吳 成，程平言，謝 丹，黃 魏，范恩帝，陸倫維，胡 峰

（貴州習(xí)酒股份有限公司，貴州 習(xí)水 564622）

中國(guó)醬香型白酒一年為一次生產(chǎn)周期、九次蒸煮、八次發(fā)酵、七次取酒，并采用高溫制曲、高溫堆積發(fā)酵、高溫餾酒工藝，具有生產(chǎn)周期長(zhǎng)、大曲貯存時(shí)間長(zhǎng)和基酒酒齡長(zhǎng)的特點(diǎn)[1]。其中高溫堆積發(fā)酵是醬香型白酒釀造非常獨(dú)特的生產(chǎn)方式，它的主要作用是網(wǎng)絡(luò)堆積環(huán)境中的微生物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而產(chǎn)生多種酶類和代謝風(fēng)味物質(zhì)，為后續(xù)的窖內(nèi)發(fā)酵富集重要的微生物、酶類與風(fēng)味物質(zhì)及前體，從而賦予醬香型白酒獨(dú)特的醬香風(fēng)味，因此又被稱之為“二次制曲”[2-3]。其中醬香型白酒3、4、5輪次基酒與其他輪次相比，醬香突出，香氣純正，酒體醇厚，被統(tǒng)稱為“大回酒”，其產(chǎn)量占總基酒總量的55%以上[4-5]，并在勾調(diào)時(shí)多用其進(jìn)行勾調(diào)。因此，對(duì)醬香型白酒“大回酒”輪次堆積發(fā)酵機(jī)理開展研究對(duì)保障大回酒比例，穩(wěn)定醬香型白酒成品酒質(zhì)量具有重要意義。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)及風(fēng)味化合物檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，例如實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)[6]、氣相色譜法、頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7]等已被廣泛應(yīng)用于釀酒微生物多樣性和白酒風(fēng)味物質(zhì)的研究中，進(jìn)一步增進(jìn)了研究者對(duì)醬香型白酒中微生物群落組成及風(fēng)味物質(zhì)的認(rèn)識(shí)。Wang Huan等[8]采用高通量測(cè)序方法對(duì)醬香白酒堆積發(fā)酵1～7輪次中微生物多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明“大回酒”輪次堆積發(fā)酵酒醅中特征真菌屬為unclassified_Davidiellaceae、Candida和Saccharomyces，特征細(xì)菌屬為Paenibacillus、Flavobacterium、Delftia和Sphingomonas等；張春林等[9]運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究了醬香型白酒2輪次堆積發(fā)酵中微生物群落與溫度、水分、淀粉、總酸、還原糖含量等理化因子的相關(guān)性，各項(xiàng)理化因子對(duì)不同種屬微生物的調(diào)控作用存在差異；韓興林等[10]采用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)醬香型白酒不同輪次堆積發(fā)酵酒醅中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究，共定性檢測(cè)出83 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，且在“大回酒”輪次酯類、醇類及酸類風(fēng)味物質(zhì)含量較高[5]。但是，以上研究?jī)H單獨(dú)分析了堆積發(fā)酵過(guò)程風(fēng)味物質(zhì)或微生物群落與理化因子二者間的相互作用關(guān)系，缺乏三者之間相互作用關(guān)系的系統(tǒng)研究報(bào)道。

基于此，本研究以醬香型白酒“大回酒”4輪次堆積發(fā)酵酒醅為研究對(duì)象，采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)解析細(xì)菌和真菌群落組成，結(jié)合酒醅中各理化因子與風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，系統(tǒng)分析微生物群落、理化指標(biāo)及風(fēng)味化合物三者間的相互作用關(guān)系，以期為闡明醬香型白酒“大回酒”輪次堆積發(fā)酵機(jī)理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采集自GZXJ公司制酒車間2021年4輪次堆積發(fā)酵酒醅。

孟加拉紅培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；WL（Wallerstein Laboratory）營(yíng)養(yǎng)瓊脂上海博微生物科技有限公司；DNA提取試劑盒 美國(guó)Omega BioTek公司；PCR引物 上海翌圣生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZQPW-70全溫振蕩培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；KG-AP32L自動(dòng)蒸汽滅菌器 日本ALP公司；氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；Pico-21臺(tái)式離心機(jī)美國(guó)Thermo Fisher公司；GL-88B旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳托能達(dá)科技有限公司；PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

