王鑫宇，李 達(dá)，高廣榮，馬 銳，張 成，柳云恩

1.錦州醫(yī)科大學(xué) 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034

盡管，通過(guò)損傷控制性手術(shù)輔以合理的液體復(fù)蘇策略，可使多數(shù)失血性休克(hemorrhagic shock，HS)患者得到成功救治，但仍有部分患者因循環(huán)衰竭或多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)死亡[1-2]。既往研究報(bào)道，腸黏膜對(duì)缺血較為敏感，是缺血-再灌注損傷時(shí)最易受累的器官[3]。其中，值得關(guān)注的是，盡管在合理液體復(fù)蘇的支持下，仍有部分患者的腸上皮因無(wú)氧代謝和乳酸中毒而受損，導(dǎo)致屏障功能受損，引起大量炎性介質(zhì)過(guò)度釋放及細(xì)菌移位，最終發(fā)生MODS等嚴(yán)重并發(fā)癥。在復(fù)蘇期間采取誘導(dǎo)性低溫(inducible hypothermia，IH)可以明顯改善HS引起的有氧代謝紊亂及炎癥反應(yīng)，是改善HS患者預(yù)后、降低病死率的一種重要治療手段[4-5]。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box-1，HMGB1)已經(jīng)被證實(shí)是一種能參與炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)[6]。在應(yīng)激狀態(tài)下，HMGB1可作為細(xì)胞早期警報(bào)素，啟動(dòng)損傷相關(guān)分子機(jī)制，后期在氧化應(yīng)激等刺激條件下，HMGB1可以從胞核中通過(guò)胞漿分泌到細(xì)胞外，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重組織缺血再灌注損傷。然而，其在HS條件下是否同樣能誘發(fā)腸道炎性因子釋放，損傷腸道屏障，目前相關(guān)報(bào)道較少。因此，筆者從HS發(fā)病的分子生物學(xué)角度著手，意圖探究HMGB1是否具有調(diào)控HS鼠腸道細(xì)胞、損傷腸道屏障功能作用，為臨床發(fā)展針對(duì)性治療及研發(fā)新型藥物奠定理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 成年Wistar大鼠[體質(zhì)量180～200 g，平均體質(zhì)量(189.0±5.7)g])，由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供；低溫離心機(jī)(沈陽(yáng)醫(yī)療器械有限公司)；BL-420E多導(dǎo)聯(lián)生理記錄儀(成都金鳳有限公司)；壓力傳感器(新加坡Biosensors公司)；動(dòng)物肛溫計(jì)(北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司)；大鼠手術(shù)器械(沈陽(yáng)醫(yī)療器械有限公司)；聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra公司)；紫外線分光光度計(jì)(英國(guó)UV-visible Spectrometer公司)；血?dú)夥治鰞x(德國(guó)Bayer公司)；熒光定量PCR試劑盒(北京寶日醫(yī)生物有限公司)；HMGB1引物合成(上海生工生物工程有限公司)；HMGB1抗體(英國(guó)Abcam公司)。

1.2 大鼠HS模型的建立 Wistar大鼠32只，隨機(jī)分為常溫復(fù)蘇(N)組和低溫復(fù)蘇(H)組，每組各16只。以10%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉，進(jìn)行氣管插管輔助呼吸，分離左股動(dòng)脈及左頸總動(dòng)脈，分別用于放血及監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)，左股靜脈則用于復(fù)蘇時(shí)液體回輸。N組和H組放血速度控制在0.5 ml/min，放血量為20 ml/kg，總時(shí)間控制在10 min以內(nèi)，將MAP維持在50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)左右90 min。抽取的血液儲(chǔ)存于肝素化(7.5 U/ml)注射器中，置于4℃冰箱中保存。

1.3 HS復(fù)蘇模型的建立 N組采用加熱設(shè)備控制大鼠體溫在38℃，H組采用酒精擦浴等方式控制大鼠體溫在32℃；同時(shí)，回輸放出的血液以及3倍放血量的林格液，復(fù)蘇結(jié)束后恢復(fù)H組大鼠的體溫，檢測(cè)兩組血流動(dòng)力學(xué)變化。3 h后每組各處死8只大鼠，采集血液、腸系膜淋巴結(jié)及小腸標(biāo)本，剩余鼠用于72 h生存分析。

