毛亞玲，李俊娥，于 靜，楊 柳，祝 霞,2，楊學(xué)山,2,

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）主要是在酒酒球菌（Oenococcus oeni）的主導(dǎo)下，將葡萄酒中的L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為L-乳酸和CO2，可在降低酒體酸度、提高生物穩(wěn)定性的同時賦予其獨特風(fēng)味和口感[1-2]。分離鑒定自葡萄酒原產(chǎn)地的本土O.oeni由于適應(yīng)了產(chǎn)區(qū)的特定風(fēng)土條件，更能夠?qū)⑨劸破咸训钠焚|(zhì)特征在發(fā)酵過程中充分表達(dá)，是釀造具有產(chǎn)區(qū)風(fēng)格和典型性葡萄酒的有效方式[3]。然而，采用傳統(tǒng)釀造工藝進行順序接種MLF時，由于乙醇發(fā)酵（alcohol fermentation，AF）后的酒體乙醇體積分?jǐn)?shù)較高、菌體可攝入的營養(yǎng)物質(zhì)減少，O.oeni較難適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，常常導(dǎo)致MLF遲滯甚至失敗[4-5]。此外，游離SO2含量的降低使酒體抑菌效果減弱，較長時間的發(fā)酵進程增加了腐敗微生物污染的風(fēng)險[6]。將釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和O.oeni同時接種到葡萄汁中進行共發(fā)酵，在克服以上問題的同時還能減少總發(fā)酵時長，提升葡萄酒的生產(chǎn)效率[7]。Antalick等[8]研究發(fā)現(xiàn)，同時接種可以增加美樂葡萄酒酯類物質(zhì)的含量。Jussier[9]、Massera[10]、Tristezza[11]等分別對霞多麗、馬爾貝克、黑曼羅葡萄進行共發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)同時接種不會抑制AF的進行，還會使葡萄酒果香氣味更加濃郁。李俊娥等[12]研究表明，與傳統(tǒng)順序MLF相比，共發(fā)酵不僅縮短了發(fā)酵時長，而且揮發(fā)性化合物種類多，含量高，可賦予葡萄酒濃郁的花果香。趙現(xiàn)華等[13]研究表明，共發(fā)酵可以增加葡萄酒乳酸、脂肪酸和萜烯類等物質(zhì)含量，豐富葡萄酒的風(fēng)味結(jié)構(gòu)，提高葡萄酒感官品質(zhì)。

在共接種釀造過程中，由于S.cerevisiae和O.oeni之間可能存在拮抗作用，影響葡萄酒品質(zhì)或?qū)е掳l(fā)酵遲滯[14]。通過建立數(shù)學(xué)模型定量描述發(fā)酵動力學(xué)過程，可合理預(yù)測或控制微生物代謝活動，有助于更詳細(xì)地了解發(fā)酵過程中重要參數(shù)的動態(tài)變化，降低失敗的風(fēng)險，被認(rèn)為是本土菌株大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用前不可或缺的步驟[15-16]。研究者對沙棘酒[17]、山葡萄酒[18]、仙人掌果酒[19]、瑪咖芒果復(fù)合酒[20]、蓮霧果酒[21]等發(fā)酵過程中的S.cerevisiae數(shù)量、還原糖含量和乙醇體積分?jǐn)?shù)變化分別建立動力學(xué)模型，結(jié)果表明Logistic、Boltzmann、SGompertz和DoseResp模型測定值和預(yù)測值之間均具有較好的擬合度，可以用來描述果酒發(fā)酵過程中S.cerevisiae菌株生長、底物消耗和產(chǎn)物生成變化的規(guī)律，對合理控制發(fā)酵過程及產(chǎn)品品質(zhì)調(diào)控具有重大意義[22]。然而，針對S.cerevisiae和O.oeni共接種發(fā)酵過程中的動力學(xué)特征研究還十分欠缺。

