宗利東，殷紅敏，楊 銀，趙維玉，徐粉慧，韓培鈺，崔鳳靈，何明仙，張云智*

（1.大理大學公共衛(wèi)生學院，大理大學預(yù)防醫(yī)學研究所，云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室，云南省高校人獸共患病跨境防控與檢疫重點實驗室，大理 671000；2.大理州第二人民醫(yī)院，大理 671000）

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）屬于肝炎病毒科（Hepeviridae），引起的病毒性肝炎稱為戊型肝炎。該病是一種主要經(jīng)糞-口傳播、也可通過血液和母嬰傳播、以家畜或野生動物為宿主的人獸共患病［1］。戊型肝炎病毒感染在臨床上常常引起患者發(fā)熱，普通人群致死率約為1%，孕婦及嬰幼兒致死率高達15%～25%［2-4］。HEV 每年造成約2 000 萬人感染，2015 年造成全球約4.4 萬人死亡［5］。2022 年，國際病毒分類學委員會（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將戊型肝炎病毒科分為正戊型肝炎病毒（Orthohepevirinae，OHEV）和副戊型肝炎病毒（Parahepevirinae，PHEV）2 個亞科，其中，OHEV 含4 屬9 種，PHEV 含1 屬1 種［6］。OHEV 感染哺乳動物和鳥類，PHEV 感染魚類［7］。OHEV 的4 個屬分別為：1）靈長偶蹄樹鼩兔形目戊型肝炎病毒屬（Paslahepevirus，PASLHEV）（2 種），感染靈長目（Primates）、偶蹄目（Artiodactyla）、樹鼩目（Scandentia）和兔形目（Lagomorpha）動物，其中，巴拉揚尼種（Paslahepevirus balayani）可分8個基因型（HEV-1～HEV-8），主要感染人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、單峰駱（Camelus dromedarius）和雙峰駝（Camelus bactrianus）；2）嚙齒食肉目戊型肝炎病毒屬（Rocahepevirus，RCHEV）（2 種），感染嚙齒目（Rodentia）和食肉目（Carnivora）動物，其中，家鼠種（Rocahepevirus ratti）分為HEV-C1［感染家鼠屬（Rattus）和臭鼩鼱（Suncus murinus）］、HEV-C2［感染雪貂（Mustela putorius）］和HEV-C3［感染田鼠（Apodemus）］3 個基因型；3）翼手目戊型肝炎病毒屬（Chirohepevirus，CHHEV）（3 種），感染翼手目（Chiroptera）動物；4）禽類戊型肝炎病毒屬（Avihepevirus）（2種），感染禽類（Avian）。

HEV基因組為單股正鏈RNA，全長約為7.2 kb，通常包含3 個開放閱讀框（open reading frame，ORF）。ORF1 的長度約占整個基因組的2/3，編碼與復(fù)制相關(guān)的多聚蛋白。蛋白由1 693 個氨基酸組成，含7 個功能域，包括甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，Met）、Y 結(jié)構(gòu)域、木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine protease，PLP）、高變區(qū)（hypervarible，HVR)、X 結(jié)構(gòu)域、RNA 解旋酶（RNA helicase，Hel）和RNA 依賴的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA ploymerase，RdRp）［8-10］。ORF2 編碼長度為660 個氨基酸的核衣殼蛋白，含有重要的抗原決定簇［11-12］。ORF3 與ORF2 約有300 個堿基的重疊，編碼一個長度約123 個氨基酸的小磷蛋白，參與HEV顆粒從感染細胞中的釋放，可能與病毒粒子的形態(tài)形成有關(guān)［13］。在HEV-1 和嚙齒動物攜帶的HEV 的C1～C3 中還發(fā)現(xiàn)了存在于ORF1 中的ORF4。ORF4的編碼蛋白被認為可以增強 RdRp 的活性。2021 年的一項研究表明，ORF4 可以促進HEV-3 在細胞中的復(fù)制［14-15］。

