閆 雯，趙于飛，宮玉哲，張小珍，韓樹珍，李興杰

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 健康管理中心，甘肅 蘭州 730000

缺血性腦卒中是以局灶性神經(jīng)功能缺失為共同特征的急性腦血管疾病，占腦卒中總發(fā)病率的80%[1]。有研究報(bào)道，缺血性腦卒中發(fā)病是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，高血壓、糖尿病、冠心病、高同型半胱氨酸血癥是其明確的危險(xiǎn)因素[2-3]。但仍有許多影響因素與其發(fā)病關(guān)系尚未明確。近年來，全基因組關(guān)聯(lián)分析作為分析人類復(fù)雜疾病的一種重要手段，已識別出眾多與缺血性腦卒中或其危險(xiǎn)因素相關(guān)的候選基因[4]。缺血性腦卒中涉及的易感基因較多，其發(fā)生、發(fā)展往往由多個(gè)基因共同作用。因此，臨床對缺血性腦卒中遺傳易感性的研究難以有突破性的進(jìn)展。CDKN2B-AS1基因表達(dá)與心腦血管疾病關(guān)系密切[5]，但目前尚缺乏缺血性腦卒中分子流行病學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù)。本研究以缺血性腦卒中遺傳學(xué)背景作為切入點(diǎn)，構(gòu)建聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-高分辨熔解曲線(PCR-HRM)對缺血性腦卒中患者進(jìn)行基因分型，獲取缺血性腦卒中遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，同時(shí)探索能夠預(yù)測缺血性腦卒中發(fā)病的相關(guān)臨床檢測指標(biāo)，篩選缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素，為缺血性腦卒中的早期篩查提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取自2020年3月至2022年1月蘭州大學(xué)第二醫(yī)院收治的250例缺血性腦卒中患者納入B組，另選取同期250例健康體檢者納入A組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)B組患者符合《2014年中國急性缺血性腦卒中診治指南》[6]中缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，首次發(fā)病，且經(jīng)顱腦CT或磁共振確診；(2)年齡18～80歲；(3)所有研究對象均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心源性腦栓塞、瘤性腦卒中、煙霧病或靜脈竇血栓形成引起的腦卒中；(2)惡性腫瘤；(3)合并心、肝、腎重要臟器疾?。?4)認(rèn)知功能障礙及凝血功能障礙；(5)臨床資料缺失，未完成本研究。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 特異性引物設(shè)計(jì) 篩選易感基因。在NCBI的數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)SNP子庫內(nèi)對SNP位點(diǎn)全序列信息進(jìn)行查詢，標(biāo)注該位點(diǎn)上下游200 bp內(nèi)所有其他的突變，避開這些突變位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)使用在線軟件Primer-BLAST，引物的有效性、特異性、可辨性和具體的Tm值(℃)通過Two-state melting、Primer-BLAST、Oligo Analyzer和uMelt等在線軟件進(jìn)行評價(jià)，初步評價(jià)可用后，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。引物的特異性和有效性通過后續(xù)預(yù)實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，擴(kuò)增效果不理想時(shí)及時(shí)修正，最終獲得最佳特異性引物。

1.2.2 PCR-HRM檢測體系的建立與優(yōu)化 基因組DNA提取使用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒，嚴(yán)格按照說明書操作。提取的基因組DNA具體純度和濃度采用微量蛋白核酸檢測儀(Nano-drop 2000)進(jìn)行檢測，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。PCR擴(kuò)增和HRM檢測使用梯度PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，型號EDC-810)及高分辨的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國凱杰公司，Rotor-Gene Q)完成，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件，擴(kuò)增完成后通過瓊脂糖凝膠電泳和全自動凝膠成像儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物的特異性檢測。

1.2.3 PCR-HRM檢測體系檢驗(yàn)性能評價(jià) 通過靈敏度、特異性、重復(fù)性、再現(xiàn)性和準(zhǔn)確性對上述檢測方法進(jìn)行檢驗(yàn)性能評價(jià)。通常將突變基因型定義為陽性，野生基因型定義為陰性。隨機(jī)挑選50例標(biāo)本進(jìn)行PCR-HRM基因分型，通過Sanger測序評估其準(zhǔn)確性，并計(jì)算特異性和靈敏度。采用批內(nèi)10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)評估重復(fù)性，即選取確定的純合突變型和野生型標(biāo)本各2例，每個(gè)標(biāo)本在同1個(gè)批次內(nèi)重復(fù)10管；采用批內(nèi)10次重復(fù)實(shí)驗(yàn)評估再現(xiàn)性，即隨機(jī)挑選10個(gè)樣本，每天1次，不間斷地實(shí)施10 d檢測；計(jì)算2種基因型的Tm值平均值、變異系數(shù)(CV)和標(biāo)準(zhǔn)差。

特異性=真陰性/(假陽性+真陰性)×100%

靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%

1.3 觀察指標(biāo) 評價(jià)遺傳分子標(biāo)志物的疾病預(yù)測價(jià)值，通過多因素Logistic回歸分析篩選出缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素，分析SNP基因型突變與缺血性腦卒中的相關(guān)性。比較各基因型缺血性腦卒中指標(biāo)，包括空腹血糖、甘油三酯、糖化血紅蛋白。

2 結(jié)果

2.1 單因素分析結(jié)果 兩組性別、職業(yè)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥、腦卒中家族史、基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 單因素分析結(jié)果/例(百分率/%)