為保證采樣的均一性及代表性，樣品按圖1方式進(jìn)行采集，取樣頻率為每天。酒醅經(jīng)出甑、攤晾、拌曲、完全收堆后開始采集，完全收堆后記為發(fā)酵0 h，當(dāng)發(fā)酵堆酒醅表層溫度達(dá)到50 ℃左右時(shí)入窖前即停止采樣。樣品采集后立即裝入無(wú)菌自封袋中，于4 ℃條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，共采集到酒醅樣品30 份。

圖1 堆積酒醅取樣Fig.1 Sampling points during heap fermentation

1.3.2 理化指標(biāo)檢測(cè)

根據(jù)沈怡方[11]方法對(duì)酒醅水分、總酸、還原糖及淀粉含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 菌株的分離、鑒定及保藏

分離及保藏：稱取10 g樣品于90 mL無(wú)菌水中，于30 ℃、180 r/min條件下振蕩30 min，吸取1 mL懸浮液稀釋備用，分別采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂、WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂和孟加拉紅培養(yǎng)基分離篩選細(xì)菌、酵母菌和絲狀真菌，并記錄菌落總數(shù)及形態(tài)特征。細(xì)菌和酵母菌采用-80 ℃甘油保藏，絲狀真菌采用4 ℃斜面保藏，每株菌株平行保藏3 管。

鑒定：根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步分類后，每種類別挑選代表性菌株1～3 株[12]分別采用Ezup柱式細(xì)菌、酵母菌和真菌基因組DNA試劑盒對(duì)菌株DNA進(jìn)行提取，具體操作流程見試劑盒說(shuō)明書。細(xì)菌采用通用引物27F（AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）對(duì)16S r RNA 基因擴(kuò)增測(cè)序；酵母菌采用通用引物N L 1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）和NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）對(duì)26 SrRNA基因D 1/D 2 片段擴(kuò)增測(cè)序；絲狀真菌采用通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）對(duì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1和2片段擴(kuò)增測(cè)序。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min；30 次循環(huán)；72 ℃終延伸10 min降至4℃。PCR體系為：模板DNA 0.5 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL，Dntp 2.5 μL，Taq酶0.2 μL，正向及反向引物各0.5 μL，使用ddH2O補(bǔ)齊體系至25 μL。

1.3.4 酒醅微生物總DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒提取樣本總DNA，具體操作流程見試劑盒說(shuō)明書。細(xì)菌采用引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACHVGGGTATCTAATCC），真菌采用引物ITS3（GCATCGATGAAGAACGCAGC）和引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；25 次循環(huán)；72 ℃終延伸5 min降至4 ℃。PCR體系為：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL，正向及反向引物各1 μL，DNA模板20～30 ng，使用ddH2O補(bǔ)齊體系至30 μL。

1.3.5 高通量測(cè)序

采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，分別對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)、真菌ITS3～I(xiàn)TS4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序分析，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3.6 風(fēng)味成分檢測(cè)

采用氣相色譜法檢測(cè)酒醅中風(fēng)味物質(zhì)。樣品前處理方法為稱取10 g酒醅于體積分?jǐn)?shù)53%乙醇溶液中浸提4 h后，使用0.22 μm無(wú)菌膜過(guò)濾備用。氣相色譜條件為：CP97723 CP-Wax 57 CB毛細(xì)管柱（50 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度230 ℃，進(jìn)樣量10 μL，分流比50∶1，升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持3 min，1.5 ℃/min升溫至70 ℃，不保持，再以2 ℃/min升溫至80 ℃，不保持，最后以7.5 ℃/min升溫至215 ℃，保持20 min；載氣流速為0.3 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序下機(jī)序列經(jīng)cutadapt去除引物接頭序列后，根據(jù)PE reads間的overlap關(guān)系使用PEAR將成對(duì)的reads拼接成一條序列，再按照barcode對(duì)其進(jìn)行識(shí)別和過(guò)濾等處理后得到有效序列數(shù)據(jù)。將相似度為97%下的有效系列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分，細(xì)菌和真菌分別采用RDP和UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。數(shù)據(jù)的分析及計(jì)算使用Microsoft Office Excel 2016軟件；理化因子動(dòng)態(tài)圖和物種相對(duì)豐度柱狀圖采用Origin 2017軟件進(jìn)行處理繪制；風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)豐度熱圖采用TBtools軟件繪制；冗余分析（redundancy analysis，RDA）采用Canoco5.0軟件；相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖根據(jù)吳浪濤等[13]方法繪制，即分別選取相對(duì)豐度排名前10的細(xì)菌和真菌物種，以及含量排名前20的風(fēng)味物質(zhì)，采用SPSS 24.0軟件計(jì)算Spearman相關(guān)性系數(shù)，選擇顯著性P＜0.01的微生物與風(fēng)味物質(zhì)，采用Cytoscape 5.0軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化因子動(dòng)態(tài)變化

