王建琪, 李召寶, 吳帥楠, 郭香君, 曹素敏, 林秀雅, 褚亞輝

(河北省滄州市中心醫(yī)院口腔科, 河北 滄州 061000)

牙周炎是由牙周袋內(nèi)致病微生物引起的局部細(xì)菌感染性疾病，可造成牙齒支持組織的破壞，引起牙周附著喪失，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生牙齒的松動(dòng)和掉落。其中人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)是牙周炎治療后牙周新附著形成的主要細(xì)胞來(lái)源，是牙周組織再生的基礎(chǔ)[1,2]。研究表明，牙骨缺損愈合的速度與成骨細(xì)胞的分化能力關(guān)系密切[3]。研究成骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制對(duì)促進(jìn)牙周組織再生有重要意義。Li等[4]研究顯示，抑制miR-24-3p表達(dá)可通過(guò)靶向上調(diào)SMAD家族成員5表達(dá)促進(jìn)hPDLSCs成骨分化。骨形態(tài)發(fā)生蛋白8B(Bone morphogenetic protein8B，BMP8B)是轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的成員之一，能夠參與機(jī)體原始生殖細(xì)胞的發(fā)育、骨組織再生等重要生理過(guò)程[5]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示BMP8B可能是miR-24-3p的靶基因，但miR-24-3p是否通過(guò)調(diào)控BMP8B影響hPDLSCs成骨分化仍未有報(bào)道，因此本研究以hPDLSCs分離成骨細(xì)胞并探討二者對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響，為促進(jìn)牙周組織再生提供新的分子靶標(biāo)和一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1臨床標(biāo)本、試劑與儀器:在2020年5月至2020年10月選取本院因正畸而拔除的20顆完整、無(wú)齲壞的前磨牙，患者年齡12～18歲，無(wú)基礎(chǔ)疾病、均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批并通過(guò)。DMEM培養(yǎng)基(A90113-500mL)；CCK-8試劑盒(FY600001-1ML)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(WK304)、堿性磷酸酶(application，ALP)活性檢測(cè)試劑盒(YT6469)、BCIP/NBT ALP顯色試劑盒(YT8174)、茜素紅染色液(YT8939)，北京伊塔生物公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒、蛋白提取試劑盒，美國(guó)艾美捷(武漢)公司(EF010-E、BC3711-50T)；BMP8B-siRNA序列，廈門(mén)慧嘉生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol Reagent核酸分離試劑、AceQqPCR SYBR Green Mix、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司(RP1105-100T、YT526、ALH185、KFS303-HUV)；兔抗人BMP8B(bs-3670R)、Ⅰ型前膠原前肽(procollagenⅠCpropeptide，PICP)(mYF9825)、骨鈣素(又稱(chēng)骨γ-羧基谷氨酸蛋白，Boneγ-Carbox- yglutamicacia-Containing protein，BGP)(YB-01221)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)(ATA34601)、β-actin(FT-B3350S)一抗、山羊抗兔HRP(SE12-0.1)二抗，武漢益普生物公司。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)ThermoFisher Scientific公司(型號(hào)BBD6220)；酶標(biāo)儀、熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-rad公司(型號(hào)ELx800、C1000)；流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman公司(型號(hào)CytoFLEX)。

1.2方 法

1.2.1hPDLSCs分離、培養(yǎng)及向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化:①hPDLSCs分離及培養(yǎng):將拔除的牙齒立即放入DMEM完全培養(yǎng)液中保存。依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]通過(guò)無(wú)菌操作刮取出牙周膜組織并剪碎、以含10%青霉素的PBS液沖洗，制成hPDLSCs單細(xì)胞懸液，離心并接種至含10%滅活FBS+1%雙抗的DMEM中，在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度保持在37℃。②HDPSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化:取生長(zhǎng)良好的第3代HDPSCs接種至6孔板(5×104/孔)，更換為成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10%FBS+50mg/L α-左旋抗壞血酸+10mmoL/L β甘油磷酸二鈉+0.1μmoL/L地塞米松+100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基)，換液/2d，繼續(xù)培養(yǎng)15d，采用堿性磷酸酶(application，ALP)染色及細(xì)胞礦化實(shí)驗(yàn)鑒定為成骨細(xì)胞[4]。收集成骨細(xì)胞消化并接種至24孔板(2.5×105個(gè)/孔)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2成骨細(xì)胞鑒定:取第4代成骨細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。①ALP染色 取培養(yǎng)15d后的成骨細(xì)胞，消化并接種于室玻片上，根據(jù)BCIP/NBT ALP顯色試劑盒進(jìn)行染色，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，倒置顯微鏡下觀察并拍照。②茜素紅染色 取培養(yǎng)15d后的成骨細(xì)胞，加入300μL 0.4%的茜素紅S染液進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染:重懸1.2.1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞，并將其接種于24孔板(2.5×105個(gè)/孔)。然后，將成骨細(xì)胞隨機(jī)分為4組(每組均6個(gè)復(fù)孔)，即空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)成骨細(xì)胞不做特殊處理)；inhibitor-NC組(50 pmoL/μL inhibitor-NC)；miR-24-3p-inhibitor組(50 pmoL/μL miR-24-3p-inhibitor)；miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組(50 pmoL/μL miR-24-3p-inhibitor及5μL BMP8B-siRNA)，以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)染均嚴(yán)格參照Lipofectamine TM3000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，Lipofectamine TM3000的劑量為5μL。用含10%滅活FBS+DMEM完全培液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h。收集各組成骨細(xì)胞備用。

