期HCC，但早期手術(shù)切除的5年生存率仍較低，且術(shù)后的復(fù)發(fā)率高達(dá)70%[3]。

目前，多激酶靶向抑制劑索拉非尼及樂伐替尼被用于晚期HCC的一線治療，主要通過抑制血管內(nèi)皮生長因子發(fā)揮作用[4]。隨著研究的進(jìn)展，免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors, ICI)逐步被應(yīng)用到晚期HCC的治療中，如PD-1抑制劑納武尤利單抗(nivolumab)等，但當(dāng)前的臨床試驗(yàn)顯示僅有約20%的患者對治療有反應(yīng)[5]。研究表明，晚期HCC患者中CD38+免疫細(xì)胞的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)[6]。本研究探索晚期HCC中CD38分子的表達(dá)水平與PD-1抑制劑治療效果的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

選取2019年1月1日至2020年12月31日遼寧省腫瘤醫(yī)院接受免疫治療(PD-1抑制劑)晚期肝癌患者60例，其中男性43例，女性17例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～70歲；②肝癌臨床分期為III及IV期，已無手術(shù)指征；③既往未接受過免疫治療(PD-1/PD-L1/CTLA-4抑制劑)；④無肝穿刺禁忌；⑤一般情況尚可，ECOG評分為0～1分，肝功能Child-Pugh為A或B級，預(yù)期壽命≥3個(gè)月；⑥治療前臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重肝、腎損傷或自身免疫性疾??；②對本研究使用藥物過敏的患者；③合并其他惡性腫瘤的患者；④門靜脈主干或腔靜脈存在癌栓的患者。所有患者簽署相關(guān)知情同意書。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

二、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)

從KM-plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/index.php?P=service)中搜索CD38在HCC中的信息，繪制相對于正常組織而言，CD38在HCC及晚期HCC中的生存分析曲線。

收集患者性別、年齡、甲胎蛋白(AFP)水平、當(dāng)前PD-1抑制劑為幾線治療方案、是否為乙肝或丙肝患者、Child-Pugh分級、BCLC分期、ECOG評分、是否存在血管侵犯、既往是否行外科手術(shù)或介入治療及影像學(xué)資料等。

所有患者在使用PD-1抑制劑前均進(jìn)行血液檢查包括血清膽紅素、血漿白蛋白、凝血功能等，影像學(xué)檢查包括原發(fā)腫瘤灶、腹水、轉(zhuǎn)移情況。

三、肝穿刺活檢

采用MyLab Twice(意大利)及Resona7型超聲診斷儀進(jìn)行超聲定位下穿刺，檢查前空腹8 h以上?；颊呷∽髠?cè)臥位，常規(guī)消毒右側(cè)腋前線9～10肋間隙，利多卡因局部麻醉，在超聲引導(dǎo)下進(jìn)針至肝包膜下1 cm處，使用一次性自動活檢針迅速取肝組織1～2 cm，固定。每例患者多點(diǎn)取材(3-5次)。取同期手術(shù)切除HCC患者的癌旁組織10份作為對照。

四、 免疫組織化學(xué)檢查

采用SP系列試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，石蠟切片脫蠟至水—蒸餾水沖洗—PBS浸泡5 min—抗原修復(fù)25 min—3%H2O2室溫孵育—PBS沖洗—加入5%～10%山羊血清孵育10 min后加入一抗(鼠抗人CD38單克隆抗體，購自Santa Cruze公司，稀釋為1∶100)4℃低溫過夜—PBS沖洗—二抗37℃孵育10～20 min—PBS沖洗—添加標(biāo)記好的鏈霉卵白素孵育10～30 min—PBS沖洗—DAB顯色—蘇木精復(fù)染。結(jié)果判讀：將所有的染色切片在光鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集。CD38表達(dá)于HCC癌巢中部分腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)。高倍鏡下選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照記錄。視野內(nèi)未見淺黃色及棕黃色部分為CD38陰性(-)，視野內(nèi)淺黃色陽性率在10%～30%為CD38弱陽性(+)，視野內(nèi)淺黃色部分超過30%或棕黃色部分超過10%為CD38表達(dá)強(qiáng)陽性(++)，CD38(-)及CD38(+)為低表達(dá)，CD38(++)為高表達(dá)。

五、 PD-1抑制劑治療

患者使用的PD-1抑制劑的種類不同，其中特瑞普利單抗12例，卡瑞麗珠單抗17例，信迪利單抗31例。特瑞普利單抗為每3周1次，每次240 mg，靜脈滴注；卡瑞利珠單和信迪利單抗為每3周1次，每次200 mg，靜脈滴注。

六、觀察指標(biāo)

主要觀察指標(biāo)為無進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)，次要觀察指標(biāo)為總生存期(overall Survival, OS)。治療效果的評估采用mRECIST標(biāo)準(zhǔn)，完全緩解(complete response, CR)：患者所有目標(biāo)病灶腹部CT示動脈期增強(qiáng)顯影(目標(biāo)病灶)均消失；部分緩解(partial response, PR)：腹部CT示目標(biāo)病灶直徑總和縮小≥30%；疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)：目標(biāo)病灶縮小未達(dá)到PR或增大未達(dá)到PD；疾病進(jìn)展(progressive disease, PD)：目標(biāo)病灶的直徑總和增大≥20%或出現(xiàn)新的病灶?；颊呙看稳朐航邮苤委熐熬懈共吭鰪?qiáng)CT檢查以評估疾病情況，記錄6個(gè)療程后的治療效果。治療有效=CR+PR+SD。治療結(jié)束后隨訪時(shí)間至2021年10月1日。

七、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，單因素分析采用Kaplan-Meier法，并繪制生存分析曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CD38在肝癌組織中的表達(dá)

