崔 倪,王延楠,單悅展,周遠(yuǎn)航，倪勁松,馮 野*，房學(xué)東*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胃腸外科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 病理科，吉林 長春130031)

BCCIP(BRCA2 And CDKN1A Interacting Protein)是一種進(jìn)化保守蛋白，參與維持基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞周期進(jìn)程，以具有不同C末端結(jié)構(gòu)域的BCCIPβ及BCCIPα兩種類型存在于人類中。BCCIP基因表達(dá)是腫瘤抑制中重要的BRCA2輔助因子，其作為腫瘤抑制因子在多種腫瘤中起作用。已有研究證實(shí)，BCCIP基因在卵巢癌、腎細(xì)胞癌及結(jié)直腸癌等組織中表達(dá)降低，研究也表明，BCCIP的低表達(dá)狀態(tài)成為肝細(xì)胞癌患者生存率低的獨(dú)立預(yù)后因素[1-2]。然而其他研究發(fā)現(xiàn)，BCCIPβ在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，并與腫瘤分級(jí)，腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲顯著相關(guān)，可能作為一種致癌基因促進(jìn)了食管癌的進(jìn)展，導(dǎo)致其不良預(yù)后[3]。 目前BCCIP基因在腫瘤中表達(dá)的研究結(jié)果不盡相同，且有關(guān)BCCIP在胃癌中表達(dá)的研究甚少。我們的研究旨在分析BCCIP在胃癌中的表達(dá)及其與臨床相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)性，進(jìn)而探討B(tài)CCIP表達(dá)對(duì)胃癌預(yù)后的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

本研究隨機(jī)選取2017年1月至2018年10月間吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部病理科原發(fā)性胃腺癌110例石蠟標(biāo)本，并選取同一個(gè)患者癌旁正常胃粘膜組織作對(duì)照。其中男性患者87例，女性患者23例，患者平均年齡61.71歲，所選病例患者術(shù)前均無放化療，標(biāo)本切片經(jīng)2名病理醫(yī)生復(fù)閱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化染色(IHC)采用S-P免疫組織化學(xué)染色方法，使用全自動(dòng)免疫組化儀(Thermo Fisher)進(jìn)行染色，分析110例胃癌組織和正常胃粘膜組織中BCCIP、Ki67和突變型P53的表達(dá)：

將所選病例石蠟標(biāo)本切成2 μm切片，置于烘干箱70度烤片1 h；二甲苯溶液中浸泡20 min脫蠟到乙醇浸泡15 min，用純水沖洗酒精；將切片放入含EDTA緩沖液的高壓鍋中加熱修復(fù)2.5 min，用涼水冷卻后轉(zhuǎn)移到PBS緩沖液中浸泡20 min；滴加80 μl過氧化氫液封閉10 min；滴加一抗試劑孵育1 h，PBS緩沖液清洗；滴加二抗試劑，孵育30 min；用DAB顯色液顯色5 min；蘇木素中染色復(fù)染2.5 min，后經(jīng)分化、反藍(lán)、脫水和透明及封片；將染色組織切片放于光學(xué)顯微鏡(Olympus)下觀察、記錄、采集圖像。

1.3 結(jié)果判定

BCCIP表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，以棕黃色顆粒沉著判為陽性。評(píng)分采用雙評(píng)半定量法：A:陽性細(xì)胞百分率<10%：0分，11-25%：1分，26-50%：3分，>50%：4分；B：依據(jù)組織染色程度進(jìn)行評(píng)分：不著色：0分，淺黃色：1分，棕黃色：3分。再計(jì)算著色范圍與染色程度的和，兩項(xiàng)相加后，所得分?jǐn)?shù)<3，判為陰性(-)；2-3，判為弱陽性(+)；4-5，判為中等陽性(++)；≥6，判為強(qiáng)陽性(+++)。

P53和Ki-67的判讀方法：每張組織片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的百分率，陽性細(xì)胞≤10%，判為陰性；陽性細(xì)胞>10%，判為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS軟件分析系統(tǒng)，采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)分析BCCIP在胃癌組織及正常胃粘膜組織中的表達(dá)差異；秩和檢驗(yàn)分析胃癌中BCCIP的表達(dá)與各項(xiàng)臨床指標(biāo)(腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期)之間的關(guān)系；Spearman相關(guān)分析法分析胃癌中BCCIP的表達(dá)與各項(xiàng)臨床指標(biāo)(患者性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期)及Ki67和P53的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 BCCIP在胃癌組織中的表達(dá)

