王春曉，何宇淋，唐佳代,2，邱樹(shù)毅

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系，貴州 仁懷 564500）

小曲是中國(guó)傳統(tǒng)四大發(fā)酵制劑之一，其以米粉為原料且體積小，主要用于釀造米酒、黃酒和白酒（米香型、清香型和豉香型）[1]。貴州米酒和小曲白酒釀造中至今仍多采用傳統(tǒng)小曲，形成了酒的獨(dú)特品質(zhì)風(fēng)味，如貴州少數(shù)民族的九仟酒、黑糯米酒、咂酒等，但貴州傳統(tǒng)小曲中功能微生物的研究報(bào)道較少，尤其需關(guān)注主要酒化和酯化等作用的功能酵母菌的研究和開(kāi)發(fā)[1]。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的興起，小曲中主要釀酒微生物的多樣性研究得以快速推進(jìn)[2-9]，然而高通量測(cè)序在種水平的分類(lèi)鑒定依賴(lài)于已建立的基因數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank等[10]，基因數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏的菌種序列信息將會(huì)導(dǎo)致高通量測(cè)序結(jié)果中無(wú)法分類(lèi)的微生物群體存在，本課題組在貴州傳統(tǒng)小曲的高通量測(cè)序分析中發(fā)現(xiàn)在菌種水平上無(wú)法分類(lèi)的真菌微生物群體最高可達(dá)近50%，因受測(cè)序引物影響其中無(wú)法分類(lèi)的酵母真菌比例無(wú)法確知[3]。總之，依賴(lài)于培養(yǎng)的功能酵母菌種水平序列分析有助于基因數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，而分子指紋圖譜分析則為功能酵母菌的開(kāi)發(fā)利用提供可追溯的分子身份。本研究在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用5.8S rRNA基因ITS區(qū)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism analysis of the ITS region of 5.8S rRNA gene，5.8S-ITS-RFLP）和串聯(lián)重復(fù)-tRNA（tandem repeattRNA，TRtRNA）指紋圖譜法對(duì)貴州傳統(tǒng)小曲中的酵母菌進(jìn)行菌種水平和種內(nèi)分子指紋圖譜分析，旨在為功能酵母菌的開(kāi)發(fā)利用提供分子理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

59 株酵母菌分離自貴州不同地區(qū)2017年生產(chǎn)的傳統(tǒng)小曲，其中4 株分離于貴州省西北部威寧縣，菌株編號(hào)為FBKL2.8048、FBKL2.8049、FBKL2.8055和FBKL2.8056；11株分離于貴州省西南部盤(pán)州市，菌株編號(hào)為FBKL2.8027、FBKL2.8029～FBKL2.8032、FBKL2.8034、FBKL2.8050～FBKL2.8054；18株分離于貴州省西南部興仁市李官，菌株編號(hào)為FBKL2.8001～FBKL2.8009、FBKL2.8011、FBKL2.8012、FBKL2.8022～FBKL2.8024、FBKL2.8041、FBKL2.8042、FBKL2.8057、FBKL2.8058；14株分離于貴州省西南部興仁市肖家灣，菌株編號(hào)為FBKL2.8015、FBKL2.8017～FBKL2.8019、FBKL2.8021、FBKL2.8028、FBKL2.8059～FBKL2.8066；12株分離于貴州省北部遵義市，菌株編號(hào)為FBKL2.8026、FBKL2.8035～FBKL2.8040、FBKL2.8043～FBKL2.8047[3]。所有菌株均由貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：1%酵母浸粉，2%葡萄糖，2%蛋白胨，2%瓊脂粉[11]。將酵母菌劃線(xiàn)培養(yǎng)于YPD培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 d后用于提取酵母菌DNA。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：根據(jù)上海博微生物科技有限公司提供的說(shuō)明配制[12-13]，將酵母菌劃線(xiàn)培養(yǎng)于WL培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d后，用于觀察記錄形狀、色澤、邊緣和質(zhì)地等菌落特征。