如圖2 所示，酒醅溫度逐漸上升，完堆時(shí)為（27.9±3.8）℃，到入窖時(shí)為（37.9±4.6）℃；而酒醅中水分、酸度、淀粉及還原糖含量基本維持恒定，分別為（49.92±0.60）%～（53.42±0.52）%，（3.83±0.21）～（4.07±0.06）mmol/100 g，（16.01±0.47）%～（17.80±0.53）%和（0.83±0.24）%～（1.10±0.10）%，與Zhang Hongxia等[14]報(bào)道基本一致，其研究表明堆積發(fā)酵過(guò)程酒醅中水分、酸度、還原糖含量維持恒定，而在窖池發(fā)酵階段酒醅還原糖含量下降、酸度急劇上升。

圖2 4輪次堆積發(fā)酵酒醅理化因子動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Changes in physicochemical parameters of fermented grains during the fourth round of heap fermentation

2.2 傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法

采用稀釋涂布平板法分離篩選到9 株細(xì)菌、39 株酵母菌和11 株絲狀真菌，共保藏177 株。選擇代表性菌株進(jìn)行分子測(cè)序后鑒定結(jié)果及其形態(tài)特征如圖3所示。吳徐建[15]研究表明醬香型白酒堆積發(fā)酵過(guò)程中主要的細(xì)菌為B.amyloliquefaciens和B.licheniformis，并且B.amyloliquefaciens具有良好的乙醇耐受性。B.siamensis鮮少?gòu)木契蟹蛛x到，相關(guān)報(bào)道表明其具有產(chǎn)γ-聚谷氨酸及纖維素酶的能力[16-17]。而采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法篩選到了P.kudriavzevii（104CFU/g）、C.apicola（102CFU/g）等非釀酒酵母和Aspergillus（102CFU/g）等絲狀真菌。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道非釀酒酵母的發(fā)酵性能和耐受能力雖然都弱于釀酒酵母，但其在發(fā)酵過(guò)程中可以分泌大量胞外酶，具有改善酒體、口感、色澤等作用[18]；而Aspergillus等絲狀真菌是醬香型白酒高溫大曲中的主要菌種，其生長(zhǎng)代謝可以為高溫大曲提供豐富的酶系，具有分解酒醅中大分子物質(zhì)、產(chǎn)生白酒中風(fēng)味化合物及其前提物質(zhì)的作用[19]。

圖3 可培養(yǎng)方法分離篩選微生物形態(tài)特征Fig.3 Microbial characteristics revealed by culture-dependent approaches

2.3 Illumina MiSeq測(cè)序解析微生物多樣性

2.3.1 測(cè)序評(píng)估及序列處理

樣品測(cè)序完成后，共得到389354 條原始序列，其中細(xì)菌242827 條、真菌146527 條。原始序列經(jīng)去除嵌合體、過(guò)濾等處理后共得到387614 條有效序列，其中細(xì)菌241326 條、真菌146288 條，平均長(zhǎng)度分別為422 bp和322 bp。如表1所示，細(xì)菌和真菌測(cè)序覆蓋率都為0.99以上，表明測(cè)序深度足夠，樣品中幾乎所有樣本都被檢出，測(cè)序結(jié)果可真實(shí)反映酒醅樣品中細(xì)菌和真菌群落多樣性組成情況。對(duì)于細(xì)菌而言，Chao1指數(shù)基本維持不變，Simpson指數(shù)先降低后升高，而Shannon指數(shù)先升高后下降，表明堆積發(fā)酵中期和末期細(xì)菌多樣性較為豐富；對(duì)于真菌而言，Chao1指數(shù)逐漸降低，Simpson指數(shù)先升高后降低，而Shannon指數(shù)先下降后升高，與細(xì)菌變化情況相反，表明在堆積發(fā)酵初期真菌多樣性較為豐富。