嚙齒目動物種類繁多，且與人類生活關(guān)系密切，是HEV-C1 的主要宿主。本研究對云南省大理市褐家鼠（Rattus norvegicus）攜帶的HEV 開展了篩查，在采集的樣本中檢測到HEV-C1型毒株，并完成1 株DL147 病毒全基因組序列的鑒定?；蚪M比較和系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，DL147 與香港1 例肝炎患者血清中檢測得到的HEV 高度相似，提示要加強此類病毒在褐家鼠中流行的監(jiān)測［16］。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2021 年11 月—2022 年1 月，在大理市鳳儀鎮(zhèn)、銀橋鎮(zhèn)、海東鎮(zhèn)、挖色鎮(zhèn)、大理鎮(zhèn)、上關(guān)鎮(zhèn)、喜洲鎮(zhèn)7個鎮(zhèn)采用鼠籠法和鼠夾法（夾夜法）捕獲嚙齒動物，捕獲后的樣本帶回實驗室后立即解剖，分別取心、脾、腎、肺、肝、腸各2 份，放于-80℃冰箱中待檢。物種采用形態(tài)學和分子鑒定2種方法進行鑒定［17］。

1.2 核酸的提取

將解剖后的嚙齒動物肝組織用無菌剪取約1 g放入Gene Ready 動物PIII 粉碎管（遂真,中國杭州）中，加入滅菌的700 μL 磷酸緩沖液，再置于Gene Ready U1-timate 生物樣本低溫快速制備離心系統(tǒng)（遂真，中國杭州）中進行研磨，然后取300 μL 的研磨液加入到MagaBio plus 病毒DNA/RNA 純化試劑盒III，放入全自動核酸提取儀（博日，中國杭州）中提取，按照制造商的說明書操作。

1.3 HEV核酸檢測

采用巢式RT-PCR 進行病毒核酸檢測，兩輪PCR 反應(yīng)體系均為25 μL。第1輪使用Fastking 一步法RT-PCR 試劑盒（TIANGEN，中國北京），RNA模板3 μL，反應(yīng)程序：逆轉(zhuǎn)錄42.0℃ 30 min，預(yù)變性94.0℃ 3 min，變性94.0℃ 30 s，退火52.8℃ 30 s，延伸72.0℃ 30 s，循環(huán)35 次，再延伸72.0℃ 5 min，4.0℃保存。第2輪使用Green Taq Mix（Vazyme，中國南京），第1 輪產(chǎn)物模板1 μL，反應(yīng)程序：預(yù)變性94.0℃ 3 min，變性94.0℃ 30 s，退火50.0℃ 15 s，延伸72.0℃ 15 s，循環(huán)30 次，再延伸72.0℃ 5 min，10.0℃保存。PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。將通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定出的陽性擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司進行雙向序列測定。若測序結(jié)果為重疊峰，則將PCR產(chǎn)物純化回收（OMEGA Bio-tek，美國諾克羅斯）、T-1克?。ㄈ浇穑袊本?，再送陽性克隆菌液測序。

表1 本研究所使用的引物Tab.1 Primer information

1.4 高通量測序與HEV全基因組的擴增

用檢測引物擴增獲得DL147 號樣品基因大小為340 bp。為了進一步獲得更長的片段，用引物HEVDL147-F1、HEVDL147-R1、HEVDL147-R2（表1）共擴增得到DL147HEV 的基因片段為1 034 bp，blastn 比對后發(fā)現(xiàn)有必要進行高通量測序，再將DL147 核酸樣本送至華大基因，采用MGI RS2000 測序儀進行高通量的測序，用fastqc 和Trimmomatic 軟件對下機數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，去除原始數(shù)據(jù)（raw data）中測序質(zhì)量較差和讀長較短的讀數(shù)（reads），切除reads 中的接頭序列，獲得清除數(shù)據(jù)（clean data）用于后續(xù)分析。使用DIAMOND 軟件將reads 比對至預(yù)先建好的HEV 序列數(shù)據(jù)庫，篩選得到clean data 中所含有的HEV reads，使用megahit、soapdenovo 軟件對篩選后reads 進行拼接，得到重疊群（contigs），并對所獲取contigs 進行blastn 比對，獲取最近參考序列。使用Geneious 軟件進行有參contigs 拼接，再以拼接后得到的序列為參考序列，對clean data 進行有參拼接，組裝得到contigs，所得結(jié)果即為高通量測序分析結(jié)果。利用在線工具IBS 2.0（https://ibs.renlab.org/#/server）對基因結(jié)構(gòu)示意圖進行繪制。