1.1.3 試劑

引物、限制性?xún)?nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、DNA Marker 寶日醫(yī)（TaKaRa）生物技術(shù)有限公司；HyAgarose瓊脂糖 廈門(mén)太陽(yáng)馬生物工程有限公司；核酸染料Genegreen 天根生物科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-B75L-I立式壓力蒸汽滅菌器 江陰賓江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-ID單人超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Allegra X-30R離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；MIT-100恒溫混勻儀 杭州米歐儀器有限公司；IMS-20制冰機(jī) 常熟市雪科電器有限公司；JXFSTPRP-24細(xì)胞破碎儀 上海凈信發(fā)展有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；Bio-Bset140E凝膠成像儀 美國(guó)SIM西蒙國(guó)際公司；CFX Connect Real-Time System聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、核酸電泳儀美國(guó)伯樂(lè)儀器設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌種水平鑒定

1.3.1.1 酵母菌DNA提取

取適量酵母菌體采用石英砂破壁法提取DNA[14-15]。

1.3.1.2 26S rRNA 基因D1/D2區(qū)域序列分析

26 SrRNA 基因D1/D2 區(qū)測(cè)序分析的PCR體系參照Wang Chun xiao 等[16]方法，采用NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3’）作為引物，PCR擴(kuò)增程序參考田進(jìn)等[17]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，電泳液為0.5×TBE緩沖液，電泳條件為90 V、50 min，使用凝膠成像儀查看電泳結(jié)果并參考100 bp DNA Marker讀取條帶大小，經(jīng)檢驗(yàn)大小為600 bp左右的單一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行純化并以NL1為引物開(kāi)展測(cè)序，去除序列前段的雜峰序列后，采用BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的模式菌株序列進(jìn)行比對(duì)，以相似性最高的菌種作為菌種水平鑒定結(jié)果[3]。本研究進(jìn)一步使用MEGA5.0構(gòu)建所有測(cè)序菌株和模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，具體參數(shù)為采用引導(dǎo)程序法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育實(shí)驗(yàn)，引導(dǎo)程序重復(fù)數(shù)量為1000，置換模型為Kimula雙參數(shù)法[17]。

1.3.1.3 5.8S-ITS-RFLP分析

5.8S-ITS-RFLP 分析的PCR 體系參照Wang Chunxiao 等[16]方法，采用ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）作為引物，PCR擴(kuò)增程序參考田進(jìn)等[17]方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條件和譜帶讀取如1.3.1.2節(jié)所述，并進(jìn)一步采用限制性核酸內(nèi)切酶（HaeIII、MboII、DdeI和HinfI）對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系參考田進(jìn)等[17]方法，酶切產(chǎn)物檢測(cè)如1.3.1.2節(jié)所述。將讀取圖譜條帶按“0”（無(wú)）和“1”（有）進(jìn)行標(biāo)注，使用Origin 2019軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，分析方法為多變量分析，聚類(lèi)方法為平均法，距離類(lèi)型采用歐式距離。

1.3.2 TRtRNA指紋圖譜分析

TRtRNA指紋圖譜分析的PCR體系和擴(kuò)增程序參考田進(jìn)等[17]方法，采用兩對(duì)引物開(kāi)展PCR擴(kuò)增，引物對(duì)一為5CAG（5’-CAGCAGCAGCAGCAG-3’）和TtRNASc（5’-GCTTCTATGGCCAAGTTG-3’），引物對(duì)二為ISSR-MB（5’-CTCACAACAAC AACAACA-3’）和TtRNASc[18]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條件如1.3.1.2節(jié)所述，譜帶讀取參照100 bp和250 bp DNA Marker。如1.3.1.3節(jié)所述開(kāi)展譜帶的系統(tǒng)聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌種水平分析

貴州不同地區(qū)傳統(tǒng)小曲中分離的59 株酵母菌在WL培養(yǎng)基上呈8 類(lèi)菌落特征（圖1），其中I類(lèi)和II類(lèi)菌落都易挑起，I類(lèi)呈奶油圓錐形白色凸起，II類(lèi)表面不光滑、呈蠟質(zhì)藍(lán)綠色凸起，III～VIII類(lèi)的共同特征為都不易挑起，表面呈現(xiàn)不同特征的短絨毛凸起，III類(lèi)呈白色而IV類(lèi)至VIII類(lèi)具淺綠或藍(lán)綠邊緣。

