王志鋒，趙 威，朱建華，侯林豪，楊哲豪，殷國輝，任炳宇，崔 巖

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 第一骨外科，遼寧 沈陽 110031

骨腫瘤、外傷、骨髓炎、骨壞死等原因均可引起不同程度的骨缺損。骨缺損主要通過骨移植術(shù)進(jìn)行修復(fù)，但自體骨移植需要進(jìn)行額外手術(shù)，增加了創(chuàng)傷與感染風(fēng)險，同時其有限的材料來源限制了其可用性。同種異體骨移植與異種骨移植雖然無需額外手術(shù)且克服了材料限制，但會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，影響移植骨的存活率及傳染疾病的潛在可能性[1-2]。聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)支架具有低成本、易加工與降解速率可控等優(yōu)勢[3]。PCL支架逐步吸收的同時，可增強(qiáng)并刺激骨骼的生長及再生，從而為新組織的形成提供空間，但其生物活性較差，限制了新生骨的長入替代[4]。褪黑素(melatonin，MT)是由松果體分泌的一種重要的吲哚類激素[5]。有研究表明，在破骨細(xì)胞中，藥物劑量的MT可以下調(diào)核因子κB受體活化因子(nuclear factor κB receptor activator ligand，RANKL)的表達(dá)，提高骨保護(hù)素含量，抑制破骨細(xì)胞的形成及活化，從而抑制骨吸收，增加年輕小鼠骨小梁骨量及骨密度[6-7]。MT刺激體外培養(yǎng)的人骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞系增殖與I型膠原合成[8-9]。本研究旨在探討PCL-MT支架治療骨缺損的修復(fù)效果?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取6只8周齡SD雄性大鼠為研究對象。SD雄性大鼠購自吉林大學(xué)實驗動物中心。動物實驗得到中國醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)與利用委員會批準(zhǔn)。

1.2 PCL支架的三維打印 利用3D打印機(jī)，通過SolidWorks 2017 軟件與Simplife 3D軟件，使用PCL進(jìn)行打印，形成具有高多孔性、高機(jī)械強(qiáng)度的PCL支架。

1.3 三維PCL支架上的MT裝載 將MT與SUNP凝膠加入10 ml磷酸緩沖鹽溶液中，使混合物完全溶解。冷卻至室溫后，得到載MT凝膠。將載MT凝膠注入三維PCL支架的空隙中[10]。將支架置于室溫下進(jìn)行液固轉(zhuǎn)化，得到負(fù)載MT的PCL支架。

1.4 動物模型構(gòu)建 制備骨損傷模型：對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)后5 d，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對照組與PCL-MT支架組，每組各3只。將大鼠常規(guī)麻醉， 固定于實驗臺上，雙側(cè)上肢備皮、鋪無菌巾。沿備皮區(qū)域縱行作一2 cm切口，在脛骨近段1/3處截除1 cm，PCL-MT支架組大鼠缺損處植入PCL-MT支架，對照組大鼠抽取骨缺損處0.1 ml自體血，形成小血凝塊，植入血凝塊，逐層縫合。術(shù)后注射抗生素預(yù)防感染。

1.5 PCL-MT支架特性研究

1.5.1 體外浸泡試驗 將PCL-MT支架放入清潔的浸泡瓶中，然后將Hank溶液加入到浸泡瓶，浸泡瓶置于37℃水浴恒溫器中。每天記錄pH值。30 d后，PCL-MT支架用吹風(fēng)機(jī)干燥。采用鉻酸溶液、蒸餾水與乙醇對PCL-MT支架進(jìn)行超聲清洗10 min。采用吹風(fēng)機(jī)烘干PCL-MT支架后再次稱重。

1.5.2 CCK-8實驗及生物相容性 處理前，將細(xì)胞置于96孔板上24 h。培養(yǎng)72 h后，每孔加入CCK-8溶液，培養(yǎng)1 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。采用細(xì)胞骨架染色法，將細(xì)胞在12孔板上貼壁24 h，然后于37℃、CO2環(huán)境下培養(yǎng)7 d。采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.5%Triton X-100滲透劑室溫下滲透5 min。通過加入4-6-二脒基-2-苯基吲哚染色細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察圖像。

1.6 體內(nèi)外成骨性能

1.6.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測定體外成骨性能 通用RNA提取試劑盒分離總RNA，并使用Primescript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨保護(hù)素(osteocalcin，OCN)、骨鈣素(osteoprotegerin，OPG)在骨缺損細(xì)胞中的表達(dá)情況。每個實驗重復(fù)3次。

1.6.2 相對鈣沉積 成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，采用40 mmol/L茜素紅溶液染色，測定細(xì)胞外基質(zhì)鈣沉積。細(xì)胞與結(jié)節(jié)形成采用相襯顯微鏡觀察。

1.6.3 顯微CT掃描 術(shù)后4周，無菌切除大鼠脛骨，并用MicroCT掃描評估，測定對照組與PCL-MT支架組骨缺損區(qū)的新骨形成情況及新生骨痂量。

