唐 潔， 陳 柯， 馬慧敏， 余 琦， 王運宜， 夏雨晴， 徐 龍△

（1嘉興學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，法醫(yī)與病理實驗室，浙江 嘉興 314001；2嘉興中醫(yī)醫(yī)院病理科，浙江 嘉興 314001）

程序性細(xì)胞死亡在胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，包括凋亡、自噬、焦亡和鐵死亡等多種不同細(xì)胞死亡方式，參與這一精細(xì)而復(fù)雜的過程［1-2］。細(xì)胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種不同于凋亡的，有炎癥和免疫調(diào)控參與的細(xì)胞死亡方式［3］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和炎癥等病理條件相關(guān)。因此，明確細(xì)胞死亡方式可進(jìn)一步了解疾病的發(fā)生發(fā)展，為臨床治療提供靶向治療方向。近年來，caspase-1被認(rèn)為是細(xì)胞焦亡的啟動子，其通過激活不同的炎癥小體，觸發(fā)受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinases， RIPKs）調(diào)節(jié)器，參與多種疾病的病理生理過程［4］。Caspase-1或其上游激活因子AIM2、NLRP3在多種腫瘤中含量較低或不存在，包括結(jié)腸、胃、前列腺、胰腺和乳腺腫瘤［5-6］。抑制caspase-1可增強乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的生長和轉(zhuǎn)移；反之，則抑制結(jié)腸、胰腺和腎癌細(xì)胞的生長，與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的自發(fā)消退，以及急性髓性白血病和骨肉瘤的良好臨床反應(yīng)相關(guān)［7-8］。這些結(jié)果表明，caspase-1依賴性的細(xì)胞死亡方式可能在各種疾病和抗腫瘤效應(yīng)中有著十分重要的作用。

驅(qū)動蛋白家族成員11（kinesin family member 11， KIF11）是一種微管依賴的運動蛋白，由位于10q24.1的KIF11基因編碼，是驅(qū)動蛋白家族的主要成員之一，主要在有絲分裂紡錘體形成中起作用，已被證明與許多腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，其過表達(dá)與腎癌不同分型高度相關(guān)［9-10］。抑制KIF11可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［11-12］。研究表明，KIF11 可能參與多種腫瘤的發(fā)病機制，被認(rèn)為是胰腺癌、非肌肉浸潤性膀胱尿路上皮癌、非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在標(biāo)記分子，抑制KIF11可引起有絲分裂阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，然而其參與乳腺癌機制仍不清楚［13］。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染顯性負(fù)的KIF11到細(xì)胞中可誘導(dǎo)核固縮和細(xì)胞死亡，但免疫細(xì)胞化學(xué)卻檢測不到激活的caspase-3，表明抑制KIF11后介導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式并非是細(xì)胞凋亡。已有研究表明，KIF11氨基酸序列有2個caspase-1切割位點［14-16］。因此，本研究將通過構(gòu)建RIPK2和caspase-1的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到野生型、KIF11低表達(dá)和過表達(dá)的786-O細(xì)胞中，利用活細(xì)胞成像觀測細(xì)胞的死亡方式的差異。

材料和方法

1 材料

人腎透明細(xì)胞腺癌786-O細(xì)胞購自ATCC。細(xì)胞壞死試劑盒和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購買來自碧云天試劑有限公司。質(zhì)粒構(gòu)建的上下游引物由華大基因有限公司設(shè)計合成。

2 方法

2.1 生物信息分析 TIMER2.0數(shù)據(jù)庫（http：//timer.cistrome.org/）用于分析不同腫瘤類型的免疫浸潤，提供多種免疫反卷積方法估計的免疫浸潤豐度，來全面探索腫瘤免疫學(xué)、臨床和基因組的特征。The UALCAN 數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/）主要基于TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)腫瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行生物標(biāo)記物鑒定、表達(dá)譜分析，生存分析等。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)方法和細(xì)胞特性進(jìn)行細(xì)胞傳代和接種。通過構(gòu)建pCIG-RIPK2、pTEX-caspase-1、pCAS9-KO1、pCAS9-KO2、pCAS9-Scramb、pUC19-KIF11-L-PURO-R和KIF11-RFP和KIF11-GFP融合蛋白質(zhì)粒，利用慢病毒感染細(xì)胞的方法構(gòu)建KIF11低表達(dá)和KIF11過表達(dá)的786-O細(xì)胞系。