本研究選取2 株篩選自甘肅河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)的本土O.oeniZX-1和MG-1菌株，分別與S.cerevisiaeVW和AW進行共接種發(fā)酵，以未進行MLF為對照，采用經(jīng)典的Logistic、Boltzmann、SGompertz和DoseResp模型，對共發(fā)酵過程中S.cerevisiae生物量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖含量、O.oeni生物量及L-蘋果酸含量的變化規(guī)律進行非線性擬合，建立S.cerevisiae和O.oeni共發(fā)酵動力學(xué)模型，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)最優(yōu)工藝控制和促進本土菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ZX-1、MG-1分離自河西走廊葡萄酒產(chǎn)區(qū)自然啟動MLF葡萄酒，由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室鑒定，-80 ℃甘油管保存。其中ZX-1菌株在釀造過程中可以分泌較高的糖苷酶，有效提升葡萄酒的品種香氣特征；MG-1菌株具有良好的發(fā)酵耐受性，具備商業(yè)化應(yīng)用的潛力[23]。VW、AW均為商業(yè)活性酵母干粉，購自意大利Enartis公司。

L-蘋果酸檢測試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；放線菌酮、氯霉素、果糖、纖維二糖、肌醇、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺、泛酸鈣、對氨基苯甲酸、L-蘋果酸、鉬酸鈉 上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、鹽酸半胱氨酸、酒石酸氫鉀、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、檸檬酸、磷酸氫二銨、磷酸氫二鉀、氯化錳、氯化鋅、硼酸、瓊脂、偏重亞硫酸鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-3C精密pH計 上海雷磁責(zé)任有限公司；HWS恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-150-II生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；UV-6100紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

本土O.oeni擴大培養(yǎng)采用酸性番茄培養(yǎng)基（acid tomato juice，ATB）[23]：葡萄糖10 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，鹽酸半胱氨酸0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，番茄汁25%（V/V）；固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L、放線菌酮50 mg/L。使用1 mol/L NaOH溶液分別將液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基pH值調(diào)至4.8和5.0，121 ℃滅菌20 min。

S.cerevisiae計數(shù)培養(yǎng)采用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）[24]：葡萄糖2 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母浸粉1 g/L、瓊脂20 g/L，添加10 mg/L氯霉素，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 模擬汁體系

模擬葡萄汁配制參考馬騰臻[25]的方法。將微量元素配制成質(zhì)量濃度為g/L數(shù)量級的母液，稀釋1000 倍備用。模擬汁添加40 mg/L SO2（偏重亞硫酸鈉計），使用NaOH調(diào)節(jié)pH 3.5。

1.3.3 菌株活化及模擬汁發(fā)酵

S.cerevisiae活化：分別稱取適量VW、AW菌株干粉溶于10 倍體積的無菌水中，37 ℃恒溫水浴20 min后，再添加10 倍體積的模擬汁，28 ℃恒溫水浴10 min。

O.oeni活化：取-80 ℃甘油管保藏的本土O.oeni菌株ZX-1和MG-1，于ATB斜面培養(yǎng)基劃線，28℃培養(yǎng)5～7 d后，挑取兩環(huán)于滅菌后的ATB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期，備用。

接種量：S.cerevisiae和O.oeni的接種量均為1×106CFU/mL。20 ℃條件下進行發(fā)酵，還原糖低于4 g/L且L-蘋果酸低于0.2 g/L時，結(jié)束發(fā)酵。實驗設(shè)置3 個平行，結(jié)果取其平均值。

1.3.4 菌株接種方案

模擬汁AF（接種時間24 h）菌株接種方案如表1所示。

表1 不同菌株組合Table 1 Co-inoculations of O.oeni with S.cerevisiae

1.3.5 指標(biāo)檢測

1.3.5.1 菌株生物量測定

參照楊婷[26]的方法，分別采用YPD和ATB固體培養(yǎng)基對發(fā)酵過程中S.cerevisiae和O.oeni進行涂布計數(shù)。每隔24 h取發(fā)酵液1 mL于9 mL 0.85%生理鹽水中，混勻后稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，準(zhǔn)確吸取0.1 mL稀釋菌懸液分別涂布于添加10 mg/L氯霉素（用于抑制細(xì)菌生長）的YPD固體培養(yǎng)基、添加50 mg/L放線菌酮（用于抑制酵母生長）的ATB固體培養(yǎng)基。酵母菌28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察其菌落形成情況并計數(shù)，O.oeni28 ℃培養(yǎng)5～7 d后觀察其形態(tài)并計數(shù)。菌落總數(shù)以菌落形成單位（CFU/mL）表示。

