程佳琪，馬宏瑞，常 健，潘明慧，李琴蓮，王 謙，侯 紅

1. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012

2. 陜西科技大學(xué)，陜西 西安 710021

3. 華北理工大學(xué)，河北 唐山 063000

4. 生態(tài)環(huán)境部土壤與農(nóng)業(yè)農(nóng)村生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)中心，北京 100012

銻(Sb)是一種有毒的類金屬元素，被廣泛用于陶瓷、玻璃、電池、油漆、煙火材料及阻燃劑生產(chǎn)[1-3]，在土壤中多以五價(jià)存在. 據(jù)調(diào)查，貴州晴隆銻礦區(qū)周圍農(nóng)田土壤Sb含量(13.65～410.91 mg/kg)遠(yuǎn)高于貴州背景值(2.24 mg/kg)，湖南某錫礦區(qū)表層土壤Sb濃度最高可達(dá)54 221.71 mg/kg[4-5]. 這些銻礦的開(kāi)采嚴(yán)重污染環(huán)境且對(duì)周圍生物有毒害作用[6]. 例如，某銻礦區(qū)男性工人肺癌死亡率在新增Sb加工作業(yè)后顯著上升[7]；五價(jià)的葡萄糖銻酰鈉會(huì)引起小鼠蛋白尿、降低紅細(xì)胞數(shù)及血糖水平、增加白細(xì)胞數(shù)及血尿素等癥狀[8]. Feng等[9]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度Sb脅迫下，水稻體內(nèi)丙二醛(malondialdehyde, MDA)及地上部株體超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(aseorbateperoxidase, APX)增加，根中過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性受到抑制.

蚯蚓是土壤中分布最廣泛的無(wú)脊椎動(dòng)物之一，占到土壤生物量的80%[10-11]. 蚯蚓吸收微量金屬不僅會(huì)對(duì)自身產(chǎn)生毒性，而且可以通過(guò)食物鏈進(jìn)行傳遞[12-13].因此蚯蚓被認(rèn)為是生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要組成部分，常通過(guò)測(cè)定其個(gè)體水平死亡率、繁殖率，細(xì)胞水平酶活性及DNA損傷等指標(biāo)進(jìn)行土壤污染的生態(tài)毒理學(xué)診斷[14-17]. 目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)Sb對(duì)蚯蚓的研究還比較缺乏，只有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，如Xu等[18]研究表明，在黏性農(nóng)業(yè)土壤中蚯蚓不能有效積累Sb；Kuperman等[19]提供了Sb對(duì)蚯蚓繁殖的毒理學(xué)數(shù)據(jù)；梁淑軒等[20]研究了Sb對(duì)蚯蚓體內(nèi)金屬硫蛋白的影響；Zhong等[21]研究了農(nóng)業(yè)土壤中銻對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng). 這些研究大多從對(duì)蚯蚓進(jìn)行短期急性毒性試驗(yàn)展開(kāi)，且與對(duì)蚯蚓進(jìn)行抗氧化酶試驗(yàn)的結(jié)果不一致，缺乏Sb長(zhǎng)期暴露對(duì)蚯蚓體內(nèi)累積及毒性評(píng)價(jià)的研究. 因此，土壤Sb對(duì)蚯蚓毒性的研究還存在許多不足，豐富Sb脅迫下生態(tài)受體的毒理數(shù)據(jù)很有必要.