2.3 Western blot Western blot實驗方法根據(jù)抗體說明數(shù)書進(jìn)行操作，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取總蛋白質(zhì)。檢測蛋白濃度，上樣蛋白總量在60 μg，接著電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，Ⅰ抗、Ⅱ抗、孵育，曝光，GAPDH作為內(nèi)參。KIF11抗體為鼠抗KIF11抗體（sc-374212， 1∶1 000），cleaved消皮素D（gasdermin D， GSDMD）抗體為兔抗cleaved GSDMD抗體（#36425， 1∶1 000），Ⅱ抗為羊抗鼠和羊抗兔 IgG-HRP 抗體（#7076s和#7074s， 1∶5 000），GAPDH蛋白抗體為鼠抗（#97166s， 1∶2 000），caspase-1 p20抗體為兔抗（#4199， 1∶1 000），GSDMD抗體為兔抗（#69469，1∶1 000），IL-1β抗體為兔抗（#12703， 1∶1 000），cleaved IL-1β抗體為兔抗（#83186，1∶1 000）。

2.4 Confocal實驗 把細(xì)胞接種到30 mm的玻璃皿中，接種的細(xì)胞數(shù)大約是5×104。等待24 h之后，依照上面的轉(zhuǎn)染步驟轉(zhuǎn)染細(xì)胞。觀察24 h以內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的動態(tài)變化。設(shè)定參數(shù)：實驗要求在20×的顯微鏡下觀察，首先切換到熒光顯微鏡的觀察界面，然后在20×的鏡頭下找到細(xì)胞。然后再切換到Locate的狀態(tài)下設(shè)置參數(shù)，參數(shù)設(shè)定包括視野范圍：371.6×371.6。后期處理：使用ZEN軟件處理，添加標(biāo)尺和時間序列導(dǎo)出視頻（avi）和圖片（TIFF）。

2.5 LDH測定 把細(xì)胞接種到96孔板中，24 h貼壁。轉(zhuǎn)染RIPK2和caspase-1質(zhì)粒后，24 h后，根據(jù)LDH檢測試劑說明書，測定上清液LDH水平。

2.6 熒光染色法 將細(xì)胞接種到60 mm的培養(yǎng)皿中，每種細(xì)胞分別接種兩個皿，接種的細(xì)胞數(shù)在1×106左右。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；根據(jù)上面闡述的轉(zhuǎn)染步驟，其中一個皿用來同時轉(zhuǎn)染RIPK2和caspase-1，另外一個皿用于轉(zhuǎn)染pCIG，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；在每個培養(yǎng)皿中分別加入5 μL的PI 和Hoechst 33342，在搖床上搖晃5 min。在熒光顯微鏡下觀察，然后拍照，并計數(shù)不同細(xì)胞之間能夠染上PI的數(shù)目進(jìn)行比較。

2.7 免疫組化 組織固定、脫水、包埋制成蠟塊。連續(xù)切片，大約3 mm左右覆于黏附載玻片上，65 ℃烤片2 h。首先進(jìn)行脫蠟、梯度乙醇，入水洗凈；EDTA水浴加熱20 min，逐步冷卻，用水沖洗；放入過氧化氫10 min，TBST沖洗，滴加Ⅰ抗（KIF11），室溫1 h；TBST沖洗3次，滴加Ⅱ抗30 min；TBST沖洗3次；配制DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組之間的結(jié)果采用單因素方差分析，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩組內(nèi)分析。兩組間定量資料采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 KIF11在大多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)，臨床預(yù)后較差，且和caspase-1、GSDMD表達(dá)呈正相關(guān)

使用TIMER和UALCAN數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)（圖1），在大多數(shù)常見的腫瘤中，KIF11在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常癌旁組織（圖1A）。腎透明細(xì)胞癌中KIF11表達(dá)顯著高于正常癌旁組織（圖1B，P＜0.01）。免疫組化結(jié)果分析，KIF11定位在腎小管細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)，并且在腎癌中表達(dá)高于正常組織（圖1C）。在腎透明細(xì)胞癌中，其中腫瘤組織533例，正常組織72例，分析發(fā)現(xiàn)KIF11高表達(dá)的生存期顯著低于KIF11低表達(dá)患者（圖1D，P＜0.05）。KIF11與GSDMD、caspase-1的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.01，圖1E、F）。因此，KIF11作為一個致癌基因，在惡性腫瘤中高表達(dá)，且影響腫瘤患者的預(yù)后。同時，KIF11表達(dá)和炎癥因子caspase-1、細(xì)胞焦亡相關(guān)基因GSDMD呈正相關(guān)。