表1 堆積發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌和真菌α多樣性指數(shù)Table 1 α-Diversity indexes of bacterial and fungal communities during heap fermentation

2.3.2 細(xì)菌及真菌群落動(dòng)態(tài)變化

如圖4所示，樣品經(jīng)高通量測(cè)序后，細(xì)菌共檢出7 個(gè)門、12 個(gè)綱、26 個(gè)目、47 個(gè)科、72 個(gè)屬、111 個(gè)種，其中Firmicutes和Proteobacteria為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，A.tumefaciens、V.necropolis、Lactobacillussp.、unculturedKroppenstedtiasp.、K.eburnea、S.yanoikuyae等為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種；真菌共檢出3 個(gè)門、8 個(gè)綱、9 個(gè)目、23 個(gè)科、41 個(gè)屬、69 個(gè)種，其中Ascomycota為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌門，P.kudriavzevii、K.humilis、T.languginosus、B.spectabilis、Z.parabilii等為主要優(yōu)勢(shì)真菌種。目前，尚未見有酒醅中分離出A.tumefaciens和V.necropolis的相關(guān)報(bào)道，而Lactobacillussp.的主要代謝產(chǎn)物乳酸是形成乳酸乙酯及其他香味成分的重要基礎(chǔ)物質(zhì)，但對(duì)于多輪次循環(huán)發(fā)酵的醬香型白酒而言，乳酸的積累將對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)及產(chǎn)酒品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[20]；在堆積發(fā)酵初期T.languginosus、B.spectabilis、Aspergillussp.等絲狀真菌含量豐富，它們可能主要來(lái)源于高溫大曲[21]。堆積發(fā)酵過(guò)程中，A.tumefaciens和P.kudriavzevii數(shù)量逐漸上升至發(fā)酵末期分別為34.31%和86.81%，V.necropolis和T.languginosus相對(duì)豐度急劇降低至13.13%和0.26%，而Lactobacillussp.和K.humilis含量在發(fā)酵中期數(shù)量最高分別為37.24%和13.52%。

圖4 4輪次堆積發(fā)酵細(xì)菌（a）和真菌（b）群落組成Fig.4 Composition of bacterial (a) and fungal (b) communities during the fourth round of heap fermentation

2.4 傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法與高通量測(cè)序結(jié)果比較

對(duì)于優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種鑒定而言，傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法與高通量測(cè)序結(jié)果存在差異，傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法結(jié)果表明B.amyloliquefaciens為堆積發(fā)酵中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（105CFU/g），而高通量測(cè)序結(jié)果中A.tumefaciens和V.necropolis為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；對(duì)于優(yōu)勢(shì)真菌種鑒定而言，傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)果同時(shí)表明P.kudriavzevii為主要的優(yōu)勢(shì)真菌，而C.apicola和H.burtonii酵母菌以及A.chevalieri、A.cristatus和M.purpureus等絲狀真菌也在兩種方法中同時(shí)被檢出，證明本研究高通量測(cè)序結(jié)果可靠，且相較于傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法而言，高通量測(cè)序技術(shù)的確有利于揭示樣品中小類菌群的組成?；诖?，針對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種鑒定結(jié)果的差異，本課題組分別采用RDP和Silva數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬仍為Agrobacterium，導(dǎo)致此結(jié)果原因可能是由于擴(kuò)增片段的選擇不適用于酒醅中細(xì)菌群落組成的鑒定；針對(duì)真菌多樣性而言，同時(shí)采用UNITE和RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UNITE相較于RDP數(shù)據(jù)庫(kù)而言，更適用于酒醅中真菌群落組成的鑒定，因此，擴(kuò)增片段及數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇的確會(huì)影響高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性[22]。此外，采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法僅分離鑒定出了極少部分的細(xì)菌、酵母菌和絲狀真菌，表明分離培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等有待于進(jìn)一步改進(jìn)優(yōu)化，特別是針對(duì)T.languginosus、Lactobacillussp.等微生物的分離鑒定。