圖1 貴州傳統(tǒng)小曲酵母菌落特征圖Fig.1 Colony characteristics of yeasts isolated from traditional Guizhou Xiaoqu

59 株酵母菌經(jīng)26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列分析，通過(guò)與模式菌株的同源序列比對(duì)確定菌種水平分類(lèi)地位[3]：1 株T.asahii、32 株S.fibuligera、8 株S.malanga、4 株H.burtonii、6 株W.anomalus和8 株S.cerevisiae。其系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖2所示，其中T.asahii與其余5 種酵母菌的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，S.fibuligera和S.malanga作為同屬內(nèi)不同菌種展現(xiàn)了較近的遺傳關(guān)系（序列比對(duì)相似性為93.12%），而二者與H.burtonii、W.anomalus和S.cerevisiae之間的遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。此外，4 株H.burtonii與模式菌株之間體現(xiàn)了一定的遺傳距離（菌株FKBL2.8062與模式菌株之間序列比對(duì)相似性為99.6%，而其余3 株菌與模式菌株之間的序列比對(duì)相似性為99.8%，圖2）。

圖2 貴州傳統(tǒng)小曲分離酵母菌與模式菌株基于26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of yeasts isolated from traditional Guizhou Xiaoqu and type strains based on the D1/D2 domain of the 26S rRNA gene sequence

為貴州傳統(tǒng)小曲酵母菌種水平鑒定提供簡(jiǎn)單快捷的方法，本研究進(jìn)一步采用5.8S-ITS-RFLP分析方法對(duì)59 株酵母菌的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切（表1），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小展示了6 個(gè)菌種酵母菌之間的明顯與微弱差異（圖3），如6 株W.anomalus和32 株S.fibuligera的擴(kuò)增產(chǎn)物大小都為600 bp，因此進(jìn)一步將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物開(kāi)展4 種限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析（表1，圖4），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合HaeIII和HinfI酶切可清晰將S.cerevisiae、S.malanga與H.burtonii從6 個(gè)菌種中區(qū)分出來(lái)，而W.anomalus、S.fibuligera與T.asahii菌種的5.8S-ITS-RFLP分析最好采用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合MboII和DdeI酶切。

表1 貴州傳統(tǒng)小曲中分離酵母的5.8S-ITS-RFLP分析結(jié)果Table 1 Results of 5.8S-ITS-RFLP analysis of yeasts isolated from traditional Guizhou Xiaoqu

圖3 6 種酵母ITS區(qū)擴(kuò)增圖譜Fig.3 Electrophoretogram of ITS region amplified from six yeast species

圖4 6 種酵母5.8S-ITS-RFLP酶切圖譜Fig.4 Electrophoretograms of six yeast species with restriction enzyme digestion and 5.8S-ITS-RFLP analysis

本研究將5.8S-ITS-RFLP分析方法中6 個(gè)菌種的全部限制性?xún)?nèi)切酶（HaeIII、MboII、HinfI和DdeI）酶切圖譜結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖5），遺傳距離為2.1左右可以將6 個(gè)菌種區(qū)分開(kāi)來(lái)，且S.malanga和S.fibuligera菌種之間的遺傳距離近于其他4 個(gè)酵母菌種，而S.cerevisiae與T.asahii與其他4 個(gè)酵母菌種之間的遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖5 6 種酵母菌株5.8S-ITS-RFLP酶切結(jié)果聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig.5 Dendrogram of cluster analysis of 5.8S-ITS-RFLP profiles of six yeast species