1.3.5.2 還原糖含量和乙醇體積分?jǐn)?shù)測定

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，采用斐林試劑和酒精計法測定發(fā)酵過程中還原糖含量和乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3.5.3L-蘋果酸含量測定

參照試劑盒推薦說明進行操作，測定發(fā)酵酒樣中L-蘋果酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 2019軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與作圖分析，選取合適的動力學(xué)模型對共發(fā)酵過程中S.cerevisiae生物量、還原糖含量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、O.oeni生物量和L-蘋果酸含量變化情況進行非線性擬合，并選取擬合效果最佳的動力學(xué)模型對發(fā)酵過程中微生物代謝活動進行定量分析描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬汁發(fā)酵過程中S.cerevisiae活菌數(shù)、還原糖含量和乙醇體積分?jǐn)?shù)變化趨勢

由圖1可知，與未MLF組E、F相比，共發(fā)酵過程中A、B、C和D處理組S.cerevisiae活菌數(shù)均有所降低，這可能是由于共接種模式下S.cerevisiae與本土O.oeni競爭性利用發(fā)酵環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，如碳源、氮源及其他微量元素等所致。在共發(fā)酵初期，發(fā)酵液中的S.cerevisiae細(xì)胞數(shù)較少，與VW相比，AW能較快適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，活菌數(shù)略高，后期VW生長速率較AW快，但由于發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗致使VW更早進入衰亡期，且衰亡速度更快。2 株S.cerevisiae均經(jīng)過1 d對發(fā)酵環(huán)境適應(yīng)后即可快速生長，迅速進入對數(shù)生長期，發(fā)酵過程中不同處理組S.cerevisiaeVW和AW活菌數(shù)分別于4 d和5 d達(dá)到最大值，且無明顯差異（A組：2.63×106CFU/mL；B組：2.60×106CFU/mL；C組：2.46×106CFU/mL；D組：2.40×106CFU/mL）。在發(fā)酵過程中，還原糖為S.cerevisiae生長提供其所需的能量，發(fā)酵體系中還原糖含量的變化趨勢反映S.cerevisiae發(fā)酵能力的強弱[27]。隨著S.cerevisiae細(xì)胞的增長，還原糖含量呈下降趨勢，A和B處理組在2～5 d下降幅度最大，C和D處理組在3～7 d下降幅度最大，分別與S.cerevisiaeVW和AW生長量一致。A、B組和C、D組分別于8 d和10 d完成AF，還原糖含量分別為2.59、2.87、3.12、3.26 g/L，均低于對照組，說明早期階段接入本土O.oeni未抑制AF的進行。乙醇為S.cerevisiae在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化糖類代謝而生成的產(chǎn)物[28]，乙醇體積分?jǐn)?shù)隨發(fā)酵的進行逐漸升高，其中A和B處理組于發(fā)酵5 d后增幅較緩，在8 d達(dá)到最高，C和D處理組于發(fā)酵7 d后增幅變緩，在10 d達(dá)到最高，A、B、C和D處理組間乙醇體積分?jǐn)?shù)無明顯差異，分別為11.70%、11.60%、11.60%和11.40%。乙醇的生成幾乎與還原糖的消耗和S.cerevisiae的生長呈對應(yīng)關(guān)系。

圖1 發(fā)酵過程中還原糖含量、S.cerevisiae活菌數(shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)變化趨勢Fig.1 Trends of reducing sugar content,viable yeast count and alcohol content during co-fermentation process

