岳斯琦，魏麗萍，何成彥

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

結(jié)直腸癌作為癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，也是全球第三大最常診斷的惡性腫瘤。在東歐和亞洲地區(qū)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率上升迅速，預(yù)計到2030年，全球結(jié)直腸癌患者將新增220萬確診病例以及110萬的死亡病例[1]。在最近的研究報告中指出進行結(jié)直腸癌早期癌癥篩查診斷能顯著降低結(jié)直腸癌死亡率[2]，本實驗初步通過二維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及免疫印跡實驗來分析RPS14蛋白在結(jié)直腸癌組織與癌旁組織的差異，為結(jié)直腸癌的篩查和診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院組織標本庫中2018年到2020年術(shù)前未經(jīng)治療的結(jié)直腸癌患者組織，所有標本均經(jīng)病理學診斷為腺癌，共計16例。在患者術(shù)中留取結(jié)直腸癌組織和距離癌組織邊緣7 cm處的癌旁組織，完成采集迅速冷卻后用PBS徹底沖洗，液氮速凍，儲存在溫度為-80℃的冰箱中待用。研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，LTQXL 離子阱質(zhì)譜儀(美國賽默飛公司)，電泳儀(柏奧易杰北京科技有限公司)，RPS14單抗(美國Affinity公司)，β-actin多抗(美國abcam公司)。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(美國伯樂公司)，碘代乙酰胺，DNA酶，RNA酶，TPCK修飾的測序級胰酶(美國西格瑪公司)。

1.3 方法

1.3.1蛋白提取及樣品制備 取出儲存于-80℃冰箱的樣本將其在液氮條件下研磨至粉末狀，在粉末中加入適量的蛋白裂解液并充分振蕩混勻30 min。后續(xù)在樣本中加入DNA酶和RNA酶來去除樣本殘留的物質(zhì)，在4℃條件下1 200 rpm離心10 min。用BCA法測定蛋白的濃度后，用酶標儀測定樣品OD562值繪制蛋白質(zhì)濃度標準曲線，在加入一定比例的上樣緩沖劑后，煮沸冷卻至室溫，在冰箱(-80℃)中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2二維質(zhì)譜色譜聯(lián)用技術(shù)鑒定蛋白多肽 0.1%的FA與配制好的蛋白樣品相溶解，經(jīng)陽離子交換柱和反向柱洗脫分離蛋白樣品后經(jīng)LTQXL離子阱質(zhì)譜儀分析檢測，在通過全掃描和二級掃描后獲取質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.3.3免疫印跡試驗 SDS-PAGE電泳，按照說明書配置好10%APS水溶液放入4℃冰箱中保存，加入分離膠A和分離膠B后迅速加入APS及TEMED，混勻后注入到玻璃板內(nèi)，插板后等待1 h左右，注意避免產(chǎn)生氣泡。通過組織濃度和固定上樣質(zhì)量(60 μg)計算出每孔需要的上樣體積，將配置好的電泳液倒入電泳槽內(nèi)沒過凝膠，保持膠體濕潤，在每孔依次加入定量的Marker和Loading buffer，在80V條件下通電1.5 h。用稀釋好的快速轉(zhuǎn)膜液在400 mA的條件下轉(zhuǎn)膜20 min，加入快速封閉液，孵育一抗過夜(4℃)，用PBS-T清洗NC膜3次后加入二抗低溫孵育1 h，PBS-T再次洗膜5次后用ECL熒光化學法發(fā)光顯色，將顯影液與定影液按照1∶9的比例配好，各自浸沒5 min。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果

本實驗癌組織及癌旁組織中同一蛋白的豐度通過圖譜數(shù)來衡量，差異蛋白的滿足條件為兩個樣品中蛋白圖譜數(shù)比值 ≥1且蛋白圖譜數(shù)差值 ≥72。在此標準下共檢測到ARGAL、CUL48、B3KXD6、E5RH53、CDK5、B4E0Y9、RPS14和60 kD線粒體熱休克蛋白共8個上調(diào)蛋白，ACTS、DESM、ACTN1、A1AT、TLN1、KCRB、CNN1、MYH14、紐蛋白亞型2、熱休克蛋白β1共10個下調(diào)蛋白。RPS14作為其中一個上調(diào)蛋白，質(zhì)譜圖結(jié)果見圖1。

2.2 免疫印跡試驗結(jié)果

運用WB方法，分析16對組織的RPS14表達量檢測發(fā)現(xiàn)RPS14在結(jié)直腸癌組織中高表達，如圖2所示。

圖1 RPS14 質(zhì)譜圖結(jié)果

圖2 RPS14 免疫印跡結(jié)果

3 討論

結(jié)直腸癌作為世界范圍內(nèi)最常見和致死率較高的癌癥之一，在2021年的流行病學報告中顯示，全世界范圍內(nèi)早發(fā)性結(jié)直腸癌患者的發(fā)病率和死亡率不斷增加，防范重心傾向于在50歲以下的人群中積極展開CRC的篩查和隨訪[3]。結(jié)直腸鏡檢是CRC篩查的金標準，但鏡檢存在檢測費昂貴、技術(shù)要求高、并發(fā)癥多、適用性差等局限性。近年來先進的分子技術(shù)在結(jié)直腸癌檢測和治療方面發(fā)展迅速，尤其是血液中的生物標志物如蛋白質(zhì)、腫瘤DNA、腫瘤細胞和血液中的RNA等都常用于結(jié)直腸癌的診斷，其靈敏度和特異度都高于FOBT和FIT，逐漸成為癌癥檢測的新風向[4]。

RPS14被稱為核糖體蛋白小亞基14，又名S14、uS11，是核糖體蛋白家族的重要成員，該家族在原核和真核細胞中普遍表達。在結(jié)構(gòu)上，RPS14由五個外顯子和四個內(nèi)含子組成多個功能不同的多態(tài)結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域B和D是RPS14生物活性所必需的部分[5-6]。在功能上，RPS14過表達將誘發(fā)細胞周期停滯和衰老[7]并調(diào)節(jié)P53通路的激活而影響腫瘤細胞的增殖[8]。此外，RPS14與肺鱗狀細胞癌[9]、膀胱癌[10]、肝細胞癌[11]及其亞型酒精性肝細胞癌[12]的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，RPS14于2017年在乳腺癌的生信分析中首次被篩選出來[13]，低表達RPS14細胞株抑制了乳腺癌的增殖、遷移并顯著誘導細胞凋亡[14]。RPS14于2022年也通過生信分析手段推測其可能是通過調(diào)節(jié)核糖體途徑而影響結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因[15]。近年來，隨著LC-MS技術(shù)的發(fā)展，其在蛋白質(zhì)的定性和定量方面都有廣泛的研究，又因LC-MS具有選擇性高、靈活性大和穩(wěn)定性強的特點，常常被認為是替代傳統(tǒng)方法分析蛋白質(zhì)的最佳選擇[16]。因此本研究選擇通過二維質(zhì)譜色譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織上高表達的RPS14基因并通過免疫印跡實驗的方法對處于Ducks’B期的結(jié)直腸癌及癌旁組織進行了分析和驗證，實驗結(jié)果證明RPS14在結(jié)直腸癌組織中高表達，并與癌旁組織有顯著差異。因此推測RPS14高表達與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定聯(lián)系，如果在未來能對RPS14進行更多的細胞功能實驗和機制的研究，RPS14將在結(jié)直腸癌診斷方面有更顯著的貢獻。