BCCIP在正常胃粘膜組織及胃癌組織中的表達(dá)主要表達(dá)于細(xì)胞核(圖1)。在110例胃癌組織中有104例BCCIP陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為94.55%，其中26例強(qiáng)陽性表達(dá)，38例中等陽性表達(dá)，40例弱陽性表達(dá)，6例陰性表達(dá)；110例正常胃粘膜組織中BCCIP的陽性表達(dá)率為100%，BCCIP強(qiáng)陽性表達(dá)69例，中等陽性表達(dá)33例，弱陽性表達(dá)8例，陰性表達(dá)0例。110例標(biāo)本中有68例(61.82%)BCCIP在胃癌中的表達(dá)強(qiáng)度低于其相配對(duì)的正常胃組織，且BCCIP在胃癌和正常組織中表達(dá)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表1)。

圖1 BCCIP在胃癌和正常胃粘膜組織中的表達(dá)(200×)

表1 胃癌組織及正常胃粘膜組織中BCCIP的表達(dá)

2.2 BCCIP與腫瘤分化程度的關(guān)系

免疫組化結(jié)果顯示，BCCIP在不同分化程度胃癌中的表達(dá)程度的差異顯著，(P<0.01見圖2，表2)。16例高分化胃癌中，10例BCCIP強(qiáng)性陽性表達(dá)，4例中等陽性表達(dá)，2例弱陽性表達(dá)，0例陰性表達(dá)；56例中分化胃癌中，10例BCCIP強(qiáng)陽性表達(dá)，21例中等陽性表達(dá)，24例弱陽性表達(dá)，1例陰性表達(dá)；38例低分化胃癌中，6例BCCIP強(qiáng)陽性表達(dá)，13例中等陽性表達(dá)，14例弱陽性表達(dá)，5例陰性表達(dá)。

圖2 BCCIP在胃癌組織中的表達(dá)(200×)

表2 BCCIP的表達(dá)與胃癌分化程度的關(guān)系

2.3 BCCIP與腫瘤分期的關(guān)系

10例T1分期中7例BCCIP強(qiáng)陽性表達(dá)，1例中等陽性表達(dá)，2例弱陽性表達(dá)，0例陰性表達(dá)；15例T2分期中2例BCCIP強(qiáng)陽性表達(dá)，10例中等陽性表達(dá)，3例弱陽性表達(dá)，0例陰性表達(dá)；76例T3分期中14例BCCIP強(qiáng)陽性表達(dá)，25例中等陽性表達(dá)，33例弱陽性表達(dá)，4例陰性表達(dá)；9例T4分期中3例BCCIP強(qiáng)陽性表達(dá)，2例中等陽性表達(dá)，2例弱陽性表達(dá)，2例陰性表達(dá)。胃癌中BCCIP的表達(dá)在不同腫瘤分期中表達(dá)差異顯著(P<0.05，見表3)。

2.4 BCCIP與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

78例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移標(biāo)本中12例強(qiáng)陽性表達(dá)，26例中等陽性表達(dá)，34例弱陽性表達(dá)，6例陰性表達(dá)；32例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移標(biāo)本中，14例強(qiáng)陽性表達(dá)，12例中等陽性表達(dá)，6例弱陽性表達(dá)，0例陰性表達(dá)。胃癌中BCCIP在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)差異顯著(P<0.01，見表4)。

表3 BCCIP的表達(dá)與胃癌腫瘤分期的關(guān)系

表4 胃癌中BCCIP的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.5 P53、Ki67在胃癌組織中的表達(dá)

P53和Ki67在胃癌組織中陽性表達(dá)于細(xì)胞核(見圖3)。P53在110例胃癌標(biāo)本中有55例陽性表達(dá)，55例陰性表達(dá)，陽性率50%；P53在110例正常胃粘膜組織中有1例陽性表達(dá)，99例陰性表達(dá)，陽性率0.91%，P53在正常組的表達(dá)高于胃癌組，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示P53在胃癌組與正常組表達(dá)的差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表5)。P53在胃癌中的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分期無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(r=0.413，P<0.01)；與分化程度負(fù)相關(guān)(r=-0.290，P<0.01，見表6)。Ki67在110例胃癌中有106例陽性表達(dá)，4例陰性表達(dá)，陽性率96.36%；在110例正常胃粘膜組織中有45例陽性表達(dá)，65例陰性表達(dá)，陽性率40.9%。與正常胃粘膜組織相比，Ki67在胃癌中表達(dá)明顯升高(P<0.01，見表5)；110例胃癌中Ki67的表達(dá)與患者年齡、性別及腫瘤分期無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(r=0.372，P<0.01)；與分化程度負(fù)相關(guān)(-0.224，P<0.05，見表6)。