2.2 TRtRNA指紋圖譜分析

采用兩對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)59 株酵母菌株進(jìn)行擴(kuò)增圖譜差異分析。引物對(duì)TtRNASC和ISSR-MB的擴(kuò)增圖譜將全部酵母菌株分為11 類(lèi)（圖6，下滑線(xiàn)標(biāo)識(shí)亮條帶）：a類(lèi)圖譜條帶為410 bp，包含8 株S.cerevisiae；b1類(lèi)為480 bp，包含3 株H.burtonii；b2類(lèi)圖譜條帶為500 bp，有1 株H.burtonii；c1類(lèi)為4500、1500、1300、1000、620、110 bp，有4 株W.anomalus；c2類(lèi)為4500、1500、1200、1000、620、500、350、200、110 bp，包含2 株W.anomalus；d類(lèi)為2700、2000、1000、500、450、110 bp，包含8 株S.malanga；e1和e2類(lèi)分別為2300、1500、1400、1000、900、420、350、200、160 bp和1000、900、420、350、200、160 bp，分別有1 株和2 株S.fibuligera；e3類(lèi)為1000、900、420、350、200 bp，有14 株S.fibuligera；e4類(lèi)為2300、1400、950、800、420、400、350、250、200、160 bp，包含10 株S.fibuligera；e5類(lèi)為1000、900、500、420、350、200 bp，包含5 株S.fibuligera；T.asahii無(wú)擴(kuò)增圖譜因此未計(jì)入類(lèi)別。11 類(lèi)圖譜條帶的聚類(lèi)分析顯示e1、e2、e3和e5類(lèi)遺傳關(guān)系較近，a、b1和b2類(lèi)遺傳關(guān)系較近，兩者內(nèi)部遺傳距離小于2.1，而e4類(lèi)與其余所有類(lèi)別遺傳距離最遠(yuǎn)（遺傳距離＞3，圖6）。

圖6 引物對(duì)TtRNASC和ISSR-MB的圖譜分析結(jié)果Fig.6 Analysis of electrophoresis profiles using primer pairs of TtRNASC and ISSR-MB

引物對(duì)TtRNASC和5CAG將全部酵母菌株分為11 類(lèi)（圖7，下滑線(xiàn)標(biāo)識(shí)亮條帶）：A類(lèi)圖譜條帶為2000、1300、1000、700、500、160、100 bp，包含8 株S.cerevisiae；B類(lèi)為1300、1100、1000、500、450、300、110 bp，有1 株H.burtonii；C1、C2和C3類(lèi)分別為2100、1000、900、700、600、300、280、120 bp，3000、2000、1100、1000、700、600、400、300、110 bp和3000、2000、1300、1100、1000、400、300、100 bp，分別包含1 株H.burtonii；D1類(lèi)為3000、1400、1200、1000、750、700、310、290 bp，包含5 株W.anomalus；D2類(lèi)為1200、800、700、660 bp，有1 株W.anomalus；E類(lèi)為900、750、660、480、450、400、310、280、200、150、100 bp，有8 株S.malanga；F1類(lèi)為1100、1000、680、600、580、400、190 bp，包含16 株S.fibuligera；F2類(lèi)為1200、800、700、680、580、400、210、200 bp，包含9 株S.fibuligera；F3圖譜條帶為680、600、580、400、190 bp，包含7 株S.fibuligera；T.asahii為250 bp未計(jì)入類(lèi)別。11 類(lèi)圖譜條帶的聚類(lèi)分析顯示，E類(lèi)明顯區(qū)別于其他菌株類(lèi)型，遺傳距離接近4，F(xiàn)1類(lèi)和F3類(lèi)遺傳關(guān)系最近（圖7）。

