張海峰， 李春英， 陳麗新 ， 王立偉△

（1西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，陜西 西安 710061；2麗水學(xué)院，浙江 麗水 323000；3暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院生理學(xué)系，廣東 廣州 510632）

細胞體積過度變化會破壞其結(jié)構(gòu)完整和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而影響其生存；細胞容積調(diào)節(jié)廣泛參與各種細胞功能，是細胞基本的生命活動之一［1-2］。突起形成是細胞局部體積可控性增大的過程，在多種膜成分（包括離子通道）參與下，以微絲或微管骨架蛋白為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的細胞變形過程，在細胞遷移、細胞黏附、細胞通訊以及吞噬作用等中起著關(guān)鍵作用［3-4］。

容積調(diào)控性陰離子通道（volume-regulated anion channel， VRAC）是一類具有種屬、組織細胞差異性的復(fù)雜功能蛋白。電壓門控氯通道3（voltage-gated chloride channel 3， ClC-3）被認為是VRAC候選蛋白之一，在多種腫瘤組織中異常表達和（或）功能上調(diào)，與其他相關(guān)蛋白共同調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡和遷移等［5-8］。

細胞膜邊緣形成突起是驅(qū)動細胞移動的關(guān)鍵步驟，課題組前期研究成果顯示：ClC-3不依賴其VRAC通道特性能促進遷移細胞的片狀偽足前緣褶皺形成，可誘導(dǎo)角蛋白18磷酸化從而介導(dǎo)β1-整合素向片狀偽足前緣褶皺處轉(zhuǎn)運，有助于肝癌細胞遷移；阻斷ClC-3通道功能，不能抑制片狀偽足前緣褶皺形成，但可抑制肝癌細胞遷移［8-9］。這些結(jié)果提示，分布于遷移細胞片狀偽足亞區(qū)域的ClC-3借助其VRAC和非VRAC特性發(fā)揮著不同作用。

細胞貼壁生長時伸出突起，對于黏附培養(yǎng)基質(zhì)維持其生長至關(guān)重要。ClC-3能影響細胞遷移時片狀偽足的形成，而在細胞貼壁生長時伸出突起中的作用尚不清楚。因此，本研究擬以高分化鼻咽癌細胞系CNE-1為研究對象，探討ClC-3對細胞貼壁生長時伸出突起的影響，有助于深入理解局部細胞容積調(diào)節(jié)機制。

材料和方法

1 主要試劑

ClC-3抗體購自Abcam；β-actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG、細胞核染料DAPI、氯離子熒光探針MQAE、細胞膜染料DiI、RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo Fisher。

小干擾 RNA（small interfering RNA， siRNA）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。經(jīng)高效液相色譜法分離后再行電泳檢測，siRNA的5'端攜帶FAM熒光標記物。陰性對照（negative control， NC）siRNA的序列為 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，ClC-3特異性siRNA的序列為5'-CAAUGGAUUUCCUGUCAUATT-3'。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 CNE-1細胞購自湖南湘雅典型培養(yǎng)物保藏中心［10］，用含新生牛血清、青霉素和鏈霉素的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)在5%CO2、100%濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)。細胞懸液種于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞融合率達到30%～50%，按照以下簡要步驟轉(zhuǎn)染細胞：不含血清和抗生素的培養(yǎng) 液 分別 稀 釋 LipofectamineTM2000（1∶40）和 20 μmol/L siRNA（1∶20）；室溫孵育5 min后，將上述懸液混合，再孵育20 min；將siRNA和LipofectamineTM2000混合溶液逐滴緩慢滴加到各組實驗孔內(nèi)，各組siRNA終濃度為100 nmol/L；細胞繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后換正常培養(yǎng)液，待轉(zhuǎn)染48 h行后續(xù)實驗。