2.2 模擬汁共發(fā)酵過程中O.oeni活菌數(shù)和L-蘋果酸含量變化趨勢

如圖2所示，在共接種模式下，由S.cerevisiae主導(dǎo)的AF和O.oeni主導(dǎo)的MLF幾乎同步進行，本土O.oeniZX-1和MG-1與S.cerevisiaeVW和AW共發(fā)酵表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性，能夠較快地觸發(fā)MLF。如圖2所示，ZX-1和MG-1生長趨勢一致，表現(xiàn)出相似的發(fā)酵性能。在AF 24 h后接種本土O.oeni進行共發(fā)酵，4 個處理組菌體數(shù)量均于4 d分別達(dá)到最大值（A組：2.09×106CFU/mL；B組：2.13×106CFU/mL；C組：2.55×106CFU/mL；D組：2.61×106CFU/mL），5 d后進入衰亡期。隨著MLF的進行，發(fā)酵液中L-蘋果酸含量呈逐步下降趨勢，A、B組和C、D組L-蘋果酸質(zhì)量濃度分別于發(fā)酵9 d和8 d降至0.2 g/L以下，降酸率分別為97.50%、96.67%、96.11%和95.28%，其中A組降酸能力最強。在由S.cerevisiae導(dǎo)致乙醇體積分?jǐn)?shù)增加的過程中，2 株O.oeni生長量并未受到抑制，說明在共發(fā)酵過程的起始階段，較低的乙醇體積分?jǐn)?shù)更有利于O.oeni適應(yīng)酒體環(huán)境，同時早期凋亡的S.cerevisiae細(xì)胞可為O.oeni提供氨基酸、維生素和丙酮酸鹽等營養(yǎng)因子。菌株的個體差異表現(xiàn)為MG-1與S.cerevisiaeVW和AW共發(fā)酵過程中生物量均略高于ZX-1。

圖2 共發(fā)酵過程中O.oeni活菌數(shù)、L-蘋果酸含量變化趨勢Fig.2 Trends of viable O.oeni count and L-malic acid content during co-fermentation process

2.3 模擬汁發(fā)酵動力學(xué)模型的建立

2.3.1S.cerevisiae生長動力學(xué)模型

由圖1可知，AF初期體系營養(yǎng)物質(zhì)充足，乙醇體積分?jǐn)?shù)較低，S.cerevisiae處于生長期和穩(wěn)定期，A、B組和C、D組分別于5 d和7 d后逐漸進入衰亡期，因此本研究擬對0～5 d（A、B組）和0～7 d（C、D組）時期S.cerevisiae生長情況進行非線性擬合。選用Logistic模型、Boltzmann模型和SGompertz模型對共發(fā)酵處理組S.cerevisiae數(shù)量變化進行擬合，擬合方程見表2。對比分析可得，4 個處理組擬合系數(shù)R2由大到小分別為Boltzmann模型＞Logistic模型＞SGompertz模型，Boltzmann模型能較好地模擬并預(yù)測共發(fā)酵過程中S.cerevisiae的生長情況，此結(jié)論與王少曼等[29]關(guān)于菠蘿蜜果酒釀造過程中酵母菌數(shù)的擬合模型一致。

表2 S.cerevisiae動態(tài)變化的擬合方程及其擬合系數(shù)Table 2 Fitting equations with correlation coefficients for S.cerevisiae growth

如圖3擬合曲線所示，S.cerevisiae在共發(fā)酵過程中生長曲線呈“S”型，在發(fā)酵0～1 d，2 株S.cerevisiae生長速率均較慢，處于生長適應(yīng)期；VW和AW分別于2～4 d和1～5 d處于對數(shù)生長期，此時S.cerevisiae生長速率較快，乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增加。

圖3 Boltzmann模型下S.cerevisiae生長擬合曲線Fig.3 Boltzmann models describing S.cerevisiae growth