本文以土壤無(wú)脊椎模式生物赤子愛(ài)勝蚓(Eisenia fetida)為受試生物，在人工模擬Sb污染土壤中進(jìn)行兩個(gè)月的長(zhǎng)期培養(yǎng)后，從個(gè)體水平和細(xì)胞水平等多個(gè)毒性終點(diǎn)探究Sb對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的影響. 同時(shí)，檢測(cè)了Sb暴露過(guò)程中蚯蚓體內(nèi)5種生物標(biāo)志物(總蛋白、CAT、SOD、POD和MDA)的變化，并使用生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(biomarker response index, BRI)來(lái)綜合評(píng)估土壤Sb脅迫下赤子愛(ài)勝蚓在細(xì)胞水平的毒性效應(yīng)，以期為我國(guó)銻污染提供關(guān)鍵毒理學(xué)數(shù)據(jù)，為以后銻礦區(qū)周圍污染土壤生態(tài)治理提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試生物

Eisenia fetida購(gòu)自北京坤龍養(yǎng)殖場(chǎng). 試驗(yàn)開(kāi)始前將其放在20 ℃室內(nèi)養(yǎng)殖兩周以上，定期加入燕麥作為食物. 試驗(yàn)過(guò)程中選用活潑、體態(tài)相似的成熟蚯蚓，質(zhì)量在300～500 mg范圍內(nèi)[22-23].

1.1.2供試土壤

供試土壤為人工土壤，由10%的泥炭土、20%的高嶺黏土、69%的工業(yè)石英砂(含50%以上0.05～0.20 mm的細(xì)小顆粒)組成，并用1%的CaCO3調(diào)節(jié)pH為7左右，用去離子水調(diào)節(jié)含水量為50%.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1污染土壤樣品制備

試驗(yàn)選用的五價(jià)銻鹽為焦銻酸鉀(KSbO6H6，分析純)，將稱好的藥品加熱溶解，使用噴壺進(jìn)行人工土壤染毒. 試驗(yàn)在2 000 mL燒杯中進(jìn)行，在燒杯中添加500 g人工土壤，5 g牛糞，使用攪拌器充分拌勻. 所有土壤在20 ℃恒溫箱(光照周期為16∶8的光暗循環(huán)，濕度為50%)中老化兩周后進(jìn)行毒性試驗(yàn). 試驗(yàn)Sb含量設(shè)置為空白(0 mg/kg)、低劑量(400、800 mg/kg)、高劑量(1 600、3 200、6 400、12 800 mg/kg)3種濃度梯度，分別以CK、S1、S2、S3、S4、S5、S6表示，每組設(shè)置3個(gè)平行. 期間通過(guò)稱量法向燒杯中添加去離子水使土壤含水量保持在50%左右.

1.2.2蚯蚓毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)參照OECD指南和ISO[24-25]，整個(gè)試驗(yàn)期間控制溫度為(20±2) ℃，光照周期為16∶8的光暗循環(huán)、光照強(qiáng)度為400～800 lx、土壤含水量為50%. 試驗(yàn)開(kāi)始前將稱量好的蚯蚓置于裝有濕濾紙的燒杯中，在20 ℃恒溫箱中進(jìn)行24 h清腸處理. 在裝有不同Sb含量土壤的燒杯中分別加入10條清腸后的赤子愛(ài)勝蚓，置于人工氣候箱中培養(yǎng)，期間不添加牛糞，其他培養(yǎng)條件同赤子愛(ài)勝蚓飼養(yǎng)條件. 試驗(yàn)分兩組進(jìn)行，其中一組用于毒性測(cè)試，每隔一天用去離子水補(bǔ)充水分并使用玻璃棒和鑷子協(xié)助計(jì)數(shù)，計(jì)算LC50；另一組用于酶活性和蚯蚓體內(nèi)Sb積累測(cè)定. 所有處理均分別在培養(yǎng)第7、14、21、28、56天取樣，每組取3個(gè)平行. 用于酶活性測(cè)定的蚯蚓取兩條制成勻漿置于4 ℃冰箱備用，用于含量測(cè)定的蚯蚓取3條進(jìn)行冷凍干燥后備用.

