趙棟梁,脫 穎,康繼輝

優(yōu)質(zhì)的胸腔積液細胞蠟塊不但可以確診疾病,還可以為臨床靶向治療提供可靠的材料進行蛋白和基因檢測,目前已被廣泛應用于胸水脫落細胞學檢查[1-2]。良好的脫落細胞固定是獲得高質(zhì)量細胞蠟塊的前提,直接影響后續(xù)一系列檢測和病理診斷。常規(guī)脫落細胞固定試劑主要為乙醇甲醛混合劑或乙醇乙醚混合劑等,這些細胞固定劑中含有的醛類和乙醚等物質(zhì)均對人體有巨大傷害。為保護環(huán)境、避免病理職業(yè)性危害,本研究將三種國產(chǎn)環(huán)保固定試劑與常規(guī)細胞固定試劑處理脫落細胞得到的細胞蠟塊質(zhì)量及染色效果進行對比,探求制作細胞蠟塊最有效的綠色環(huán)保固定試劑。

1 材料與方法

1.1 材料選取2023年1月中山大學附屬第一醫(yī)院病理科細胞室接收的胸腔積液20例。三種環(huán)保固定試劑分別購自德仁科教儀器設備公司、深圳子科公司、九州柏林生物公司。德仁科教儀器設備公司環(huán)保固定試劑主要成分為:梔子花提取物;深圳子科公司環(huán)保固定試劑主要成分為:植物多糖和聚乙烯醇;九州柏林生物公司環(huán)保固定試劑主要成分為:聚乙二醇、無水甲醇。常規(guī)細胞固定試劑:10%中性福爾馬林緩沖液和95%乙醇等比例混合。免疫組化試劑均購自Leica公司。

1.2 方法將臨床送檢的胸腔積液于4 ℃靜止4 h,棄去適量上清液,剩余上清液和沉淀物震動混勻,分別取10 mL混懸液4份,分為Ⅰ組(九州柏林生物公司)、Ⅱ組(德仁科教儀器設備公司)、Ⅲ組(深圳子科公司)、Ⅳ組(常規(guī)固定組)。2 000 r/min離心10 min,重懸至上述四組固定液,每組5 mL,再次2 000 r/min離心10 min(各組固定時間等同離心時間均為10 min),棄上清,倒置離心管于濾紙上去除殘留液體,分別加入2%瓊脂,室溫下凝固并常規(guī)脫水包埋制成細胞蠟塊,進行細胞蠟塊HE染色,根據(jù)細胞形態(tài)及細胞的異型性進行免疫組化染色。染色結(jié)果由細胞室高年資病理醫(yī)師按照《中國漿膜腔積液細胞病理學檢查專家共識(2020版)》[3]進行評估和判讀,并根據(jù)是否有利于診斷,按優(yōu)秀、良好、一般三個等級依次計3分、2分、1分。

1.3 統(tǒng)計學分析利用GraphPad軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,采用One-Way ANOVA檢驗分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 富集細胞量四組胸水標本經(jīng)固定離心后,相同體積的胸水標本經(jīng)不同固定液處理,富集的細胞量Ⅰ組和Ⅲ組明顯多于Ⅱ組和Ⅳ組(圖1)。

圖1 不同固定試劑處理獲得的細胞沉渣比較:A.Ⅰ組;B.Ⅱ組;C.Ⅲ組;D.Ⅳ組

2.2 染色及判讀四組細胞蠟塊HE染色均核質(zhì)分明,染色背景干凈。其中,Ⅰ組更具組織標本的形態(tài),可見更多異型性細胞,相反Ⅱ組效果較差,富集細胞少,且胞質(zhì)染色較淡,出現(xiàn)細胞核固縮現(xiàn)象(圖2)。免疫組化染色顯示:CK7、PAX8、MC免疫組化染色結(jié)果一致,同一病例Ⅰ組和Ⅳ組的標記及染色效果好且定位清晰,但Ⅱ組部分指標出現(xiàn)淡染現(xiàn)象(圖2)。四組標本的病理判讀一致。

圖2 四組細胞蠟塊HE染色和免疫組化染色效果比較

2.3 判讀評分Ⅰ組的評分高于Ⅳ組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);Ⅱ組的評分低于Ⅳ組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);Ⅲ組的評分稍低于Ⅳ組,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖3)。

圖3 四組細胞蠟塊判讀得分比較

3 討論

惡性腫瘤細胞比正常細胞更易從原位脫落,因此對脫落細胞的檢查是一項對患者創(chuàng)傷小且經(jīng)濟方便的方法,對臨床腫瘤的診斷十分有效[4],使用各種方法取得脫落腫瘤細胞或組織顆粒便可鑒定其性質(zhì)。常規(guī)涂片法簡潔、快速,但由于細胞量較少、涂片時細胞易變形,涂片厚薄不均導致癌細胞形態(tài)不典型、背景雜質(zhì)較多,并具有不能反復切片、重復使用等缺點,給診斷帶來困擾。一個制作優(yōu)良的細胞蠟塊能最大限度地保留癌細胞,減少細胞丟失,降低漏診率并可用于后續(xù)的免疫組化染色和原位雜交檢測,能彌補細胞液基檢測和涂片的局限,幫助明確診斷、提供疾病治療方案的輔助指標及對患者的預后評估提供參考[5-7]。而制作高質(zhì)量的細胞蠟塊,固定液的選擇是關(guān)鍵,良好的固定能保持組織細胞及細胞內(nèi)物質(zhì)盡可能接近其存活時狀態(tài)。

目前科室細胞室常規(guī)使用的細胞固定液為福爾馬林-乙醇混合劑,其經(jīng)濟實惠,適用于大多病理細胞室脫落細胞的細胞蠟塊制作[8],該方法制備的細胞蠟塊HE染色鮮明,具有組織的細胞形態(tài),免疫組化標記定位明確、標記清晰,便于診斷。但是該固定液中使用的甲醛有刺激性氣味,腐蝕性強,其蒸氣對呼吸道黏膜和眼睛有強烈的刺激[9]。此外,常規(guī)固定劑應用于細胞學的富集效果不盡人意,尤其是細胞量偏少的細胞標本導致石蠟制成率進一步降低。因此,亟需尋求可富集更多細胞且健康環(huán)保的替代試劑,以解決長期以來甲醛、苯類、乙醚等危害病理工作者身體健康的難題。目前國內(nèi)也涌現(xiàn)了一批環(huán)保試劑,但效果如何還需進一步確認。本文探索了市場上較為主流的三種環(huán)保固定試劑,擬尋找制備過程更安全且優(yōu)良高效的細胞蠟塊替代固定試劑。

本研究使用的三組環(huán)保試劑不含醛、苯等有害物質(zhì),成分均無毒無害。本研究結(jié)果顯示,四個組別雖有一定差異,但均取得了不錯的制備和染色效果,其中Ⅰ組使用的環(huán)保固定試劑效果最佳,不僅HE染色和免疫組化抗原標記優(yōu)異,利于后續(xù)其他輔助檢測的開展,且能富集更多的細胞,綜合評估更利于診斷。此外,環(huán)保試劑可避免病理職業(yè)性危害,具有替代傳統(tǒng)試劑的潛力。雖然接收環(huán)保試劑需要一定過程,但使用更加綠色安全環(huán)保的替代品是大勢所趨,值得摸索適應和推廣。