1.2.4實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng):TRIzol法從1.2.3各組培養(yǎng)48h的成骨細(xì)胞中提取其總RNA，并測(cè)定濃度。按照PrimeScript RT reagent試劑盒的說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系(20μL)包括：10μL ULtraSYBR mixture、2.0μL cDNA、2.0μL上游引物、2.0μL下游引物、4.0μL ddH2O。反應(yīng)條件為：93℃預(yù)變性30s、93℃變性5s、65℃退火30s、延伸30s，循環(huán)40次。引物序列(泓迅生物，蘇州)詳見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組成骨細(xì)胞中miR-24-3p、BMP8B mRNA水平相對(duì)表達(dá)量。

表1 miR-24-3p BMP8B及內(nèi)參引物序列

1.2.5CCK-8法:收集1.2.3培養(yǎng)48h的各組成骨細(xì)胞，調(diào)整密度至每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞，接種在24孔細(xì)胞板上，24h后，加入CCK-8試劑，再培養(yǎng)2h，在490 nm處檢測(cè)各孔細(xì)胞光密度(optic density，OD)值，并以此為基礎(chǔ)計(jì)算增殖抑制率(%)，其計(jì)算公式為增殖抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù):取1.2.3各組培養(yǎng)48h的成骨細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/mL)。100μL細(xì)胞懸液中加入AnnexinV/PITC 5μL，20μg/mL的PI10μL，充分混勻，避光孵育30min(室溫)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡率。

1.2.7ALP活性檢測(cè):取1.2.3各組培養(yǎng)48h的成骨細(xì)胞，采用ALP活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)成骨細(xì)胞ALP活性，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各樣品520nm吸光度(Optical density，OD)值，在ALP標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活性值。

1.2.8免疫印跡法:收集1.2.3培養(yǎng)48h的各組成骨細(xì)胞，提取總蛋白后進(jìn)行濃度檢測(cè)，然后用等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(10%)，轉(zhuǎn)膜、封閉后，添加BMP8B一抗及PICP、BGP、OPN一抗(均1∶1000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，然后加入山羊抗兔二抗(HRP標(biāo)記，1∶5000稀釋)孵育1h?；瘜W(xué)顯色后進(jìn)行成像。分析各孔蛋白條帶灰度值。

1.2.9雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):TargetScan預(yù)測(cè)miR-24-3p與BMP8B的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建BMP8B野生型質(zhì)粒(BMP8B-WT)和突變型質(zhì)粒(BMP8B-MT)。使用Lipofectamine TM3000將上述質(zhì)粒分別與miR-24-3p-inhibitor-NC、miR-24-3p-inhibitor共轉(zhuǎn)染于成骨細(xì)胞，48h后，以自動(dòng)熒光素酶檢測(cè)儀測(cè)定海腎熒光素、螢火蟲(chóng)熒光素的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1成骨細(xì)胞的鑒定:細(xì)胞呈現(xiàn)粘附生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)多種不規(guī)則形態(tài)，包括梭形、三角形或多角形等，突起較多，胞核位于細(xì)胞一側(cè)呈卵圓形，符合成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(圖1a)。ALP染色結(jié)果顯示，細(xì)胞核呈藍(lán)色陽(yáng)性反應(yīng)，胞質(zhì)及周?chē)凶厣w粒(圖1b)。茜素紅染色結(jié)果顯示，細(xì)胞有較多深紅色鈣化結(jié)節(jié)形成(圖1c)。以上結(jié)果表明誘導(dǎo)分化的細(xì)胞為成骨細(xì)胞。

圖1 成骨細(xì)胞鑒定

2.2各組成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果比較:miR-24-3p-inhibitor組和inhibitor-NC組成骨細(xì)胞均可見(jiàn)較強(qiáng)綠色熒光。與空白對(duì)照組、inhibitor-NC組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細(xì)胞miR-24-3p水平顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2及表2。

圖2 轉(zhuǎn)染效果比較

表2 各組成骨細(xì)胞miR-24-3p水平比較

2.3各組成骨細(xì)胞增殖情況比較:與空白對(duì)照組、inhibitor-NC組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細(xì)胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組成骨細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組成骨細(xì)胞增殖情況比較

2.4各組成骨細(xì)胞凋亡情況比較:與空白對(duì)照組、inhibitor-NC組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組成骨細(xì)胞凋亡率顯著升高(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3及表4。

圖3 各組成骨細(xì)胞凋亡情況比較

表4 各組成骨細(xì)胞凋亡情況比較

2.5各組成骨細(xì)胞ALP活性比較:與空白對(duì)照組、inhibitor-NC組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細(xì)胞ALP活性顯著升高(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組成骨細(xì)胞ALP活性顯著降低(P>0.05)。詳見(jiàn)表5。