2.3.2 乙醇生成動力學(xué)模型

共發(fā)酵模式下乙醇體積分?jǐn)?shù)的動態(tài)變化擬合系數(shù)見表3。對比Logistic模型、Boltzmann模型和SGompertz模型擬合系數(shù)，4 個處理組均以Boltzmann模型擬合效果最好，擬合系數(shù)R2分別為0.99790、0.99860、0.99894和0.99964，表明該模型能夠反映共發(fā)酵模式下乙醇的生成情況，與李俠等[30]對紅棗酒產(chǎn)物擬合模型所選一致。

表3 乙醇生成量的擬合方程及其擬合系數(shù)Table 3 Fitting equations with correlation coefficients for alcohol production

由圖4擬合曲線可知，在整個發(fā)酵過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)的測定值與預(yù)測值均有較好的擬合度。發(fā)酵1 d，4 個處理組乙醇體積分?jǐn)?shù)增加均不明顯，可能是S.cerevisiae生長較緩慢，還原糖利用率低，致使還原糖不能充分轉(zhuǎn)化為乙醇[31]。發(fā)酵1 d后乙醇體積分?jǐn)?shù)大幅度增加，與S.cerevisiae的生長同步進行，其中A、B處理組乙醇體積分?jǐn)?shù)增加較C、D處理組快。發(fā)酵至6～8 d（A、B處理組）和7～10 d（C、D處理組），由于處于發(fā)酵后期，S.cerevisiae生長處于衰亡期，糖轉(zhuǎn)化率降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加緩慢。

圖4 Boltzmann模型下乙醇生成擬合曲線Fig.4 Boltzmann models describing alcohol content

2.3.3 還原糖含量變化動力學(xué)模型

還原糖含量動力學(xué)模型建立的擬合方程、擬合系數(shù)見表4。對比各擬合模型可得Logistic模型能較好反映4 個處理組還原糖含量的變化情況，擬合系數(shù)R2分別為0.99914、0.99946、0.99949和0.99917，此結(jié)果與張琪等[32]對黑加侖果酒發(fā)酵動力學(xué)研究中所選擬合方程一致。

表4 還原糖含量變化的擬合方程及其擬合系數(shù)Table 4 Fitting equations with correlation coefficients for reducing sugar content

由圖5擬合曲線可知，還原糖的消耗與乙醇的生成呈對應(yīng)關(guān)系，隨著S.cerevisiae數(shù)量的增多，乙醇逐漸積累，還原糖含量下降，A、B組和C、D組分別發(fā)酵至8 d和10 d，4 個處理組酒體內(nèi)還原糖質(zhì)量濃度均下降至4 g/L以下，標(biāo)志AF結(jié)束。

圖5 Logistic模型下還原糖含量變化擬合曲線Fig.5 Logistic models describing reducing sugar content

2.3.4 本土O.oeni生長動力學(xué)模型

由圖2可知，本土O.oeni菌株ZX-1和MG-1與S.cerevisiaeVW和AW共發(fā)酵分別于6 d和5 d后進入衰亡期，因此本研究擬對1～6 d（A、B組）1～5 d（C、D組）時期O.oeni生長情況進行非線性擬合。各動力學(xué)模型如表5所示，相比較于Logistic模型，Boltzmann模型和DoseResp模型均對O.oeniZX-1和MG-1數(shù)量變化能進行較好的描述，故選用Boltzmann模型和DoseResp模型對共發(fā)酵過程中O.oeni生長情況進行定量描述。

表5 O.oeni動態(tài)變化的擬合方程及其擬合系數(shù)Table 5 Fitting equations with correlation coefficients for O.oeni growth

由圖6擬合曲線可知，O.oeni在共發(fā)酵早期能快速適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境進入對數(shù)生長期。A、B組和C、D組分別發(fā)酵至5 d和4 d時，由于在AF過程中乙醇逐漸積累增加了細(xì)胞膜的流動性，對O.oeni的生長有一定抑制作用[33]，且酒體內(nèi)大量精氨酸和其他氨基酸被消耗，O.oeni生長變的緩慢，隨后進入穩(wěn)定期。