1.6.4 伊紅染色 組織固定于4%多聚甲醛中。固定后，石蠟包埋前在10%乙二胺四乙酸中脫鈣21 d，然后顯微切片成一系列系統(tǒng)16 μm切片。標(biāo)準(zhǔn)伊紅染色并拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 6.02統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外浸泡試驗結(jié)果 體外浸泡試驗表明，支架的礦化厚度與腐蝕速率隨時間延長逐漸增加。體外浸泡試驗30 d后，PCL-MT支架仍具有清晰的輪廓。見圖1。

2.2 CCK-8實驗及免疫熒光結(jié)果 培養(yǎng)72 h后，兩組大鼠的CCK-8實驗檢測結(jié)果見圖2。PCL-MT支架組大鼠的相對細(xì)胞增殖率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。使用熒光顯微鏡觀察與浸出液共培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，兩組細(xì)胞均有良好的鋪展形態(tài)與顯著的肌動蛋白表達(dá)，表面修飾后細(xì)胞粘附行為不受影響。見圖3。

圖1 體外浸泡實驗結(jié)果

圖2 CCK-8實驗檢測結(jié)果

圖3 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

2.3 PCR法檢測與茜素紅染色法檢測結(jié)果 PCR法檢測結(jié)果顯示，PCL-MT支架組中的ALP、OCN、OPG mRNA表達(dá)高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。茜素紅染色法檢測結(jié)果顯示，PCL-MT 支架組中的相對鈣沉積量遠(yuǎn)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖4 PCR法檢測結(jié)果

圖5 茜素紅染色法檢測結(jié)果

2.4 顯微CT掃描 顯微CT掃描結(jié)果顯示：對照組大鼠仍可見骨缺損區(qū)，周圍有少量新生骨痂；PCL-MT支架組大鼠骨支架旁明顯大量新生骨痂充填，色白微透明，表面不平整但較完整，質(zhì)地較韌。見圖6。

圖6 顯微CT掃描結(jié)果

2.5 骨小梁半定量分析結(jié)果 對照組大鼠中骨缺損區(qū)不均勻密度的新骨形成，骨小梁散在分布且體積不一，PCL-MT支架組大鼠可見大量纖維結(jié)締組織，以及連續(xù)排列的骨小梁，活躍的成骨細(xì)胞。骨小梁半定量分析結(jié)果顯示，PCL-MT支架組大鼠骨小梁數(shù)多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

圖7 骨小梁半定量分析結(jié)果

3 討論

骨缺損發(fā)病率較高，主要通過骨移植術(shù)進(jìn)行修復(fù)。自體骨移植雖然排異反應(yīng)小，但來源有限且術(shù)后并發(fā)癥較多；異體骨移植雖然來源廣泛，但是排異反應(yīng)較大，嚴(yán)重影響移植手術(shù)的成功率。PCL為一種生物可吸收聚合物，其性質(zhì)穩(wěn)定，價格低廉，但與其他復(fù)合材料相比，其生物活性較差，導(dǎo)致新的骨組織無法與聚合物表面緊密貼合，限制了新生骨在骨缺損部位的長入及替代[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，MT具有下調(diào)RANKL抑制骨吸收的作用[13]。MT半衰期較短，阻礙了其在醫(yī)用材料中的臨床應(yīng)用[14]。水凝膠具有高含水量和多孔結(jié)構(gòu)的特點，能夠較好地模擬人體組織的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)與代謝廢物的交換[15]。

本研究體外浸泡試驗表明，支架的礦化厚度與腐蝕速率隨時間延長逐漸增加，體外浸泡試驗30 d后，PCL-MT支架仍具有清晰的輪廓。這提示，PCL-MT支架具有良好的生物活性。CCK-8實驗檢測結(jié)果顯示，PCL-MT支架組的相對細(xì)胞增殖率明顯高于對照組。這提示，PCL-MT支架的細(xì)胞活力更強(qiáng)。PCL-MT支架組大鼠的相對細(xì)胞增殖率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。使用熒光顯微鏡觀察與浸出液共培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，兩組細(xì)胞均有良好的鋪展形態(tài)與顯著的肌動蛋白表達(dá)。這提示，PCL-MT支架具有良好的生物相容性。PCR法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCL-MT支架組中的ALP、OCN、OPG mRNA表達(dá)均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明，PCL-MT支架具有更好的促進(jìn)骨形成的能力。此外，骨小梁半定量分析結(jié)果顯示，PCL-MT支架組大鼠骨小梁數(shù)多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示PCL-MT支架對骨缺損具有良好的治療作用。干細(xì)胞的成骨分化和成脂分化受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，這些轉(zhuǎn)錄因子為調(diào)節(jié)干細(xì)胞成骨分化與成脂分化的開關(guān)[16]。在脂肪分化過程中，磷酸化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子β抗體與過氧化物酶體增殖物激活受體γ均被MT抑制，MT下調(diào)終末脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志物，如瘦素、脂蛋白脂酶、脂聯(lián)素與脂肪細(xì)胞蛋白，上調(diào)成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物，如ALP、骨橋蛋白和骨鈣素[17-20]。

綜上所述，PCL-MT支架可有效促進(jìn)骨缺損區(qū)新生骨組織生成。但關(guān)于MT介導(dǎo)成骨分化的促成骨誘導(dǎo)機(jī)制有待深入研究。