在KM-plotter數(shù)據(jù)庫中，所有肝癌患者及晚期肝癌患者的CD38低表達(dá)均預(yù)示PFS更短(P<0.05)，如圖1A和1B所示。本研究60例晚期肝癌患者肝癌組織中，CD38(-)21例，CD38(+)17例，CD38(++)22例；手術(shù)切除的HCC患者10份癌旁組織樣本中CD38表達(dá)陰性0例，CD38(+)1例，CD38(++)9例；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.126，P=0.006)。

二、CD38表達(dá)與PD-1抑制劑治療效果的相關(guān)性

60例患者中，CD38低表達(dá)38例，高表達(dá)22例。6個(gè)治療周期后，達(dá)到CR患者0例，PR患者6例[CD38(+)1例，CD38(++)5例]，SD患者15例[CD38(-)3例，CD38(+)5例，CD38(++)7例]，PD患者39例[CD38(-)20例，CD38(+)9例，CD38(++)10例]，治療有效21例，無效39例。治療有效患者中CD38低表達(dá)9例、高表達(dá)12例；治療無效患者中CD38低表達(dá)29例，高表達(dá)10例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.833，P=0.016)。Spearman檢測CD38表達(dá)與PD-1抑制劑治療效果之間存在明顯相關(guān)性(r=-0.404，P<0.05)。

三、 CD38表達(dá)與患者生存的關(guān)系

至隨訪期結(jié)束，60例患者中共有47例(78.33%)患者死亡，有8例(13.33%)患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，5例(8.33%)患者疾病未進(jìn)展，CD38高表達(dá)及低表達(dá)組的PFS及OS如圖2A、B所示。

A：KM-plotter數(shù)據(jù)庫中CD38在晚期HCC中的PFS生存曲線(n=88)；B：KM-plotter數(shù)據(jù)庫中CD38在總HCC樣本中的PFS生存曲線(n=366)；C癌旁正常組織CD38的表達(dá)情況；D：晚期HCC患者肝組織CD38的表達(dá)情況

A：CD38高表達(dá)患者與低表達(dá)患者OS曲線；B：CD38高表達(dá)與低表達(dá)患者PFS曲線

四、 影響晚期肝癌患者PFS的相關(guān)因素分析

單因素分析顯示BCLC分期、Child-Pugh分級及CD38的表達(dá)可能與患者的PFS相關(guān)(P<0.05)，見表1所示。

表1 影響患者PFS的相關(guān)因素分析

討 論

不同于細(xì)胞毒性治療、小分子靶向抑制劑等治療方式，免疫治療可直接靶向腫瘤本身和腫瘤免疫微環(huán)境，是一種具有前景的新型治療方法。PD-1/PD-L1/CTLA-4抑制劑在某些癌癥的反應(yīng)率相對較低，限制了其臨床使用?？赡芘c患者的腫瘤免疫微環(huán)境存在著明顯差異有關(guān)。

機(jī)體正常T細(xì)胞上CD38的表達(dá)與其激活狀態(tài)有關(guān)[7]。其在不同類型的腫瘤中表達(dá)不一，可通過促進(jìn)能量代謝的方式促進(jìn)鼻咽癌的進(jìn)展[8]，也可以通過抑制腫瘤的能量代謝而抑制前列腺癌的進(jìn)展[9]。在HCC中，CD38表達(dá)的增加與M1巨噬細(xì)胞的激活相關(guān)，這一過程的特點(diǎn)是CD80表達(dá)增加，IL-6及TNF-α的分泌增加，這些細(xì)胞因子有助于提高抗腫瘤免疫[10]。使CD38可作為HCC免疫治療的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，CD38發(fā)揮抑制HCC進(jìn)展的作用，CD38高表達(dá)的患者具有更長的PFS。通過對比PD-1抑制劑治療患者的CD38的表達(dá)水平，顯示出CD38的水平與PD-1抑制劑治療效果的相關(guān)性。對骨髓移植后的患者外周血淋巴細(xì)胞亞群分析顯示，移植者外周血出現(xiàn)明顯增多的CD38+T細(xì)胞，CD38+CD4+T細(xì)胞發(fā)揮出較高的細(xì)胞溶解及產(chǎn)生干擾素-γ的潛能，具有一定的免疫器官損傷的作用[11]。在HCC中，CD38與巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD68共同表達(dá)，CD38+CD68+巨噬細(xì)胞的密度與HCC患者術(shù)后的良好預(yù)后相關(guān)[10]。

PD-L1表達(dá)的增加通常與PD-1抑制治療的臨床療效較好相關(guān)，但并非適用于所有腫瘤[12-14]。其中一個(gè)可能的機(jī)制是細(xì)胞外的腺苷通過腫瘤固有免疫的作用而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。CD38在一部分治療所誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞亞群中具有較高的表達(dá)[15]，被認(rèn)為是一類具有潛力的分子。有研究認(rèn)為，PD-1/PD-L1抑制劑會因高表達(dá)的CD38而出現(xiàn)耐藥，在腫瘤免疫微環(huán)境中全反式維甲酸和IFN-β釋放之后出現(xiàn)，是通過腺苷途徑抑制CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)，而本研究中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的CD38與HCC患者的預(yù)后相關(guān)，這表明CD38與PD-1/PD-L1之間的生物學(xué)聯(lián)系仍有待探索。

本研究通過對晚期HCC患者的臨床資料及腫瘤組織進(jìn)行分析，表明高表達(dá)的CD38預(yù)示著HCC患者的良好預(yù)后。但本研究樣本數(shù)量少，隨訪時(shí)間短，有待后續(xù)研究的進(jìn)一步開展。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。