將TRtRNA指紋圖譜分析采用兩對(duì)引物獲取的全部圖譜類(lèi)型進(jìn)行結(jié)合分析，可將58 株酵母菌分為17 個(gè)基因型（圖8）：8 株S.cerevisiae被鑒定為基因型1（圖譜型為a-A），4 株H.burtonii被鑒定為基因型2（圖譜型為b1-B，菌株編號(hào)FBKL2.8064）、3（圖譜型為b1-C1，菌株編號(hào)FBKL2.8018）、4（圖譜型為b1-C2，菌株編號(hào)FBKL2.8021）、5（圖譜型為b2-C3，菌株編號(hào)FBKL2.8062），6 株W.anomalus被鑒定為基因型6（圖譜型為c1-D1，4 株）、7（圖譜型為c2-D1，菌株編號(hào)FBKL2.8023）、8（圖譜型為c2-D2，菌株編號(hào)FBKL2.8024），8 株S.malanga被鑒定為基因型9（圖譜型為d-E），32 株S.fibuligera被鑒定為基因型10（圖譜型為e1-F1，菌株編號(hào)FBKL2.8026）、11（圖譜型為e2-F3，菌株編號(hào)FBKL2.8041）、12（圖譜型為e3-F1，7 株分離于盤(pán)州市小曲，6 株分離于遵義市小曲，1 株分離于威寧縣小曲）、13（圖譜型為e4-F1，菌株編號(hào)FBKL2.8048）、14（圖譜型為e4-F2，4 株分離于盤(pán)州市小曲，2 株分離于李官小曲，3 株分離于威寧縣小曲，1 株分離于肖家灣小曲）、15（圖譜型為e2-F1，菌株編號(hào)FBKL2.8035）、16（圖譜型為e5-F1，菌株編號(hào)FBKL2.8036）、17（圖譜型為e5-F3，3 株分離于遵義市小曲，1 株分離于李官小曲）。1 株T.asahii因缺失引物對(duì)TtRNASC和ISSR-MB擴(kuò)增結(jié)果，因此未計(jì)入基因型分析。17 個(gè)基因型的聚類(lèi)分析結(jié)果（圖8）表明，遺傳距離大于3.6以上時(shí)TRtRNA指紋圖譜分析方法可展現(xiàn)菌種水平差異（除了S.cerevisiae小于該遺傳距離，大約為3），而H.burtonii、W.anomalus與S.fibuligera都展現(xiàn)了菌種內(nèi)部基因型之間的差異，其中基因型10、11、12、15、16與17之間的遺傳關(guān)系較近，而其余的菌種內(nèi)部基因型之間的遺傳距離都大于2，遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.3 種間和種內(nèi)聚類(lèi)分析比較

TRtRNA指紋圖譜聚類(lèi)分析（圖8）重點(diǎn)體現(xiàn)了種內(nèi)差異，菌種水平差異與26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）結(jié)果具有一定的一致性，如展現(xiàn)了S.malanga和S.fibuligera與W.anomalus、H.burtonii和S.cerevisiae相對(duì)較遠(yuǎn)的遺傳距離，以及H.burtonii和S.cerevisiae相對(duì)較近的遺傳距離，不同點(diǎn)在于基因型3（H.burtoniiFBKL2.8018）的種內(nèi)遺傳距離遠(yuǎn)于S.cerevisiae，而26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育分析雖然體現(xiàn)了FBKL2.8062與其他菌株之間的遺傳差異，但其與S.cerevisiae的遺傳差異大于種內(nèi)差異。因此依賴(lài)于擴(kuò)增片段分析的TRtRNA指紋圖譜聚類(lèi)分析相較于26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育分析而言，更適于展現(xiàn)種內(nèi)差異，而依賴(lài)于序列分析的后者更適于展現(xiàn)菌種水平遺傳差異。5.8S-ITS-RFLP分析雖然體現(xiàn)了與26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育分析類(lèi)似的S.malanga和S.fibuligera較近的遺傳距離（圖5），但展現(xiàn)了S.cerevisiae與T.asahii較近而與其余菌種較遠(yuǎn)的遺傳距離，這一點(diǎn)與依賴(lài)于序列分析的后者不同。因此，依賴(lài)于擴(kuò)增片段大小分析的TRtRNA指紋圖譜分析方法和5.8S-ITS-RFLP分析方法若能獲取不同片段的序列信息，將增強(qiáng)其遺傳距離聚類(lèi)分析的能力。