2.5 酒醅中風(fēng)味物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化

采用氣相色譜法在酒醅中共檢出23 種風(fēng)味化合物，其中包含3 種醛類物質(zhì)、7 種酸類物質(zhì)、6 種酯類物質(zhì)和7 種醇類物質(zhì)，其變化規(guī)律為：醛類和酸類風(fēng)味物質(zhì)含量急劇下降，酯類和醇類風(fēng)味物質(zhì)含量基本維持不變，而醋嗡含量逐漸上升，表明在堆積發(fā)酵過(guò)程中除酸類物質(zhì)含量較高外，還可以產(chǎn)生一定的酯類和醇類物質(zhì)，這與張永燕等[23]的研究報(bào)道一致圖5表明：堆積發(fā)酵前期和中期酒醅風(fēng)味化合物結(jié)構(gòu)相似，主要以酸類、酯類和醛類物質(zhì)為主，如乙酸、丙酸、異丁酸、乳酸乙酯、己酸丁酯、糠醛和乙縮醛等，到發(fā)酵末期主要以醇類物質(zhì)為主，如丙醇、異丁醇、異戊醇和醋嗡等，這可能是由于酒醅中微生物群落的相互作用從而導(dǎo)致了風(fēng)味化合物的轉(zhuǎn)化。劉曉光等[24]研究表明大曲和酒醅中某些微生物可以直接參與高級(jí)醇、乳酸、丁酸、丁酸乙酯及己酸乙酯等白酒中重要風(fēng)味化合物的形成。

圖5 4輪次酒醅風(fēng)味成分相對(duì)豐度熱圖Fig.5 Heatmap of flavor compounds from fermented grains during the fourth round of heap fermentation

2.6 微生物群落與理化因子及風(fēng)味化合物間關(guān)系

如圖6所示，同時(shí)選取相對(duì)豐度排名前10的細(xì)菌（相對(duì)豐度＞88.36%）和真菌種（相對(duì)豐度＞86.28%）與理化因子進(jìn)行RDA，結(jié)果表明P.kudriavzevii、S.kudriavzevii與水分、溫度呈正相關(guān)，與淀粉和還原糖含量呈負(fù)相關(guān)；T.lanuginosus、B.spectabilis和A.costiformis等絲狀真菌與水分呈負(fù)相關(guān)；B.velezensis和C.apicola與淀粉和還原糖含量呈正相關(guān)；Z.parabailii、S.pombe和Lactobacillussp.與酸度呈正相關(guān)，unculturedKroppenstedtiasp.和Bacillussp.與酸度呈負(fù)相關(guān)。在堆積發(fā)酵過(guò)程中溫度逐漸升高，而淀粉和還原糖含量呈現(xiàn)緩慢降低趨勢(shì)，Zhang Hongxia等[14]研究表明釀造環(huán)境是堆積發(fā)酵中Pichiasp.的主要來(lái)源，是醬香型白酒堆積發(fā)酵中的重要微生物群落，表明4輪次堆積發(fā)酵可能主要是由P.kudriavzevii非釀酒酵母菌的生長(zhǎng)代謝而驅(qū)動(dòng)。

圖6 理化因子與微生物群落RDAFig.6 RDA between physicochemical factors and microbial community