1.4 定量PCR檢測(cè)HMGB1 mRNA表達(dá) RNA提取：將小腸標(biāo)本搗碎，加入1 ml Trizol后震蕩60 s，加入200 μl氯仿后震蕩30 s，低溫高速離心機(jī)離心15 min。取上清液加入等量異丙醇。再次離心15 min后，用75%乙醇清洗，隨后加入40 ml RNase free water混勻，55℃金屬浴5 min。使用紫外分光光度儀檢測(cè)mRNA含量。cDNA反轉(zhuǎn)錄：采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，制備cDNA。PCR擴(kuò)增：HMGB1引物序列，forward5-TCTTCCTCTTCTGCTCTGA-3，resever5‘-ATCTTCCTCCTCTTCCTTCT-3′；GAPDH引物序列，forward5-TGGACCTGACCTGCCGTCTA-3，resever5‘-GGAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。根據(jù)CT值按照2-△△CT法計(jì)算HMGB1在N組和H組中表達(dá)的相對(duì)水平。

1.5 蛋白印跡法檢測(cè)HMBG1等蛋白表達(dá) 小腸標(biāo)本懸液(40 μl)中加入4倍體積的細(xì)胞裂解液，12 000 r/min、4℃離心20 min后，收集上清液，使用考馬斯藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。電泳分離樣本后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，以BSA封閉，以BSA封閉1 h，分別加入HMBG1、Coroin 1A、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4、神經(jīng)絲蛋白-M(Neurofilament-M)、腎連蛋白(nephronection)、IL-17、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(in sulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)、淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合家族A2(the amyloid precursor protein-binding protein A2 gene，APBA2)、IL-10、肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)、Bax、CLP、白細(xì)胞共同抗原(CD45)及GAPDH的一抗(1∶1 000)，室溫下沉淀1 h，4℃搖晃過(guò)夜；次日加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體(1∶2 000)，于室溫下靜置2 h；最后利用ECL浸膜。采用圖像分析儀對(duì)膠片進(jìn)行分析。

1.6 血清炎性細(xì)胞因子檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)大鼠血清中HMGB1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的表達(dá)情況。

1.7 小腸細(xì)菌移位檢測(cè) 將血液及腸系膜淋巴結(jié)標(biāo)本稱重，置于含有0.5 ml磷酸緩沖鹽溶液中研磨，將勻漿按照300 μl/份均勻涂抹在培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1 mRNA表達(dá) 復(fù)蘇后3 h，H組和N組小腸組織中HMGB1 mRNA表達(dá)均有所升高。H組大鼠小腸組織中HMGB1 mRNA表達(dá)水平明顯低于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。表明HS會(huì)刺激小腸細(xì)胞HMGB1表達(dá)升高，但低溫復(fù)蘇相比于常溫復(fù)蘇能有效降低HMGB1的表達(dá)，近而減輕炎癥反應(yīng)。

圖1 HMBG1 mRNA表達(dá)變化

2.2 HMGB1等炎性相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá) 復(fù)蘇后3 h，N組和H組大鼠均可見(jiàn)小腸組織中包括HMGB1及多種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)。其中，H組大鼠小腸組織中HMGB1、IL-4、Neurofilament-M、nephronection、酰基輔酶A氧化酶2(palmitoyl CoA oxidase 2，ACOX2)、IL-17、IGF-1R、APBA2、IRE1α、Bax、CLP和CD45表達(dá)明顯低于N組，而Coronin 1A和IL-10表達(dá)明顯高于N組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。表明低溫復(fù)蘇HS鼠的腸組織HMGB1等相關(guān)炎性細(xì)胞因子蛋白表達(dá)相對(duì)下調(diào)，抑炎因子表達(dá)相對(duì)上調(diào)，低溫復(fù)蘇HS鼠腸道受炎性細(xì)胞損傷較輕。

圖2 HMGB1等炎性細(xì)胞因子蛋白表達(dá)變化

2.3 復(fù)蘇大鼠血清炎性因子含量比較 復(fù)蘇后3 h，H組大鼠血清中HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8明顯低于N組，抑炎因子IL-10高于N組，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。同樣說(shuō)明低溫復(fù)蘇可以降低HMGB1等炎性相關(guān)因子的表達(dá)。

圖3 N組和H組大鼠血清炎性因子含量比較

2.4 復(fù)蘇大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌含量比較 H組大鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌移位個(gè)數(shù)為2個(gè)，平均細(xì)菌移位量為(21.34±0.91)×103CFU/ml；而N組大鼠細(xì)菌移位個(gè)數(shù)為5個(gè)，平均細(xì)菌移位量為(45.25±0.54)×103CFU/ml。兩組平均細(xì)菌移位量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明低溫復(fù)蘇可以減少HS大鼠的腸道細(xì)菌移位。