1.5 HEV陽性樣本基因分型和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

從NCBI 的GenBank 中下載HEV 代表株和相似性較高毒株的基因組序列，用MEGA-X 軟件進行比對，選擇最大似然法（maximum likelihood，ML）進行超1 000次的bootstrap重復(fù)，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 HEV分歧時間計算

利用IQtree 尋找最適模型，以貝葉斯進化分析軟件（BEASTv1.10.4）的BEAUti 程序設(shè)置序列的采樣時間、氨基酸置換模型分子鐘模型、馬爾科夫鏈長和先驗參數(shù)，利用BEAST 程序運算，通過馬爾可夫-蒙特卡洛算法（Markov Chain Monte Carlo，MCMC）進行樹的重復(fù)抽樣，得到具有最大后驗概率的進化樹。通過TreeAnnotator 程序設(shè)置Burnin值，以FigTree v1.4.4 軟件對進化樹進行修飾和分歧時間的標定，分析病毒序列的演化過程。

1.7 統(tǒng)計分析

使用Excel 建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P ＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 嚙齒動物的種類與感染率

共捕獲小型哺乳動物114 只，涵蓋6 個屬的7 種動物，其中居民區(qū)黃胸鼠（Rattus tanezumi）占64.79%（46/71），褐家鼠（Rattus norvegicus）占35.21%（25/71）；野外耕作地高山姬鼠（Apodemus chevrieri）占83.72%（25/43），大絨鼠（Eothenomys miletus）占6.98%（3/43）；樹鼩占4.65%（2/43），臭鼩鼱（Suncus murinus）占2.33%（1/43），針毛鼠（Niviventer fulvescens）占2.33%（1/43）。居民區(qū)以黃胸鼠和褐家鼠為優(yōu)勢種，野外耕作地以高山姬鼠為優(yōu)勢鼠。檢測到2 份HEV 陽性樣本（DL143 和DL147），宿主動物均為褐家鼠，感染率為8.00%（2/25）（表2）。

表2 云南省大理市小型哺乳動物物中HEV檢測結(jié)果Tab.2 Detection of HEV in small mammals from Dali City,Yunnan Province,China

2.2 基因組結(jié)構(gòu)與同源性比對分析

對D L 1 4 7 號樣本進行了全基因組測序（OR786722），全長6 970 bp，其中ORF1長4 823 bp，編碼1 607 個氨基酸（amino acid，aa）非結(jié)構(gòu)蛋白，其包含的Met 位于159～704 nt（54～234 aa）、Y 域位于639～1 310 nt（214～436 aa），PLP位于1 311～1 731 nt（438～577 aa），HVR 位于2 0 4 2～2 2 2 7 n t（6 8 2～7 4 2 a a），X 域 位于2 249～2 684 nt（751～894 aa），Hel 位于2 746～3 470 nt（916～1 156 aa），RdRp 位于3 485～4 921 nt（1 163～1 640 aa）；ORF2 長1 934 bp，編碼長為644 aa 的結(jié)構(gòu)蛋白；ORF3 長395 bp，與ORF2 重疊297 bp，編碼長為118 aa 的結(jié)構(gòu)蛋白；ORF4 全長551 bp，編碼長為183 aa 的非結(jié)構(gòu)蛋白。DL147號全基因組結(jié)構(gòu)模式圖見圖1。