同時(shí)，相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（圖7）分析表明醬香型白酒4輪次堆積發(fā)酵過(guò)程，同類微生物可代謝多種風(fēng)味化合物，而同一種風(fēng)味化合物也可能來(lái)自于不同微生物的代謝作用，微生物與風(fēng)味物質(zhì)間存在著復(fù)雜的構(gòu)效關(guān)系[25]。P.kudriavzevii、K.humilis、Z.parabailii、S.pombe和S.kudriavzevii等酵母菌主要與醇類物質(zhì)的形成呈正相關(guān)，與酸類和酯類物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)；而T.lanuginosus、B.spectabilis、A.costiformis和M.brevicaulis等絲狀真菌，以及Bacillussp.、K.eburnea和unculturedOceanobacillussp.等芽孢桿菌屬細(xì)菌主要與酸類和酯類物質(zhì)的形成呈正相關(guān)，這與Zhang Hongxia等[14]研究報(bào)道一致。目前，已有研究報(bào)道非釀酒酵母如P.kudriavzevii、Trichosporon coremiiforme、Trichosporonidessp.等具有代謝產(chǎn)生多元醇的功能[26]，芽孢桿菌屬細(xì)菌的主要代謝產(chǎn)物包括吡嗪類、酮類化合物、丙酸、乙酸、甲酯等[27]，而絲狀真菌如Aspergillus、Rhizopus和Monascus等可以產(chǎn)生糖化酶、液化酶和纖維素酶等多種功能酶系，它們對(duì)于白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成至關(guān)重要[28]。此外，C.apicola和大多數(shù)酸類物質(zhì)呈正相關(guān)，表明除乳酸菌及芽孢桿菌屬細(xì)菌可以代謝產(chǎn)生酸類物質(zhì)外，某些非釀酒酵母可能也具有產(chǎn)酸的能力[29]。

圖7 風(fēng)味成分與微生物群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Correlation network diagram of flavor compounds and microbial community

3 討論

同時(shí)采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒4輪次堆積發(fā)酵過(guò)程微生物組成情況進(jìn)行解析，對(duì)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌種鑒定結(jié)果存在差異，而對(duì)真菌優(yōu)勢(shì)菌種鑒定結(jié)果一致。16S rRNA基因V3～V4區(qū)（436～671 bp）是高通量測(cè)序技術(shù)中分析細(xì)菌多樣性常用的擴(kuò)增片段，而對(duì)于白酒酒醅中細(xì)菌多樣性分析大多采用16S rRNA基因V4區(qū)（588～671 bp）和RDP數(shù)據(jù)庫(kù)，僅少部分采用了16S rRNA基因V3～V4區(qū)，對(duì)應(yīng)使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為GenBank[22]。因此，導(dǎo)致本研究細(xì)菌優(yōu)勢(shì)群落組成與傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法存在差異的原因可能是由于擴(kuò)增片段的選擇，即16S rRNA基因V3～V4區(qū)（436～671 bp）不太適用于醬香型白酒酒醅中細(xì)菌多樣性的分析。I.orientalis和P.kudriavzevii為同一種酵母菌[30]，高通量測(cè)序結(jié)果分析時(shí)采用了UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真菌多樣性進(jìn)行分析，鑒定結(jié)果種名均為I.orientalis，但在傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法中對(duì)測(cè)序序列采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)后，出現(xiàn)種名均為P.kudriavzevii，可見UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于某些真菌菌種名若沒(méi)有得到及時(shí)更新則會(huì)影響測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性。因此，雖然高通量測(cè)序技術(shù)具有快速分析鑒定樣本中微生物群落組成的能力，特別是小類菌群的組成，但是傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法仍有無(wú)可替代的作用，一是可以填補(bǔ)由于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)信息不完全造成的結(jié)果偏差，二是可以為篩選優(yōu)良性能菌株奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，堆積發(fā)酵的主要作用是網(wǎng)絡(luò)環(huán)境中的酵母菌，采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)果同時(shí)表明非釀酒酵母P.kudriavzevii為4輪次堆積發(fā)酵過(guò)程的主要優(yōu)勢(shì)真菌，Zhang Hongxia等[14]研究表明醬香型白酒堆積發(fā)酵過(guò)程Pichia酵母菌主要來(lái)源于釀造環(huán)境，其具有較好的熱耐受性及較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)。非釀酒酵母功能在葡萄酒領(lǐng)域相關(guān)研究報(bào)道較多，其可以產(chǎn)生酯酶、β-葡萄糖苷酶、果膠酶和木聚糖酶等，還可以通過(guò)自身代謝直接合成多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[31]，而在醬香型白酒中也存在著資源豐富的非釀酒酵母，其代謝功能與其他微生物間的相互作用有待于進(jìn)一步研究。