1.2.3蚯蚓體內(nèi)Sb含量測(cè)定

蚯蚓體內(nèi)Sb含量測(cè)定參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定》(GB 5009.268-2016). 稱取冷凍干燥后的蚯蚓干樣0.5 g于消解內(nèi)罐中，加入5 mL濃硝酸，放置1 h后在微波消解儀中170 ℃消解4 h，冷卻后將消解內(nèi)罐取出，在超聲水浴箱中超聲脫氣5 min，用超純水定容至25 mL后過(guò)0.45 μm濾膜備用. 用ICP-MS(7800型，美國(guó)安捷倫公司)測(cè)定溶液中的Sb含量.

1.2.4總蛋白、抗氧化系統(tǒng)酶、丙二醛的提取及測(cè)定

取兩條蚯蚓在0.86%生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入50 mL小燒杯內(nèi). 加入9倍體積生理鹽水，用眼科小剪剪碎組織塊后置于事先冰浴好的玻璃勻漿管中，充分研碎，使之勻漿化. 制備好的勻漿在高速冷凍離心機(jī)(TGL-16.5M，上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司)中以2 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行總蛋白、CAT、POD、SOD、MDA測(cè)定. 所有測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1LC50計(jì)算及劑量效應(yīng)關(guān)系擬合

該研究用Logisitic方程擬合實(shí)測(cè)總Sb含量對(duì)赤子愛(ài)勝蚓存活的LC50[26]：

式中：y為赤子愛(ài)勝蚓存活率；x為實(shí)測(cè)總Sb含量，mg/kg；a為對(duì)照組中赤子愛(ài)勝蚓的存活數(shù)；x0為L(zhǎng)C50；b為方程擬合過(guò)程中所產(chǎn)生的斜率參數(shù).

分別采用WPS office 2021、SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 19.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖.

1.3.2生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)

根據(jù)文獻(xiàn)使用生物標(biāo)志物變異水平(Alteration level，AL)和生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(BRI)來(lái)評(píng)價(jià)Sb對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的健康影響. AL的計(jì)算公式如下：

式中：BRt和BRc分別為污染處理組和對(duì)照組的生物標(biāo)志物響應(yīng)水平；AL為生物標(biāo)志物變異水平，根據(jù)變異水平大小進(jìn)行評(píng)分(Score, S). 當(dāng)AL＜20%時(shí)，評(píng)4分；當(dāng)20%＜AL＜50%時(shí)，評(píng)3分；當(dāng)50%＜AL＜100%時(shí)，評(píng)2分；當(dāng)AL＞100%時(shí)，評(píng)1分[27]. 然后根據(jù)生物標(biāo)志物的生物學(xué)水平對(duì)其進(jìn)行加權(quán)，SOD、CAT、POD、總蛋白為正常效應(yīng)，權(quán)重為1；MDA是一個(gè)不利的影響，權(quán)重為1.2[28]. 最后基于分?jǐn)?shù)和權(quán)重，計(jì)算BRI：

式中，Sn和Wn分別為生物標(biāo)志物n的得分和權(quán)重.此外，對(duì)BRI進(jìn)行劃分：介于3.01～4.00之間時(shí)，表示輕微健康影響；介于2.76～3.00之間時(shí)，表示中等健康影響；介于2.51～2.75之間時(shí)，表示較大健康影響；介于1.00～2.50之間時(shí)，表示嚴(yán)重健康影響[29].

2 結(jié)果與分析

2.1 不同暴露時(shí)間土壤外源Sb對(duì)蚯蚓毒性的影響

圖1為蚯蚓存活與實(shí)測(cè)總Sb的Logisitic方程擬合. 由圖1可以看出，蚯蚓存活率隨Sb濃度和暴露時(shí)間增加而降低. 根據(jù)存活率結(jié)果，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)蚯蚓存活率與暴露濃度呈現(xiàn)顯著性負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，并且在高劑量(3 200、6 400、12 800 mg/kg)處理?xiàng)l件下，存活率與暴露時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05). 另外經(jīng)計(jì)算蚯蚓56 d的LC50為4 380.37 mg/kg.