圖3 Ki-67、P53在胃癌組織中的表達(dá)(200×)

表5 胃癌及正常組織中P53及Ki67的表達(dá)

2.6 BCCIP與P53、Ki67及臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

采用Spearman相關(guān)分析顯示胃癌中BCCIP的表達(dá)與胃癌患者性別、年齡無關(guān)；與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67、P53的表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.226，-0.355，-0.198，-0.311，P<0.05)；與腫瘤分化程度正相關(guān)(r=0.292，P<0.01；見表6)。

表6 胃癌組織中BCCIP與P53、Ki-67及臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡率的主要原因，預(yù)后不良，晚期胃癌的中位總生存期≤12個(gè)月。導(dǎo)致胃癌發(fā)展的因素包括環(huán)境、遺傳及其他誘發(fā)因素，并且幽門螺桿菌的感染是主要因素之一。開展對(duì)于正常細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究有助于開發(fā)靶向治療的新型藥物。遺傳學(xué)研究揭示相關(guān)基因的表達(dá)改變可能在促進(jìn)胃癌發(fā)生的易感性方面發(fā)揮了重要作用[4]。哺乳動(dòng)物的BCCIP基因最初被鑒定為BRCA2相互作用蛋白，BCCIP在DNA修復(fù)，DNA復(fù)制應(yīng)激抑制，細(xì)胞周期調(diào)控，有絲分裂和核糖體生物發(fā)生中具有關(guān)鍵作用[5]。多項(xiàng)研究報(bào)道BCCIP是腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌、卵巢癌、乳腺癌等，其表達(dá)減低與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)。然而也有研究報(bào)道稱BCCIP在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)增加，可能是患者預(yù)后不良的標(biāo)志物。有關(guān)BCCIP在胃癌中的表達(dá)情況的研究尚未見報(bào)道。為了探索BCCIP與胃癌的關(guān)系，我們通過免疫組織化學(xué)染色方法，分析了BCCIP在胃癌中表達(dá)的情況。結(jié)果顯示BCCIP在胃癌中的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于與之同源的正常胃粘膜組織，兩組間BCCIP表達(dá)差異顯著。

為了探究BCCIP在胃癌中表達(dá)的潛在作用，我們進(jìn)一步分析了胃癌中BCCIP的表達(dá)與臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)胃癌中BCCIP的表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)；與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki67、突變型P53的表達(dá)負(fù)相關(guān)；與腫瘤分化程度正相關(guān)。本研究結(jié)果與lin Z等人在肝細(xì)胞癌中的研究結(jié)果相似，BCCIP在肝細(xì)胞癌(HCC)中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與HCC多種臨床病理因素呈負(fù)相關(guān)，包括腫瘤分級(jí)，腫瘤分期和Ki67的表達(dá)[4]。這提示BCCIP可能成為胃癌預(yù)后良好的指標(biāo)之一。

Ki-67是癌癥的重要預(yù)后標(biāo)志物，其增殖指數(shù)超過10%-14%表示高危預(yù)后類別[6]。為此我們分析了Ki67在胃癌中的表達(dá)，并分析其與BCCIP在胃癌中的相關(guān)性。我們的研究顯示，胃癌中Ki67的表達(dá)與患者年齡、性別及腫瘤分期無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)；與腫瘤分化程度及BCCIP的表達(dá)負(fù)相關(guān)。這一研究結(jié)果與Liu G等人研究相似，即Ki67在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、TNM分期及患者預(yù)后不良有關(guān)[7]。并且在我們的研究中還發(fā)現(xiàn)胃癌中BCCIP的表達(dá)與Ki67呈負(fù)相關(guān)，然而，這與Chen L等人在食管鱗癌(ESCC)中的研究結(jié)果相反，他們發(fā)現(xiàn)BCCIP在食管鱗狀細(xì)胞中表達(dá)升高，并與Ki67呈正相關(guān)，同時(shí)與腫瘤分級(jí)、腫瘤侵襲性顯著相關(guān)，表明了BCCIP也是一種致癌基因，并與ESCC不良預(yù)后有關(guān)[3]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明BCCIP與胃癌的臨床指標(biāo)之間具有一定的相關(guān)性，有望成為一種為臨床判斷胃癌預(yù)后的新型標(biāo)記物，但目前仍需更多的前瞻性臨床實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證BCCIP的表達(dá)異常對(duì)評(píng)估胃癌預(yù)后的意義。