3 討論

釀酒小曲中的酵母菌在發(fā)酵中主要起酒化、酯化產(chǎn)香等功能，部分酵母菌可產(chǎn)生淀粉酶起糖化作用[1,3,23]。本研究所分離鑒定的6 種酵母菌作為潛在的小曲功能酵母，經(jīng)課題組前期研究和文獻(xiàn)查閱證實(shí)S.cerevisiae具有高產(chǎn)乙醇、低產(chǎn)高級(jí)醇的能力[20-21]，W.anomalus具有高產(chǎn)乙酸乙酯等酯類(lèi)能力[22-23]，H.burtonii可產(chǎn)生大量酯類(lèi)和醇類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)[24-25]，S.fibuligera具有產(chǎn)淀粉酶和酸性蛋白酶等酶的能力[26-28]。為貴州傳統(tǒng)小曲中功能酵母菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供分子身份，本研究在前期貴州傳統(tǒng)小曲酵母菌分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列分析和5.8S-ITS-RFLP分析方法確定酵母菌菌種水平分類(lèi)地位和特征，并進(jìn)一步采用TRtRNA指紋圖譜法分析酵母菌的種內(nèi)差異及基因型特征，鑒定的6 種酵母菌種有3 種展現(xiàn)了種內(nèi)差異。首先，WL培養(yǎng)基作為常用酵母菌鑒定培養(yǎng)基共區(qū)分了8 種不同的菌落特征，但據(jù)目前報(bào)道的菌落特征庫(kù)只能將S.cerevisiae初步確定，其余菌種無(wú)法確知屬種名稱(chēng)。其次，26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列分析將59 株酵母菌鑒定到菌種水平，并展現(xiàn)了不同菌種之間的遺傳距離和H.burtonii菌種內(nèi)部的序列差異，而本研究首次拓展了除S.cerevisiae之外其余5 個(gè)酵母菌種的5.8S-ITS-RFLP特征圖譜，可為后續(xù)快速檢測(cè)菌種身份提供分子方法[29]，雖然酶切聚類(lèi)僅依賴(lài)4 個(gè)酶切圖譜特征展開(kāi)，但依然體現(xiàn)了與26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列分析相似的結(jié)論，即S.malanga和S.fibuligera菌種之間的遺傳距離近于其他4 個(gè)酵母菌種，而T.asahii與酵母菌種之間的遺傳距離較遠(yuǎn)。最終，本研究所采用的TRtRNA指紋圖譜法由Barquet等[18]專(zhuān)門(mén)為體現(xiàn)非酵母屬酵母菌種之間和種內(nèi)差異所設(shè)計(jì)，在本研究TRtRNA指紋圖譜法體現(xiàn)了59 株酵母菌之間的菌種水平之間和種內(nèi)之間的分子差異，3 個(gè)菌種H.burtonii、W.anomalus與S.fibuligera都體現(xiàn)了較遠(yuǎn)遺傳距離上（大于2小于3.6）的種內(nèi)差異，說(shuō)明TRtRNA指紋圖譜法適用于某些酵母菌種的種內(nèi)遺傳多樣性研究。貴州傳統(tǒng)小曲中的主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)菌種S.fibuligera的基因型12、14和17分別由分離自不同地區(qū)小曲的酵母菌組成，說(shuō)明基因型分布可能與小曲地區(qū)來(lái)源關(guān)聯(lián)較小。此外，Interdelta指紋圖譜分析和微衛(wèi)星分子標(biāo)記法是常用的S.cerevisiae種內(nèi)分型方法[18,30]，而本研究中8 株S.cerevisiae未展現(xiàn)TRtRNA指紋圖譜差異，8 株S.malanga菌株的TRtRNA指紋圖譜單一，說(shuō)明TRtRNA指紋圖譜法可能無(wú)法在這兩個(gè)酵母菌種中展現(xiàn)較為豐富基因型差異，但也可能因本研究中這兩個(gè)菌種分離自同地區(qū)小曲因此基因型差異較少。

4 結(jié)論

從貴州5 個(gè)不同地區(qū)傳統(tǒng)小曲中分離鑒定了6 個(gè)酵母菌種T.asahii（1 株）、S.fibuligera（32 株）、S.malanga（8 株）、H.burtonii（4 株）、W.anomalus（6 株）和S.cerevisiae（8 株），展示了6 個(gè)酵母菌種的WL培養(yǎng)基菌落特征、26S rRNA基因D1/D2區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育特征、5.8S-ITS-RFLP酶切圖譜特征和TRtRNA指紋圖譜特征，尤其是TRtRNA指紋圖譜特征展現(xiàn)了H.burtonii、W.anomalus與S.fibuligera的種內(nèi)差異，為課題組進(jìn)一步研究其低產(chǎn)高級(jí)醇和酯化產(chǎn)香等功能提供了可追蹤的分子身份。