圖1 蚯蚓存活率與土壤實(shí)測(cè)總Sb的劑量-效應(yīng)關(guān)系Fig.1 Dose response curves between the survival rate of Eisenia fetida and the total concentration of Sb in soil

2.2 蚯蚓對(duì)Sb的富集

從圖2可以看出，蚯蚓體內(nèi)Sb含量隨暴露時(shí)間和暴露濃度增加而增加. 在低劑量暴露下其含Sb量較低，當(dāng)Sb含量超過(guò)3 200 mg/kg時(shí)，蚯蚓體內(nèi)Sb含量顯著升高. 處理組S6在第14、28、56天的Sb富集量分別達(dá)到94.8、177、213 mg/kg.

圖2 不同暴露時(shí)間赤子愛(ài)勝蚓對(duì)Sb的富集Fig.2 The Sb concentration of enriched within Eisenia fetida under different exposure times

表1為不同處理組蚯蚓Sb富集系數(shù)(bioaccumulation factors，BAF)，BAF為蚯蚓體內(nèi)Sb含量與土壤中Sb含量的比值，BAF大于1說(shuō)明蚯蚓對(duì)Sb有富集，BAF小于1說(shuō)明蚯蚓對(duì)Sb只是一般吸收[30]. 如表1所示，所有處理組BAF均小于1，說(shuō)明蚯蚓對(duì)Sb富集作用很小，只起到一般吸收作用. 由表1可知，蚯蚓Sb富集系數(shù)隨處理劑量升高整體顯著降低；另外，隨時(shí)間延長(zhǎng)，蚯蚓Sb富集系數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì).

表1 不同試驗(yàn)組蚯蚓銻富集系數(shù)Table 1 Sb bioconcentration factors of Eisenia fetida in different experimental groups

2.3 土壤Sb脅迫下蚯蚓體內(nèi)總蛋白含量、抗氧化酶活性和MDA含量的變化

由圖3(a)可知，隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)蚯蚓體內(nèi)總蛋白含量明顯下降. CK在暴露時(shí)間內(nèi)緩慢下降，降幅為28.6%，各處理組總蛋白含量較CK顯著降低(P＜0.05)，在暴露時(shí)間內(nèi)降幅分別為1.5%～44.4%、25.3%～59.3%、15.1%～49.7%、28.3%～64.2%，且各處理組總蛋白含量在暴露時(shí)間內(nèi)隨Sb水平增加呈劑量效應(yīng)關(guān)系.

圖3 暴露期間赤子愛(ài)勝蚓總蛋白含量、CAT活性、POD活性、SOD活性和MDA含量的變化情況Fig.3 The changes of total protein content, CAT activity, POD activity, SOD activity and MDA content in Eisenia fetida during exposure

由圖3(b)可知，CK組CAT活性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)基本不變. 各處理組CAT與CK相比，整體差異性顯著(P＜0.05)，在暴露第7天，各處理組CAT活性顯著升高，S6處理組最高升至219.5 U/mg Prot，較CK漲幅120%；在暴露第14天，除S6處理組繼續(xù)升高外，其余處理組出現(xiàn)下降趨勢(shì)；在暴露第21天，蚯蚓體內(nèi)CAT活性繼續(xù)升高，高劑量處理組S4、S5、S6達(dá)到峰值. CAT活性在隨暴露時(shí)間內(nèi)總體呈現(xiàn)“上升—下降—上升—下降”的波動(dòng)趨勢(shì).

由圖3(c)可知，CK組POD活性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì)，在暴露7～21 d各處理組POD活性與CK相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；在暴露第28天各處理組與CK相比顯著上升(P＜0.05). 除S5處理組外，各處理組在第21天POD活性達(dá)到峰值，分別為0.046、0.044、0.039、0.049、0.059 U/mg Prot，漲幅分別為39.4%、34%、17%、47%、79%. POD活性在暴露時(shí)間內(nèi)總體呈現(xiàn)先升高后降低的倒“U”型變化.