2.2 免疫熒光 CNE-1細胞懸液種于內(nèi)貼無菌圓形蓋玻片（直徑6 mm；面積28.26 mm2）的24孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞過夜培養(yǎng)或貼壁后，4%低聚甲醛溶液固定細胞15 min；PBS洗滌細胞6次后，0.5%Triton X-100孵育細胞5 min；PBS洗滌細胞6次后，采用10%血清室溫下封閉細胞45 min；用1%血清洗滌細胞一次，4 ℃過夜孵育ClC-3稀釋抗體；1%血清洗滌細胞6次后，室溫下孵育稀釋Ⅱ抗1 h；PBS洗滌細胞6次后，DAPI染細胞核5 min；最后PBS洗滌細胞3次后，50%甘油碳酸鹽緩沖液封片，指甲油封邊。在Nikon C1-Si激光共聚焦顯微鏡下，觀察熒光標記并拍照。

2.3 Western blot siRNA轉(zhuǎn)染CNE-1細胞48 h后，RIPA裂解液（含終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF）冰上裂解細胞30 min，4 ℃離心（9 720×g）裂解液后收集上清液；BCA法測定各組蛋白質(zhì)濃度并標準化為相同濃度，加入適量5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。12% SDS-PAGE分離蛋白，每個泳道上樣量不少于40 μg；半干法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；室溫下，5%脫脂奶粉溶液封閉膜2 h后，4 ℃過夜孵育Ⅰ抗，TBS洗脫未結(jié)合或非特異結(jié)合的Ⅰ抗；室溫孵育辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗2 h后，TBS洗脫未結(jié)合或非特異結(jié)合的Ⅱ抗；采用化學(xué)發(fā)光法顯示硝酸纖維素膜上目的蛋白，Alliance 4.7凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進行灰度分析。

2.4 氯離子熒光探針檢測 MQAE熒光染料最大激發(fā)波長約為355 nm，最大發(fā)射波長約為460 nm，其熒光強度隨著氯離子濃度的增加而成比例減?。?1］。因未配備波長355 nm左右激光模塊，擬采用408 nm激光激發(fā)MQAE，分析其發(fā)射光譜特性后用于測定細胞內(nèi)氯離子。

常規(guī)胰酶消化CNE-1細胞后種于共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿內(nèi)，待細胞貼壁后更換含5 mmol/L MQAE的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h ；采用408 nm激光激發(fā)MQAE，采集415～570 nm區(qū)間發(fā)射光光譜數(shù)據(jù)，觀察不同波長的熒光強度特征，并進行擬合計算其最大發(fā)射光波長。408 nm激光激發(fā)含不同濃度 Cl-溶液（0、1.25、2.5、5、10、20、40、60、80、120和140 mmol/L），采集各組最大發(fā)射光熒光強度，繪制濃度-熒光強度曲線，與前期研究結(jié)果比較。

CNE-1細胞貼壁生長12 h待其伸出突起，更換含5 mmol/L MQAE的細胞培養(yǎng)液后繼續(xù)孵育1 h；接著，膜熒光DiI染料室溫染色10 min，洗脫干凈后放入培養(yǎng)箱平衡30 min；而后在激光共聚焦顯微鏡下，用408 nm激光和515/30濾片組觀察MQAE熒光在細胞內(nèi)的分布情況。

2.5 單通道膜片鉗 CNE-1細胞懸液滴在無菌圓形蓋玻片（直徑22 mm；面積379.94 mm2）上過夜培養(yǎng)，待細胞長出突起后，將蓋玻片放置灌流槽內(nèi)，持續(xù)灌流等滲液（70 mmol/L NaCl、0.5 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L HEPES 和 140 mmol/L D-甘露醇）。采用EPC-7型膜片鉗放大器（Heka）和CED1401型數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器（Cambridge Electronic Design）鉗制膜電位并記錄電流，其步驟如下：含有等滲灌流液的玻璃微電極入水并調(diào)節(jié)液接電位；三維操縱儀操控微電極使其尖端輕壓細胞，在吸管內(nèi)施加負壓，使吸管尖端與記錄膜片表面形成GΩ級封接（giga-seal）并補償電容；等滲液持續(xù)灌流，按預(yù)先設(shè)置的指令電壓±20、±40、±60、±80、±120和0 mV循環(huán)鉗制膜電位，記錄電流；分析電流特性并計算電流密度，計算公式為：電流密度（pA/pF）=細胞電流值（pA）/細胞電容（pF）。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SigmaPlot 12.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）形式表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ClC-3在CNE-1細胞突起局部分布明顯