圖1 DL147 全基因組結(jié)構(gòu)模式圖Fig.1 DL147 genome wide structural pattern map

將DL147 號樣本的全基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知的序列進行blast 比對，選出相似度最高的7條序列再進行比對，發(fā)現(xiàn)其與香港1 例HEV 患者血清分離株核苷酸同源率為95.21%（MN450853），與其他6 株從鼠類中分離核苷酸的相互之間的同源性為84.10%～93.89%（表3）。

表3 DL147全序列核苷酸同源性比對Tab.3 DL147 whole-sequence nucleotide homology alignment unit: %

2.3 系統(tǒng)進化分析

DL147 號全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，DL147 與香港HEV患者血清中分離得到的病毒（MN450853）親源性最高，形成一個分支，Bootstrap 值為100%；同時，其與中國香港其他患者、加拿大患者以及鼠類分離出來的其他HEV 型親緣關(guān)系較為集中，均為HEV-C1 型，同屬于正戊型肝炎病毒亞科，與OHEV分的其他3個屬相差較遠（圖2）。

圖2 基于DL147 全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on the whole genome of DL147

2.4 分歧時間計算

HEV ORF2 序列的貝葉斯進化樹結(jié)果顯示，DL147 與香港株的分歧時間約為2003 年，屬于較晚分化的HEV 株型。其他分支中較晚分化的株型主要是日本和馬來西亞發(fā)現(xiàn)的人的HEV 毒株，包括AB220977、AB369690、KX426575 在內(nèi)的株型約分化于2004 年。除以上三株外，本研究發(fā)現(xiàn)的DL147株型分化時間早于世界的其他HEV 毒株，說明大理市褐家鼠中感染的HEV 可能是由其他地區(qū)的毒株傳播演化而來的（圖3）。

圖3 HEV 序列的貝葉斯進化樹Fig.3 Bayesian evolutionary tree of HEV sequences

3 討論

云南省大理市地處云貴高原西部，緊鄰青藏高原，獨特的地形與氣候形成了當?shù)氐莫毺氐纳锒鄻有?。我們先前的調(diào)查在云南省的高山姬鼠（Apodemus chevrieri）和黑腹絨鼠（Eothenomys melanogaster）中發(fā)現(xiàn)存在新型HEV，并命名為HEV-C3和HEV-C4［19］。本次調(diào)查在褐家鼠（Rattus norvegicus）中檢測出HEV，鑒定的DL147號HEV陽性樣本與香港患者血清中檢測得到的HEV 高度相似，基因組序列一致性達到95.21%。從本次調(diào)查獲得的DL147的全基因組來看，其屬于家鼠種（Rocahepevirus ratti）中的HEV-C1基因型。到目前為止，HEV-C1感染人的病例約有20例被報道［16，20-22］。特別值得注意的是，褐家鼠在居民區(qū)活動，為居民區(qū)的優(yōu)勢種，與人的關(guān)系十分密切［21］。褐家鼠攜帶的HEV 在云南省大理市是否感染人有待于進一步的研究。

已有研究顯示，HEV 中能感染人的巴拉揚尼種（Paslahepevirus balayani）的8個基因型中有4個（HEV-1～HEV-4）主要感染人，其中HEV-1和HEV-2只感染人，而HEV-3 和HEV-4 為人獸共患，豬為其主要的宿主動物。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，豬的飼養(yǎng)時間逐漸縮短，一般在半年以內(nèi)屠宰，所以豬做為HEV-3、HEV-4 保存宿主而導致的感染傳播的概率可能會逐漸減少［24］。而鼠類，特別是褐家鼠等家鼠，具有分布廣泛、種類數(shù)量繁多、繁殖能力強、適應(yīng)性強等特點，與人類和其他動物的聯(lián)系又十分密切，其攜帶的HEV 值得繼續(xù)關(guān)注［23］。病毒分歧時間結(jié)果顯示，大理市褐家鼠中發(fā)現(xiàn)的HEV-C1 出現(xiàn)的時間較晚，有從其他宿主動物感染演化而來的可能。同時，世界各地褐家鼠攜帶HEV-C1 或相關(guān)的HEV 病毒均有報道［25］，所以鼠類作為HEV 的宿主動物的情況值得重視。