由圖3(d)可知，CK組SOD活性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)總體呈先升后降趨勢(shì). 在暴露7～21 d各處理組SOD活性隨時(shí)間不斷上升，處理組S3、S5、S6在第21天達(dá)到峰值，分別為4.14、3.88、4.5 U/mg Prot，較CK漲幅為78.4%、67.0%、94.0%；在暴露第28天，低劑量處理組SOD活性繼續(xù)上升，而高劑量處理組S5、S6出現(xiàn)下降趨勢(shì). SOD活性在暴露時(shí)間內(nèi)總體呈現(xiàn)先升高后降低的倒“U”型變化.

由圖3(e)可知，在暴露7～21 d，MDA含量隨時(shí)間延長(zhǎng)整體不斷升高，處理組S2、S3、S4、S5在第21天達(dá)到峰值，分別為1.04、1.15、1.43、1.14 nmol/mg Prot，較CK漲幅分別為7.9%、19.0%、47.3%、18.0%，并且在暴露第21天，MDA含量呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)高濃度抑制現(xiàn)象；在暴露第28天各處理組MDA活性整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì). MDA在暴露時(shí)間內(nèi)總體呈現(xiàn)先升高后降低的倒“U”型變化.

2.4 土壤Sb對(duì)蚯蚓毒性的綜合評(píng)價(jià)

表2為各處理組在4個(gè)時(shí)間的生物標(biāo)志物變異水平及得分. 總體而言，隨處理水平增加，AL呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明土壤Sb濃度越高，生物標(biāo)志物變異水平越大. 總蛋白、CAT、SOD、MDA和POD的變異水平范圍分別為1.5%～68.7%、 9.3%～271.6%、 5.6%～94.0%、1.1%～58.7%和1.0%～123.7%. 在所有生物標(biāo)志物中，CAT變異水平最大，其中處理組S4在21 d分別達(dá)到271.60%，表明在3 200 mg/kg處理水平下，蚯蚓CAT變異水平大幅升高.

表2 生物標(biāo)志物變異水平及得分Table 2 Level of variation and corresponding scores of biomarkers

圖4為蚯蚓生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)隨時(shí)間的變化情況，BRI值越低，說(shuō)明蚯蚓受傷害程度越高. 由圖4可知，在第7、21、28天各處理組BRI隨時(shí)間延長(zhǎng)整體不斷下降，第14天，BRI呈現(xiàn)“降低—升高—降低”的變化趨勢(shì). 各處理組在4個(gè)時(shí)間的BRI值分別為2.81～3.42、2.81～3.62、2.00～3.19、2.19～3.01. 處理組S5、S6在第7 天時(shí)BRI分別為2.85、2.81，表明高劑量處理組在較短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)中等健康影響. 隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)，低劑量處理組在第14天出現(xiàn)中等健康影響，BRI值為2.85. 在4個(gè)時(shí)間段內(nèi)，BRI最低值為2，說(shuō)明處理組S6在第21天受到嚴(yán)重健康影響. 在所有處理組中，僅有4個(gè)處理組蚯蚓屬于嚴(yán)重健康影響，其余處理組均在中等及以下健康影響.

圖4 赤子愛(ài)勝蚓在銻脅迫下的生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)Fig.4 The biomarker response index of Eisenia fetida under Sb stress