體外培養(yǎng)的永生化鼻咽上皮細胞和低分化鼻咽癌細胞分別呈長梭形或多角形，而CNE-1細胞貼壁生長時會向多個方向伸出明顯的突起。為探討ClC-3在細胞膜伸出突起中的作用，我們首先分析了ClC-3蛋白在CNE-1細胞中的分布情況。如圖1所示，貼壁生長的CNE-1細胞朝不同方向伸出片狀偽足，其上有數(shù)量不等的絲狀偽足；Alexa Fluor 488熒光標記抗體識別ClC-3蛋白呈綠色，ClC-3主要定位于細胞膜和細胞質(zhì)，少量分布在細胞核，且在細胞膜分布有明顯聚集特性，即細胞膜突起形成部位較多。

2 氯離子熒光探針檢測CNE-1細胞氯通道活動

為觀察CNE-1細胞膜突起處ClC-3通道活動，利用MQAE熒光染料檢測該部位氯離子濃度，以探討氯通道活動。如圖2A、B所示，CNE-1細胞孵育MQAE染料后，利用408 nm激光激發(fā)后收集MQAE發(fā)射光光譜數(shù)據(jù)，各細胞最大熒光強度的發(fā)射光波長均在520 nm左右；對19個發(fā)射光譜數(shù)據(jù)進行擬合計算，得到最大發(fā)射光波長的理論值為521 nm（圖2C）。接著，利用408 nm波長激光和515/30 nm濾片組測定不同濃度氯離子（1.25～140 mmol/L）的MQAE熒光強度，濃度-熒光強度曲線顯示：熒光強度隨著氯離子濃度的增加而減小（圖2D）。

CNE-1細胞貼壁生長伸出突起后，MQAE和DiI熒光染料分別孵育細胞后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞突起處MQAE熒光。如圖2E～G所示，408 nm激光激發(fā)MQAE后呈綠色熒光，胞體熒光強度不均一；DiI標記胞膜脂質(zhì)呈紅色熒光，可見片狀偽足及絲狀偽足的MQAE熒光弱，而胞膜伸出片狀偽足起始處的MQAE熒光強（片狀偽足根部）。

3 吸附式單通道膜片鉗記錄CNE-1細胞突起部位氯通道活動

Figure 1. Identification of ClC-3 in well-differentiated nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells （scale bar=10 μm）. The CIC-3 protein in CNE-1 cells was labeled with Alexa Fluor 488 （green）， and cellular nuclei were stained with DAPI. The white arrows showed ClC-3 clustering in the protrusion of the cell membrane.圖1 免疫熒光標記高分化鼻咽癌細胞ClC-3氯通道

如圖3所示，在倒置顯微鏡下，記錄微電極吸附突起根部胞膜并形成GΩ級封接；去極化電位能誘使單通道開放頻率增加，在-120 mV鉗制電壓下，該通道電導(dǎo)約為78.4 pS；依據(jù)電流-電壓關(guān)系，計算出該電流的翻轉(zhuǎn)電位為4.06 mV，其值遠離鈉離子和鉀離子平衡電位，接近氯離子平衡電位。

4 下調(diào)ClC-3表達抑制CNE-1細胞突起形成

為探討細胞突起形成中ClC-3蛋白的作用，觀察下調(diào)ClC-3蛋白表達對CNE-1細胞突起形成之影響。FAM標記的NC siRNA和ClC-3siRNA轉(zhuǎn)染CNE-1細胞24 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到幾乎所有細胞都帶有綠色熒光（圖4A）。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，NC siRNA和ClC-3siRNA組轉(zhuǎn)染率均大于90%（圖4B）。ClC-3siRNA轉(zhuǎn)染CNE-1細胞48 h后，Western blot結(jié)果顯示ClC-3蛋白表達量顯著降低（圖4C）。