2.5 兩組大鼠生存情況比較 72 h生存分析結(jié)果顯示，N組大鼠平均生存時(shí)間為(54.6±4.8)h，低于H組的(75.79±3.62)h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

HS主要表現(xiàn)為患者全身和局部組織灌注明顯不足，即使給予積極的復(fù)蘇治療有時(shí)也難以糾正患者的休克狀態(tài)。而復(fù)蘇治療在糾正休克的同時(shí)又極易導(dǎo)致部分組織的再灌注損傷，不當(dāng)?shù)膹?fù)蘇不僅難以恢復(fù)患者的休克狀態(tài)，反而會(huì)加重其組織器官的損傷。有研究報(bào)道，頑固性低血壓和缺血-再灌注損傷可能是影響HS轉(zhuǎn)歸的直接原因[7]。在眾多難治性HS患者中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，腸黏膜對(duì)缺血最為敏感，易在缺血期間堆積大量代謝物質(zhì)，進(jìn)而誘發(fā)急性炎癥反應(yīng)，而在復(fù)蘇治療過(guò)程中，大量氧及白細(xì)胞會(huì)隨著血液流入腸黏膜，最終導(dǎo)致難以控制的全身性炎癥反應(yīng)綜合征[8]。

在筆者的前期研究中，已經(jīng)證實(shí)了IH能夠有效地提高復(fù)蘇效率，改善HS引起的炎癥反應(yīng)，調(diào)整能量代謝平衡[9-10]。實(shí)際上，在休克等應(yīng)激狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞受損會(huì)釋放警報(bào)素，啟動(dòng)炎癥相關(guān)分子模式，通過(guò)多種模式識(shí)別受體如Toll樣受體(toll-like receptors，TLR)4、糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)等，最終釋放TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子，損傷腸黏膜屏障。因而，探究缺血-再灌注損傷導(dǎo)致腸屏障功能的分子機(jī)制，能為改善HS患者預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

HMGB1能在應(yīng)激狀態(tài)下從細(xì)胞核中釋放并進(jìn)行乙?；揎棧M(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。有研究報(bào)道，在腎發(fā)生缺血-再灌注損傷時(shí)，HMGB1從腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞核中大量釋放，乙?；笞饔糜谙掠伟悬c(diǎn)TLR-2/4等受體，引起多種炎性因子釋放[11]。為了探究HMGB1對(duì)HS鼠腸屏障功能是否具有同樣的作用，筆者通過(guò)構(gòu)建N組與H組兩組模型，分別檢測(cè)兩組鼠腸上皮HMGB1及其他相關(guān)炎性因子的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H組大鼠小腸組織中HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)較N組明顯降低，相關(guān)促炎因子也同樣下調(diào)，而Coronin 1A和IL-10等抑炎因子表達(dá)明顯升高，并且H組大鼠平均細(xì)菌移位量也明顯減少，結(jié)果證實(shí)了，在IH復(fù)蘇HS時(shí)，大鼠腸上皮細(xì)胞核HMGB1表達(dá)下調(diào)，其向胞質(zhì)的分泌及乙?；^(guò)程受阻，進(jìn)而抑制TLR4、RAGE等識(shí)別受體，減少炎性因子的釋放，減輕了腸屏障損傷，抑制腸道細(xì)菌移位，改善全身炎癥反應(yīng)綜合征。本研究的結(jié)果與眾多HMGB1相關(guān)研究結(jié)果[12-14]一致，初步明析了HMGB1在IH復(fù)蘇中的相關(guān)分子機(jī)制。但I(xiàn)H時(shí)，機(jī)體具體通過(guò)何種機(jī)制導(dǎo)致HMGB1表達(dá)下調(diào)尚不可知，仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探究。

綜上所述，HMGB1表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致IH減輕大鼠HS腸屏障功能損傷的重要分子機(jī)制，為臨床中治療HS及預(yù)防缺血-再灌注損傷提供了一定的理論依據(jù)。但關(guān)于如何在臨床患者中應(yīng)用HMGB1拮抗劑來(lái)應(yīng)對(duì)缺血-再灌注損傷帶來(lái)的腸屏障功能障礙，仍需要更多的研究來(lái)證實(shí)。