2 構(gòu)建KIF11敲除和高表達(dá)的786-O細(xì)胞系

利用Crisper-Cas9的基因編輯技術(shù)構(gòu)建KIF11敲除的786-O細(xì)胞系（圖2A），發(fā)現(xiàn)使用Crisper-Cas9的基因編輯技術(shù)無法完全敲除KIF11基因，推測只能敲除KIF11基因的其中一條等位基因。KIF11作為細(xì)胞有絲分裂調(diào)控的重要基因，完全敲除KIF11，可能會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。通過構(gòu)建KIF11-GFP和KIF11-RFP融合蛋白質(zhì)粒，通過慢病毒轉(zhuǎn)染，篩選出穩(wěn)定高表達(dá)KIF11的786-O細(xì)胞系（圖2B）。

3 共轉(zhuǎn)染RIPK2和caspase-1呈現(xiàn)KIF11水平依賴性的不同細(xì)胞死亡形式

共轉(zhuǎn)染RIPK2和caspase-1質(zhì)粒后，通過共聚焦顯微鏡連續(xù)觀察24 h的WT，KIF11+/-和KIF11+/+細(xì)胞系不同時段的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（圖3）。在WT和KIF11+/+中，細(xì)胞發(fā)生凋亡，形成很多大小不一樣的凋亡小體。相反，在KIF11+/-中，細(xì)胞沒有形成類似凋亡小體的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞膨脹變大，細(xì)胞內(nèi)GFP熒光消失，細(xì)胞內(nèi)容物漏出，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。因此，低表達(dá)KIF11促使細(xì)胞更容易發(fā)生焦亡。

4 凋亡小體和焦亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和大小差異

在轉(zhuǎn)染RIPK2和caspase-1到KIF11表達(dá)不同的786-O細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)焦亡小體（圖4A）和凋亡小體的（圖4B、C）細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。焦亡體細(xì)胞體積變大，凋亡體細(xì)胞會分裂形成大小不一的凋亡小體，有的會產(chǎn)生排列整齊如同繩株狀結(jié)構(gòu)。通過測量凋亡體細(xì)胞和焦亡細(xì)胞的大?。▓D4D、F），發(fā)現(xiàn)和正處于有絲分裂中期的正常細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞的體積明顯減少，但焦亡細(xì)胞體積明顯增大。因此，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞大小可以明顯區(qū)別焦亡體和凋亡小體。

5 KIF11低表達(dá)的細(xì)胞更容易發(fā)生細(xì)胞焦亡

Figure 1. KIF11 as an oncogene was analyzed from TIMER and UALCAN database. A： differences in the expression of KIF11 between different tumors and normal tissues as well as in various common cancers； B： the expression of KIF11 in renal clear cell carcinoma （KIRC） was higher than that in normal tissues； C： the expression of KIF11 in paracancerous tissues and renal cancer was detected by immunohistochemistry（scale bar=50 μm）； D： survival analysis between high and low KIF11 expression patient； E and F： the expression of KIF11 was positively correlated with caspase-1 and GSDMD. Mean±SD.**P＜0.01 vs normal group.圖1 通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析致癌基因KIF11

在轉(zhuǎn)染RIPK2和caspase-1到KIF11表達(dá)不同的786-O細(xì)胞中，24 h后加入PI和Hoechst染色，發(fā)現(xiàn)KIF11+/-細(xì)胞的PI染色明顯的高于KIF11+/+和WT細(xì)胞（P＜0.01，圖5A、B）。通過檢測LDH水平，發(fā)現(xiàn)KIF11+/-細(xì)胞的LDH明顯高于KIF11+/+和WT細(xì)胞（P＜0.01，圖5C）。另外，通過Western blot分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡通路相關(guān)蛋白被激活。RIPK2/caspase-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中caspase-1 p20、GSDMD-NT和cleaved I L-1β蛋白表達(dá)上調(diào)，同時，在KIF11低表達(dá)的細(xì)胞中更為顯著（圖6）。因此，KIF11低表達(dá)的細(xì)胞更容易發(fā)生細(xì)胞焦亡。

討 論

KIF11是驅(qū)動蛋白家族11號成員，屬于驅(qū)動蛋白5家族，在四聚體微管交聯(lián)、細(xì)胞有絲分裂以及細(xì)胞周期和分化中具有重要作用［17］。大部分研究顯示， KIF11高表達(dá)和腫瘤患者的生存期和治療預(yù)后相關(guān)［18］。在更高級別的疾病和惡性乳腺癌細(xì)胞中，KIF11顯著上調(diào)，當(dāng)KIF11表達(dá)降低時，可觀察到細(xì)胞增殖、集落形成、侵襲和遷移能力減弱，但是細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡［19］。通過生信分析，發(fā)現(xiàn)KIF11在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)，特別是乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌和腎透明細(xì)胞癌中。免疫組化結(jié)果顯示，KIF11在腎癌中的表達(dá)明顯高于正常組織，且定位在腎小管的胞核和胞質(zhì)中。在腎透明細(xì)胞癌中，KIF11低表達(dá)的患者有更長的生存期，且KIF11的表達(dá)與炎癥相關(guān)因子caspase-1和焦亡相關(guān)蛋白GSDMD的表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系。