CNE-1細胞懸液種植于細胞培養(yǎng)板，待其貼壁后行siRNA轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染6 h時，對照組、NC siRNA組以及ClC-3siRNA組細胞向多方向伸出明顯突起，包括片狀偽足和絲狀偽足；轉(zhuǎn)染30 h時，胰酶消化細胞至突起消失時即刻終止消化，細胞變圓無偽足；繼續(xù)培養(yǎng)細胞至48 h，對照組和NC siRNA組細胞伸出明顯的片狀偽足，ClC-3siRNA組細胞無片狀偽足伸出，而3組細胞均有數(shù)量不等的絲狀偽足形成（圖5）。

討 論

細胞膜突起形成是典型的局部細胞容積調(diào)節(jié)。機體發(fā)育、免疫應(yīng)答、傷口愈合、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等過程中，細胞膜邊緣突起并形成片狀偽足是驅(qū)使細胞移動的關(guān)鍵步驟；在神經(jīng)突起生長過程中，神經(jīng)元胞體在特定部位伸出軸突和樹突的第一步亦是胞膜形成突起；細胞在體內(nèi)、外生長時，伸出突起是細胞粘附基質(zhì)或探測外界信號，從而維持其生長的策略［12-14］。

VRAC分布廣泛，參與多種生理和（或）病理生理過程，然而其分子本質(zhì)卻一直存在爭議。由先天性丙種球蛋白缺乏癥患者分離出的含富亮氨酸重復(fù)蛋白8A （leucine-rich repeat-containing 8A， LRRC8A）［15］，被認為是VRAC的主要組分［16-17］。但并非所有組織細胞的容積調(diào)節(jié)皆由LRRC8A介導(dǎo)，例如：bestrophin 1蛋白在小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞缺乏表達，而人視網(wǎng)膜色素上皮細胞卻依賴其進行容積調(diào)節(jié)［18］；囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子CFTR參與小腸上皮、呼吸道上皮的細胞容積調(diào)節(jié)，以及anoctamin 1通道蛋白是外分泌腺、脈絡(luò)叢等處細胞容積調(diào)節(jié)的主要參與者［19］；人表皮樣癌KCP-4細胞缺乏VRAC氯電流并不取決于LRRC8A的低表達；TTYH1和（或）TTYH2介導(dǎo)胃癌SNU-601細胞、肝癌HepG2細胞、結(jié)腸癌LoVo細胞VRAC氯電流，不依賴LRRC8A表達［20］?？梢?，VRAC分子本質(zhì)具有多樣性。

本課題組前期已證實ClC-3是介導(dǎo)鼻咽上皮細胞及鼻咽癌細胞VRAC電流的主要成分，參與細胞增殖、凋亡等［5-6，21］。ClC-3促進鼻咽癌細胞G1-S期過渡，與其影響cyclin D1、CDK4/6及CDK抑制因子p21/p27表達有關(guān)［22］，且 cyclin D1/CDK4或6可通過磷酸化調(diào)控ClC-3通道功能［5］。鼻咽癌細胞凋亡早期，ClC-3蛋白表達短暫上調(diào)［6，23］；紫杉醇誘導(dǎo)的聚合微管蛋白可持續(xù)激活ClC-3通道開放，促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡性容積減?。?］。

遷移細胞前緣伸出片狀偽足，是局部體積可控性增大的過程。阻斷ClC-3蛋白表達或功能，可明顯抑制腫瘤細胞、子宮內(nèi)膜細胞、表皮干細胞等多種類型細胞的遷移［24-28］。ClC-3參與遷移細胞片狀偽足前緣褶皺的形成，從而促進肝癌細胞遷移［8-9］。這些提示ClC-3在細胞膜伸出突起形成片狀偽足過程中具有一定作用。本研究下調(diào)CNE-1細胞ClC-3蛋白后，觀察到細胞無片狀偽足伸出，而有數(shù)量不等的絲狀偽足形成，說明ClC-3參與貼壁細胞生長時片狀偽足的形成，而對絲狀偽足的形成影響可能較小。