3 討論

該研究中，蚯蚓對(duì)Sb的累積隨時(shí)間延長(zhǎng)和處理水平增加不斷增多，但在所有處理組中，蚯蚓對(duì)Sb都是簡(jiǎn)單吸收. 這可能是由于Sb在土壤中的水溶態(tài)占比非常小[1]，而蚯蚓主要通過(guò)皮膚從土壤孔隙水吸收Sb[31]，或者蚯蚓把含Sb土壤通過(guò)進(jìn)食后又排出體外，對(duì)Sb的積累行為非常有限[32]. BAF隨處理劑量降低也說(shuō)明蚯蚓對(duì)Sb的積累能力較弱，但是在較長(zhǎng)時(shí)間暴露下蚯蚓對(duì)Sb仍有一定的積累量. 在蚯蚓接觸Sb后，其體內(nèi)抗氧化酶不斷響應(yīng)來(lái)抵抗外來(lái)侵害，直至達(dá)到抗氧化極限，蚯蚓細(xì)胞受損開(kāi)始死亡[33]. 所以隨時(shí)間延長(zhǎng)和濃度升高蚯蚓死亡率不斷上升. 蚯蚓死亡率與Sb水平呈劑量效應(yīng)關(guān)系，這與已有的研究結(jié)果[34]一致. 經(jīng)計(jì)算蚯蚓暴露56 d時(shí)的LC50為4 380.37 mg/kg. 在對(duì)其他生物的研究中，有研究顯示Sb(Ⅲ)對(duì)跳蟲(chóng)的急性死亡LC50在海倫黑土、祁陽(yáng)紅壤、北京潮土中分別為3 352、4 007、2 105 mg/kg[35]. Lin等[36]研究顯示，與Sb(Ⅲ)相比，Sb(Ⅴ)處理土壤中的跳蟲(chóng)死亡率沒(méi)有明顯變化. 通過(guò)對(duì)比可以看出，本文所研究的Sb(Ⅴ)對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的毒性效應(yīng)在個(gè)體水平較低.

蚯蚓在接觸Sb后體內(nèi)迅速產(chǎn)生活性氧(ROS)，抗氧化酶的作用是消除ROS維系膜系統(tǒng)穩(wěn)定，降低細(xì)胞受傷害程度，因此被作為生物標(biāo)志物被廣泛用于重金屬風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[37-38]. SOD作為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[39-40]，首先得到誘導(dǎo)與活性氧自由基作用，將超氧陰離子(O2-)歧化成O2和H2O2. CAT與POD的作用是將SOD的歧化產(chǎn)物和其他來(lái)源的H2O2清除，二者具有很好的協(xié)同作用[41]. MDA是機(jī)體抗氧化平衡中自由基作用于脂質(zhì)形成的氧化最終產(chǎn)物，能夠較好反映蚯蚓的氧化系統(tǒng)受損程度[42]. 該研究中CAT的變化趨勢(shì)與前人對(duì)鑭的研究結(jié)果[43]一致. 在暴露初期CAT迅速上升，Zhou等[44]研究也發(fā)現(xiàn)，在短期作用下，蚯蚓對(duì)Cd2+氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的酶主要是CAT. SOD、POD活性在暴露時(shí)間內(nèi)均呈現(xiàn)先升后降的倒“U”型變化趨勢(shì)，這是因?yàn)楸┞冻跗冢寡趸富钚圆粩嗌?，可以有效去除蚯蚓體內(nèi)活性氧.暴露后期，當(dāng)Sb含量超過(guò)蚯蚓耐受閾值時(shí)，蚯蚓細(xì)胞受到嚴(yán)重傷害，應(yīng)激能力下降. 另外，D'agostino等[45-46]研究也表明，抗氧化酶SOD、POD在清除由正常代謝或環(huán)境應(yīng)激引起的自由基方面存在一定的相互協(xié)同效應(yīng). MDA含量呈現(xiàn)倒“U”型變化趨勢(shì)，可能是因?yàn)楸┞冻跗隍球倔w內(nèi)抗氧化酶的清掃能力低于自由基產(chǎn)生速度，過(guò)剩的氧自由基引起膜的過(guò)氧化，使MDA含量不斷升高[47-48]，但隨時(shí)間延長(zhǎng)，過(guò)剩的活性氧在抗氧化酶活性最高時(shí)得到清除，使蚯蚓體內(nèi)活性氧的生成和去除達(dá)到平衡，MDA含量逐漸降低趨于平穩(wěn). 蚯蚓體內(nèi)總蛋白含量隨暴露時(shí)間和處理水平增加而不斷減少，說(shuō)明在土壤Sb的脅迫下，蚯蚓不斷消耗能量來(lái)進(jìn)行解毒和排泄過(guò)程[49]. 同時(shí)隨濃度增加和時(shí)間推移，蚯蚓機(jī)體功能受損，抑制了蛋白質(zhì)的合成[50]. 由此可以看出，在暴露期間內(nèi)，蚯蚓體內(nèi)5種生物標(biāo)志物均對(duì)Sb做出敏感響應(yīng).