圖6 Boltzmann模型和DoseResp模型下O.oeni數(shù)量變化擬合曲線Fig.6 Boltzmann and DoseResp models describing O.oeni growth

2.3.5L-蘋果酸含量變化動力學(xué)模型

表6為共發(fā)酵過程中L-蘋果酸含量變化的擬合方程和擬合系數(shù)。對比3 種擬合模型，4 個處理組Boltzmann模型和DoseResp模型擬合系數(shù)R2分別一致（A組：0.99915，B組：0.99951，C組：0.99913，D組：0.99984），高于對應(yīng)的Logistic模型，均能較好反映共發(fā)酵過程中L-蘋果酸含量的變化。

表6 L-蘋果酸含量變化的擬合方程及其擬合系數(shù)Table 6 Fitting equations with correlation coefficients for L-malic acid content

L-蘋果酸可使葡萄酒產(chǎn)生強烈的酸澀感，其在葡萄酒發(fā)酵期間含量的變化是衡量MLF是否完成的重要標(biāo)志[34]。如圖7擬合曲線所示，在共發(fā)酵過程中4 個處理組L-蘋果酸的消耗與O.oeni的生長呈反向趨勢。隨著O.oeni數(shù)量的增長，L-蘋果酸含量逐漸下降，在O.oeni對數(shù)生長時期，L-蘋果酸含量下降速率較快，4 個處理組均于發(fā)酵5 d后L-蘋果酸消耗速率較為緩慢，并分別于發(fā)酵9 d和8 d完成MLF。

圖7 Boltzmann模型和DoseResp模型下L-蘋果酸含量變化擬合曲線Fig.7 Boltzmann and DoseResp models describing L-malic acid content

3 討論

采用模擬葡萄汁為發(fā)酵基質(zhì)，以本土O.oeniZX-1和MG-1分別與S.cerevisiaeVW和AW進行共接種發(fā)酵。結(jié)果表明，不同菌株組合均能順利完成AF和MLF，所選模型能較好描述共發(fā)酵動力學(xué)特征。O.oeni作為主導(dǎo)MLF的主要乳酸菌菌種，對葡萄酒生境具有較高要求。葡萄汁成分復(fù)雜，含有較多野生酵母和雜菌等抑制O.oeni生長的抑制因子[35]。而模擬葡萄汁因其成分簡單，不僅可以滿足微生物生長的需要，在排除其他微生物影響的同時，可以避免不同葡萄品種間理化指標(biāo)差異的影響，且成本低廉，操作可控，有利于研究發(fā)酵機理和微生物的生長特性。段浩云等[36]利用模擬葡萄酒發(fā)酵體系，對篩選所得14 株乳酸菌進行耐受性分析實驗，結(jié)果表明菌株G23與L42綜合耐受能力最強。劉曉嬌等[37]研究O.oeni在不同模擬酒中的降酸效果發(fā)現(xiàn)，O.oeni31MBR和SD-2a在96 h內(nèi)降酸率達(dá)到90%以上。Nehme等[38]在模擬酒中發(fā)現(xiàn)在MLF 500 h時，O.oeniX降解了74%的L-蘋果酸。