醬香型白酒“大回酒”輪次基酒具有醬香突出、香氣純正、酒體醇厚的特點(diǎn)，馬宇[32]研究了醬香型白酒1～7輪次基酒中風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律，其發(fā)現(xiàn)在4輪次基酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)包括1-辛醇、2,3-丁二醇、丙二醇、鄰苯二甲酸二丁酯、2-羥基-丁酸乙酯、3-甲基戊酸和己酸等。而本研究從4輪次堆積發(fā)酵酒醅中同樣檢測(cè)出了2,3-丁二醇、丙二醇等物質(zhì)，與該輪次基酒中主要醇類物質(zhì)結(jié)構(gòu)組成相近，而酸類和酯類物質(zhì)組成相差較大，可見醬香型白酒基酒中的部分風(fēng)味物質(zhì)可以直接來(lái)源于酒醅蒸餾，表明醬香型白酒堆積發(fā)酵過(guò)程可以富集和篩選微生物，同時(shí)還可以直接產(chǎn)生豐富呈香呈味物質(zhì)前體[33]。水分、酸度及淀粉含量等理化因子受生產(chǎn)工藝影響較大，本研究通過(guò)RDA表明酒醅水分與酸度呈現(xiàn)正相關(guān)，與淀粉含量呈負(fù)相關(guān)，與張永燕等[23]的研究報(bào)道一致。P.kudriavzevii等酵母菌與水分呈正相關(guān)，與淀粉和還原糖含量呈負(fù)相關(guān)；Bacillussp.、K.eburnea和unculturedOceanobacillussp.等芽孢桿菌屬細(xì)菌與酸度、淀粉含量呈正相關(guān)；T.lanuginosus、B.spectabilis、A.costiformis和M.brevicaulis等絲狀真菌與水分呈負(fù)相關(guān)。王歡等[34]研究表明Bacillus、Thermoactinomyces與淀粉含量也呈正相關(guān)，與水分呈負(fù)相關(guān)，主要是因?yàn)锽acillus能產(chǎn)生蛋白酶與淀粉酶等水解酶類，水解原料形成豐富的發(fā)酵前體物質(zhì)，而Thermoactinomyces具有糖化力、液化力和較高的蛋白質(zhì)分解力，可降解釀酒原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等生成風(fēng)味物質(zhì)。同時(shí)，相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖分析表明醇類物質(zhì)的形成主要與P.kudriavzevii等酵母菌的相關(guān)，而酸類和酯類物質(zhì)主要與絲狀真菌及細(xì)菌相關(guān)，表明水分可能會(huì)影響P.kudriavzevii等酵母菌以及絲狀真菌利用酒醅中淀粉等大分子物質(zhì)形成醇類、酸類和酯類等風(fēng)味物質(zhì)，酸度則會(huì)影響細(xì)菌生成酸類和酯類等風(fēng)味物質(zhì)。但是，本研究結(jié)果表明在堆積發(fā)酵過(guò)程，水分、酸度、淀粉和還原糖含量基本維持恒定，這可能是由于各類微生物間相互作用形成了醇類、酸類和酯類物質(zhì)的同時(shí)又降低了理化因子彼此間對(duì)微生物群落的影響[9]，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

同時(shí)采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)，并結(jié)合氣相色譜及多元統(tǒng)計(jì)分析法，對(duì)醬香型白酒4輪次堆積發(fā)酵過(guò)程微生物群落、理化因子及風(fēng)味物質(zhì)間的相互作用關(guān)系進(jìn)行了解析。傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)鑒定結(jié)果存在異同，結(jié)合兩種方法結(jié)果表明醬香型白酒4輪次堆積發(fā)酵過(guò)程主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和真菌分別為B.amyloliquefaciens和P.kudriavzevii，在堆積發(fā)酵過(guò)程醇類物質(zhì)的形成主要與P.kudriavzevii等酵母菌相關(guān)，酸類和酯類物質(zhì)主要與絲狀真菌及細(xì)菌相關(guān)，而水分、酸度、淀粉和還原糖含量基本維持恒定，為課題組進(jìn)一步研究醬香型白酒堆積發(fā)酵機(jī)理提供了理論參考。