2.2 多因素Logistic回歸分析結(jié)果 以年齡、體質(zhì)量指數(shù)、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥、腦卒中家族史、基因型分布為自變量，以是否有缺血性腦卒中為因變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。高血壓、高脂血癥、腦卒中家族史及基因型分布是缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)CDKN2B-AS1基因的10個(gè)SNP位點(diǎn)(包括rs10116277、rs10738607、rs564398、rs10757269、rs496892、rs4977574、rs1537375、rs2184061、rs7044859和rs2383207)均有3個(gè)基因型(GG、GA、AA；AA為野生型，GA為雜合突變型，GG為純合突變型)。兩組上述位點(diǎn)各基因型的期望值與觀測值均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

表2 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.4CDKN2B-AS1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性 兩組CDKN2B-AS1基因rs10116277、rs10738607、rs564398、rs10757269、rs496892、rs4977574、rs1537375、rs2184061和rs2383207位點(diǎn)基因型分布比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而CDKN2B-AS1基因rs7044859位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性腦卒中具有相關(guān)性(P<0.05)，其共顯性模型(GG/AA)、顯性模型(GG/GA+AA)與隱性模型(AA/GA+GG)的粗OR(ORc)分別為2.486(95%可信區(qū)間1.368～4.453)、1.873(95%可信區(qū)間1.179～2.975)、0.525(95%可信區(qū)間0.313～0.882)。

2.5CDKN2B-AS1基因多態(tài)性rs7044859位點(diǎn)突變頻率分析 兩組 rs7044859的GG、AA基因型分布頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組rs7044859的GA基因型分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；B組等位基因G頻率為89.2%(223/250)，明顯高于A組的68.4%(171/250)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組rs7044859位點(diǎn)基因型比較/例(百分率/%)

2.6 rs7044859位點(diǎn)基因型與缺血性腦卒中的相關(guān)性 以突變基因型為自變量，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，rs7044859位點(diǎn)基因多態(tài)性與缺血性腦卒中獨(dú)立相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 rs7044859位點(diǎn)基因型與缺血性腦卒中的相關(guān)性

2.7 各基因型缺血性腦卒中指標(biāo)比較 AA型甘油三酯水平低于GG型、GA型，且GA型低于GG型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AA型糖化血紅蛋白水平高于GG型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 各基因型缺血性腦卒中指標(biāo)比較

3 討論

腦卒中是腦部血管突然破裂或腦部血管阻塞造成血液循環(huán)障礙引起的腦組織損傷，包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中[7]。其中，缺血性腦卒中發(fā)病快速且兇險(xiǎn)，預(yù)后不良，嚴(yán)重威脅患者生命健康[8]。缺血性腦卒中發(fā)病危險(xiǎn)因素分為可干預(yù)因素與不可干預(yù)因素，可干預(yù)因素包括血糖、血脂異常、高血壓、冠心病、高同型半胱氨酸血癥、不良生活習(xí)慣與飲食習(xí)慣等[9]；不可干預(yù)的因素包括年齡、性別、種族和遺傳因素[10]。對缺血性腦卒中進(jìn)行早期預(yù)防，是降低患者發(fā)病率和病死率的根本途徑。

本研究結(jié)果顯示，高血壓、高脂血癥、腦卒中家族史及基因型分布是缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。高脂血癥患者脂質(zhì)沉積于血管壁，會加速血管粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生，使血管更為狹窄，最終造成血栓形成[11-12]。長期的高血壓會損害腦血管，導(dǎo)致血管發(fā)生玻璃樣變，誘發(fā)腦梗死[13-15]。此外，腦卒中家族史提示此疾病具有顯著性基因風(fēng)險(xiǎn)。

PCR-HRM作為一種突變掃描和基因分型技術(shù)，不受突變的位點(diǎn)及類型限制，靈敏度和特異性較高，無需特異性的探針，操作簡便、快速高效、成本低廉且全程閉管操作，是疾病遺傳學(xué)研究的理想方法。CDKN2B-AS1基因表達(dá)與心腦血管疾病的發(fā)病相關(guān)。在外周血的單核巨噬細(xì)胞中，CDKN2B-AS1基因的高表達(dá)能夠加速細(xì)胞增殖，并增加其粘附力，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究篩選10個(gè)CDKN2B-AS1基因位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)rs7044859位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性腦卒中具有相關(guān)性(P<0.05)；兩組rs7044859的GG、AA基因型分布頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組等位基因G頻率明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示，CDKN2B-AS1基因位點(diǎn)rs7044859多態(tài)性和缺血性腦卒中關(guān)系密切，攜帶等位基因G的人群更易患缺血性腦卒中。此外，rs7044859多態(tài)性與血糖水平關(guān)系密切，高空腹血糖會增加缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。有研究報(bào)道，糖代謝異常是缺血性腦卒中發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[16-17]。相關(guān)研究證實(shí)，在缺血性腦卒中的診治期間，糖化血紅蛋白、甘油三酯等生化指標(biāo)可有效地預(yù)測、評估缺血性腦卒中嚴(yán)重程度和預(yù)后[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，攜帶等位基因G的患者更易出現(xiàn)血糖水平升高[19]，CDKN2B-AS1基因rs4977574位點(diǎn)和血糖代謝相關(guān)，提示等位基因G可能會影響缺血性腦卒中的發(fā)病[20]。

綜上所述，高血壓、高脂血癥、腦卒中家族史及基因型突變型分布是缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素，CDKN2B-AS1基因位點(diǎn)rs7044859基因型與缺血性腦卒中具有相關(guān)性，臨床可參考基因型分布特點(diǎn)積極預(yù)測并干預(yù)缺血性腦卒中。