Figure 2. Activities of chloride channels detected by chloride sensitive fluorescent probe MQAE in CNE-1 cells. A： images of fluorescent emission spectrum of MQAE excited by the 408 nm laser； B： curves of intensity and wavelength for the MQAE fluorescent emission spectrum of the 4 representative CNE-1 cells； C： the calculated curve of intensity and wavelength for the MQAE fluorescent emission excited by the 408 nm laser （19 cells）； D： the curve of Cl- concentration （1.25～140 mmol/L）and fluorescence intensity of 515/30 nm emission excited by the 408 nm laser （n=4 to 6）； E： fluorescent image （scale bar=10 μm） of Cl- detected by MQAE （green） in CNE-1 cells； F： merged image （scale bar=10 μm） of Cl- fluorescence and cell membrane fluorescence stained by DiI（red）； G： pseudo-color image （scale bar=10 μm） of MQAE fluorescent emission corrected using the Nikon NIS-Elements AR software.圖2 氯離子熒光探針檢測CNE-1細胞氯通道活動

細胞貼壁生長時伸出突起與遷移細胞突起形成的生物學(xué)意義不盡相同，但二者形態(tài)變化相似，均是局部體積可控性增大的過程。ClC-3和水通道3（aquaporin-3， AQP-3）可形成蛋白復(fù)合體，協(xié)同調(diào)控鼻咽癌細胞調(diào)節(jié)性容積減小過程；此外，在CNE-1細胞突觸處，我們觀察到大量ClC-3位于AQP-3后方［29-30］。鑒于二者在細胞容積調(diào)節(jié)中相互作用，其在突觸處的典型分布對突起形成有何意義，尚待進一步闡述。

本研究結(jié)果顯示細胞突起延伸部位MQAE熒光弱，Cl-濃度高，而突起根部MQAE熒光強，Cl-濃度低；活躍的ClC-3通道蛋白在突起根部大量聚集，可能是導(dǎo)致該部位Cl-濃度低的主要原因之一；從細胞突起一側(cè)至突起根部，存在著Cl-濃度梯度差。ClC-3在突起膜分布較少，Cl-可從高濃度的突起側(cè)擴散至低濃度突起根部，ClC-3通道開放致Cl-外流，并帶動由突起前緣進入的水分子外流，從而調(diào)控細胞膜局部延伸形成突起或偽足。

Figure 3. Activities of chloride channels recorded by single-channel patch-clamp of the cell-attached model in the protrusions of CNE-1 cells. A： the protrusion root of the CNE-1 cell was attached and sealed by the recording pipette filled with the isotonic solution （×200）； B： the typical traces of Cl- currents of a single channel at the clamped voltage of 120， 80， 40， 0， -40， -80 and -120 mV； C： the current-voltage relationship of a single chloride channel （n=7）.圖3 吸附式單通道膜片鉗記錄CNE-1細胞突起部位氯通道活動

Figure 4. Down-regulation of ClC-3 protein expression by small interfering RNA（siRNA） in CNE-1 cells. A： CNE-1 cells were observed under laser confocal microscope （scale bar=50 μm）； B： the transfection efficiency of NC siRNA and ClC-3 siRNA in CNE-1 cells detected by flow cytometry； C： the protein expression of ClC-3 in CNE-1 cells down-regulated by siRNA was assayed by Western blot. Mean±SEM. n=4. **P＜0.01 vs NC siRNA group.圖4 小干擾RNA下調(diào)CNE-1細胞ClC-3蛋白表達

Figure 5. Down-regulation of ClC-3 inhibited the formation of CNE-1 cell protrusions （scale bar=20 μm）. The columns from the left to the right showed the images of CNE-1 cells transfected with siRNA for 6， 30 and 48 h， respectively. The cells were digested by trypsin in the 30 h column.圖5 下調(diào)ClC-3蛋白抑制CNE-1細胞突起形成

綜上所述，ClC-3通過參與細胞突起部位Cl-濃度梯度差的維持，從而調(diào)控細胞片狀偽足的形成，是其調(diào)控細胞生長的可能途徑之一。然而，在細胞膜突起延伸形成片狀偽足的過程中，ClC-3和AQP-3協(xié)同機制亟待進一步探討。