在共發(fā)酵過程中，A、B、C、D組S.cerevisiae活菌數(shù)均略低于對照組，這與Mu?oz等[39]對丹娜葡萄汁進行共發(fā)酵的結(jié)果一致。該過程中由于受乳酸菌活性影響，酵母生長動力學(xué)和代謝活性降低。這一結(jié)果可能是由于早期接種發(fā)酵基質(zhì)中較低的乙醇體積分?jǐn)?shù)有利于本土O.oeni生長，造成了營養(yǎng)競爭，且本土O.oeni在生長過程中可能會釋放β-1,3-葡聚糖酶，該酶會水解S.cerevisiae細(xì)胞壁，導(dǎo)致S.cerevisiae活菌數(shù)降低[40]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)O.oeni對S.cerevisiae的生長沒有影響，但會加速S.cerevisiae細(xì)胞的死亡，而S.cerevisiae細(xì)胞死亡速度的加快可能與O.oeni代謝產(chǎn)生的抑制因素有關(guān)[41]。此外，S.cerevisiae合成乙醇和中鏈脂肪酸的濃度和類型會抑制O.oeni的生長，且S.cerevisiae細(xì)胞內(nèi)的陽離子蛋白也可能抑制MLF。然而，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)酵母的自溶活性在很大程度上影響葡萄酒中多肽、氨基酸和蛋白質(zhì)等含氮化合物的濃度，而多肽（＜1000 Da）對O.oeni的生長具有促進作用[42]。Tristezza等[11]對黑曼羅葡萄酒共發(fā)酵結(jié)果表明，菌株CL1能順利完成MLF，而CL2則存在較高的L-蘋果酸殘留量，說明S.cerevisiae與O.oeni之間的相互作用與所選菌株有關(guān)。本研究4 個處理組還原糖消耗率和L-蘋果酸降酸率均可達(dá)到95%以上，進一步說明本土O.oeniZX-1、MG-1和S.cerevisiaeVW、AW共接種可順利完成AF和MLF。

共發(fā)酵過程中菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物生成情況非線性擬合結(jié)果表明，Boltzmann模型對酵母菌生長和乙醇體積分?jǐn)?shù)變化情況擬合效果較好，Logistic模型能較好反映還原糖含量的消耗變化。Boltzmann模型和DoseResp模型擬合系數(shù)R2相同，2種模型均能對共發(fā)酵過程中O.oeni生長和L-蘋果酸的消耗情況進行擬合。李雪等[19]在仙人掌果酒發(fā)酵動力學(xué)研究結(jié)果表明，SGompertz、Logistic和DoseResp模型能較好反映發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)和還原糖含量變化。張琪等[32]研究發(fā)現(xiàn)，黑加侖果酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)和還原糖含量變化均以Logistic模型擬合效果最好。

近年來，越來越多的動力學(xué)模型被應(yīng)用于指導(dǎo)酒類工藝放大生產(chǎn)。微生物菌株的發(fā)酵能力不僅與其自身生理機能有關(guān)，還受到發(fā)酵工藝、條件、過程控制等動力學(xué)規(guī)律的影響[39]。充分了解和掌握發(fā)酵過程中主要理化參數(shù)的變化趨勢，選取適宜的發(fā)酵動力學(xué)數(shù)學(xué)模型，可較為準(zhǔn)確地預(yù)測釀酒過程中關(guān)鍵指標(biāo)的最終水平，對發(fā)酵菌株選擇、工藝優(yōu)化及工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)作用[19]。在后續(xù)研究中，需要進一步通過葡萄酒釀造生產(chǎn)實踐驗證實驗所建立動力學(xué)模型的適用性，深入探討共接種發(fā)酵對酒體的品質(zhì)影響，為定向釀造特色化葡萄酒、提升生產(chǎn)效率及促進本土菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

綜合分析發(fā)酵過程中底物消耗和產(chǎn)物生成的動態(tài)變化趨勢結(jié)果表明，混菌發(fā)酵模式未明顯抑制供試各菌株的生長和發(fā)酵性能，2 株本土O.oeni分別與商業(yè)S.cerevisiaeVW、AW共接種后均可順利完成AF和MLF。不同接種處理組S.cerevisiae活菌數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、還原糖含量、O.oeni活菌數(shù)和L-蘋果酸含量最佳線性擬合模型預(yù)測值和實測值擬合效果良好，可較為客觀反映共發(fā)酵過程微生物生長和特定代謝物轉(zhuǎn)化的動力學(xué)特征。研究結(jié)果有助于揭示共接種發(fā)酵過程中S.cerevisiae和O.oeni的演替變化規(guī)律，對葡萄酒釀造生產(chǎn)中相關(guān)主要指標(biāo)的預(yù)測和工藝優(yōu)化控制具有潛在的應(yīng)用指導(dǎo)價值。