表5 各組成骨細(xì)胞ALP活性比較

2.6各組成骨細(xì)胞中功能活性相關(guān)蛋白表達(dá)比較:與inhibitor-NC組、空白對(duì)照組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細(xì)胞功能活性相關(guān)蛋白PICP、BGP、OPN顯著升高(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組成骨細(xì)胞功能活性相關(guān)蛋白PICP、BGP、OPN顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4及表6。

圖4 各組成骨細(xì)胞功能活性相關(guān)蛋白表達(dá)比較

表6 各組成骨細(xì)胞功能活性相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.7miR-24-3p靶向調(diào)控BMP8B:Targetscan(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)顯示，miR-24-3p與BMP8B存在核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，詳見(jiàn)圖5。成骨細(xì)胞中，miR-24-3p-inhibitor顯著升高了BMP8B-WT的熒光素酶活性(1.37±0.21)(P<0.05)，而不影響B(tài)MP8B-MUT的熒光素酶活性，詳見(jiàn)圖6。與空白對(duì)照組、miR-24-3p-inhibitor-NC組相比，miR-24-3p-inhibitor組BMP8B mRNA、蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組BMP8B mRNA及其蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖7及表7。

圖5 靶向關(guān)系

圖6 熒光素酶活性測(cè)定

圖7 各組成骨細(xì)胞BMP8B蛋白表達(dá)

表7 各組成骨細(xì)胞BMP8B mRNA及其蛋白表達(dá)情況

3 討 論

近年來(lái)miRNAs對(duì)成骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的相關(guān)研究層出不窮[6,7]。miR-24-3p屬于miRNAs家族重要一員，Wu等[8]研究顯示，下調(diào)miR-24-3p表達(dá)能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞成骨分化。然而miR-24-3p對(duì)牙周炎和骨分化調(diào)控作用機(jī)制尚不明確?；诖吮狙芯恳詇PDLSCs為研究對(duì)象并誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞，分析miR-24-3p對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探究可能的分子機(jī)制，為臨床治療牙周病提供新的靶點(diǎn)和思路。本研究對(duì)hPDLSCs成骨誘導(dǎo)后顯示，細(xì)胞呈成骨細(xì)胞形態(tài)，且多數(shù)細(xì)胞ALP呈陽(yáng)性(藍(lán)色)染色、有紅色礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生，說(shuō)明成骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功。成骨細(xì)胞增殖分化及凋亡狀態(tài)異常是影響骨重塑的重要因素[8]。ALP是早期成骨標(biāo)志因子，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟、鈣化，其活性是反映成骨細(xì)胞分化程度及功能狀態(tài)的良好指標(biāo)[9]。PICP是成熟骨細(xì)胞合成并分泌的膠原基質(zhì)蛋白，是骨基質(zhì)的主要有機(jī)成分；BGP是一種特異性非膠原基質(zhì)蛋白，也是成骨細(xì)胞分化成熟的一種特異性標(biāo)志物；而成骨細(xì)胞分化成熟的晚期標(biāo)志物OPN能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化[10,11]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-24-3p表達(dá)后成骨細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率降低，ALP活性及PICP、BGP、OPN蛋白表達(dá)升高，與Wu等[8]研究結(jié)果一致，說(shuō)明抑制miR-24-3p表達(dá)可能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化并抑制細(xì)胞凋亡。

BMP8B是一種多功能的生長(zhǎng)因子，屬于TGF-β超家族成員，能夠調(diào)控骨形成[12]。既往研究顯示，過(guò)表達(dá)BMP8B能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[13]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-24-3p表達(dá)后成骨細(xì)胞BMP8B mRNA及其蛋白表達(dá)水平升高，提示抑制miR-24-3p表達(dá)可能上調(diào)BMP8B表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化并抑制凋亡。當(dāng)在抑制miR-24-3p的基礎(chǔ)上沉默BMP8B表達(dá)后，成骨細(xì)胞增殖分化能力被抑制，凋亡能力被提高。更加說(shuō)明抑制miR-24-3p表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化及抑制凋亡，可能是通過(guò)上調(diào)BMP8B表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。Chen等[14]過(guò)表達(dá)miR-24能夠靶向下調(diào)TGF-β1表達(dá)抑制心肌纖維化進(jìn)展。本研究經(jīng)targetscan預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-24-3p與BMP8B的靶向關(guān)系。以上結(jié)果說(shuō)明抑制miR-24-3p表達(dá)可能通過(guò)靶向上調(diào)BMP8B表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化并抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，下調(diào)miR-24-3p表達(dá)能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化并抑制細(xì)胞凋亡，可能是通過(guò)靶向上調(diào)BMP8B表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，可為治療牙周病提供新的思路。然而牙周病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有關(guān)miR-24-3p靶向調(diào)控BMP8B參與成骨細(xì)胞生物學(xué)行為是否與其他通路有關(guān)，有待進(jìn)一步深入闡述。