生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)BRI是在為魚(yú)類制定的生物效應(yīng)評(píng)估指數(shù)(BAI)和健康評(píng)估指數(shù)(HAI)之后制定的[51]，其優(yōu)點(diǎn)是將復(fù)雜的生物改變轉(zhuǎn)化為一種實(shí)用的手段進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)管理，來(lái)減少風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的不確定性. 在對(duì)BRI的探究中，Aarab等[52]基于BRI創(chuàng)建了一個(gè)全球指數(shù)(多生物標(biāo)志物污染指數(shù))，該指數(shù)已在歐洲計(jì)劃應(yīng)用. Narbonne等[53]利用全球生物標(biāo)志物指數(shù)，對(duì)歐洲沿海地區(qū)水質(zhì)進(jìn)行了分類.近幾年一些國(guó)內(nèi)學(xué)者開(kāi)始利用BRI來(lái)評(píng)價(jià)土壤中重金屬、農(nóng)藥等污染物對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的毒性效應(yīng). 例如，Li等[27]利用BRI評(píng)價(jià)了環(huán)草隆和鎘對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)BRI與污染物暴露濃度之間存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系. 本文通過(guò)BRI來(lái)評(píng)價(jià)土壤中Sb對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的毒性發(fā)現(xiàn)，高劑量處理組在短期內(nèi)出現(xiàn)中等健康影響，低劑量處理組隨時(shí)間延長(zhǎng)也出現(xiàn)中等健康影響，但只有個(gè)別處理組屬于嚴(yán)重健康影響，表明土壤Sb對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的影響在細(xì)胞水平較低.

總而言之，本文通過(guò)探究土壤Sb脅迫下赤子愛(ài)勝蚓死亡率、Sb富集、酶活性等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)總蛋白、CAT、SOD、POD和MDA對(duì)Sb敏感，基于這5種生物標(biāo)志物的BRI能夠有效評(píng)價(jià)土壤Sb的污染程度，為土壤Sb污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供了關(guān)鍵生態(tài)毒理學(xué)數(shù)據(jù). 但蚯蚓在土壤Sb脅迫下的生物標(biāo)志物響應(yīng)僅能表征細(xì)胞水平的毒性效應(yīng)，且具體機(jī)理尚不明確，應(yīng)進(jìn)一步在分子水平上解析Sb對(duì)蚯蚓的毒性機(jī)制.

4 結(jié)論

a) 赤子愛(ài)勝蚓存活率隨處理水平和暴露時(shí)間的增加而降低，劑量效應(yīng)關(guān)系明顯；蚯蚓對(duì)Sb只是一般吸收，富集作用較小.

b) 在暴露28 d內(nèi)，SOD活性、POD活性、MDA含量總體呈現(xiàn)先升高后降低的倒“U”型變化，CAT活性總體呈現(xiàn)“上升—下降—上升—下降”的變化趨勢(shì)，總蛋白含量隨暴露時(shí)間和處理水平的增加不斷降低. 在赤子愛(ài)勝蚓體內(nèi)，5種生物標(biāo)志物均對(duì)Sb響應(yīng)敏感，可以作為Sb生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的指標(biāo).

c) 至少1 600 mg/kg的Sb劑量才能引起中等健康影響，且出現(xiàn)在暴露14 d后；在所有處理組中僅有4個(gè)處理組BRI小于2.5，屬于嚴(yán)重健康影響. 總體而言，Sb對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的毒性效應(yīng)不強(qiáng).