Figure 2. The cell lines with low expression （A） and over-expression （B） of KIF11 were constructed in 786-O cells. The protein levels of KIF11 were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs WT group.圖2 構(gòu)建低表達(dá)和過表達(dá)的KIF11的786-O細(xì)胞系

Figure 3. Co-transfection plasmids of RIPK2 and caspase-1 made a distinction form of cell death in WT， KIF11+/- and KIF11+/+ cell lines. The observation by confocal microscope at continuing 24 h to detect a series of morphological changes.圖3 共轉(zhuǎn)染RIPK2和caspase-1，觀察野生、KIF11低表達(dá)和過表達(dá)的786-O細(xì)胞系死亡方式的差異

Figure 4. The morphology and size distinguished from WT， KIF11+/- and KIF11+/+ cell lines by co-transfection plasmids of RIPK2 and caspase-1. A～C： the morphology changes by confocal microscope were observed； D～F： the size of apoptotic body and necroptotic body in comparison with normal cells.圖4 不同死亡方式的形態(tài)學(xué)和尺寸差異

前期研究發(fā)現(xiàn)，在KIF11的氨基酸序列上有兩個caspase-1的酶切位點。因此，我們通過構(gòu)建野生、KIF11低表達(dá)和KIF11高表達(dá)的786-O細(xì)胞系，探究了caspase-1與KIF11之間的關(guān)系。Caspase-1是一個炎癥小體相關(guān)蛋白，炎癥小體招募ASC后結(jié)合procaspase-1，形成一個新的復(fù)合物，激活成熟的caspase-1，釋放炎癥因子 IL-1β 和 IL-18［20-21］。最近大量研究發(fā)現(xiàn)，激活的caspase-1，能夠切割下游的GSDMD，引起細(xì)胞焦亡，刺激機體的不同的免疫效應(yīng)［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染RIPK2和caspase-1到3種KIF11表達(dá)水平不同的細(xì)胞中可激活細(xì)胞焦亡通路，伴隨caspase-1 p20、GSDMD-NT和 cleaved IL-1β 表達(dá)上調(diào)，在KIF11低表達(dá)的細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞焦亡，野生和過表達(dá)的細(xì)胞相對較少。因此，我們推測，KIF11低表達(dá)是不是能夠介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。隨后，通過PI和Hoechst染色和LDH釋放實驗，發(fā)現(xiàn)KIF11低表達(dá)的細(xì)胞PI染色和LDH明顯上調(diào)。以上結(jié)果表明，KIF11作為一個癌基因，在caspase-1的介導(dǎo)下能夠影響細(xì)胞死亡方式。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析驗證了KIF11作為一個癌基因，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，同時通過RIPK2激活caspase-1，能夠調(diào)控KIF11介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的發(fā)生。不同細(xì)胞死亡方式激活機體不同的免疫效應(yīng)，通過抑制細(xì)胞內(nèi)KIF11的表達(dá)，不僅能夠抑制惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，還可激活機體內(nèi)免疫效應(yīng)，進(jìn)一步清除腫瘤細(xì)胞。因此，KIF11抑制劑和小分子藥物的開發(fā)，可為臨床抑制惡性腫瘤，提高腫瘤患者的生存期提供新的研究方向。對于其他惡性腫瘤的發(fā)生，低表達(dá)KIF11是否仍然能夠介導(dǎo)caspase-1依賴性的細(xì)胞焦亡，仍需進(jìn)一步研究論證。

Figure 5. KIF11+/- cell lines were more likely to induce pyroptosis by co-transfection plasmids of RIPK2 and caspase-1. A and B： PI-positive cell number was increased in KIF11+/- cells were measured by microscope （×20）； C： the intracellular LDH release was significantly increased in KIF11+/- cells； D： the protein expression of cleaved GSDMD was detected by immunofluorescence staining. Mean±SD. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs WT group.圖5 KIF11低表達(dá)的細(xì)胞更容易發(fā)生細(xì)胞焦亡

Figure 6. Pyroptosis pathway was activated by co-transfection of RIPK2/caspase-1. Pyroptosis-related proteins were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs WT-pCIG group； ##P＜0.01 vs WT group； △P＜0.05， △△P＜0.01 vs KIF11+/- group.圖6 共轉(zhuǎn)染RIPK2和caspase-1激活細(xì)胞焦亡通路